目的:探讨亚砷酸钠（NaAsO 2）通过活性氧（ROS）蓄积及线粒体损伤诱导人肝细胞L-02凋亡的作用，为砷中毒的作用机制研究提供实验依据。 方法:体外培养L-02细胞，分为对照组、NaAsO 2组（10 μmol/L NaAsO 2）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）组（5 mmol/L NAC）、NaAsO 2 + NAC组（10 μmol/L NaAsO 2、5 mmol/L NAC），培养24 h。分别用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法、JC-1染色法、硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染法检测细胞内ROS水平、线粒体膜电位去极化比例和细胞凋亡率；用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）、细胞色素C蛋白（Cyt-C）、线粒体DNA编码的细胞色素C氧化酶Ⅳ（COXⅣ）mRNA、蛋白表达水平。 结果:各组间细胞内ROS水平（3 857 392.33 ± 44 928.39、4 515 288.00 ± 32 660.64、3 670 150.67 ± 101 987.69、4 035 235.67 ± 99 995.30），线粒体膜电位去极化比例（2.16 ± 0.54、7.95 ± 0.52、2.70 ± 0.29、1.01 ± 0.23），细胞总凋亡率（1.45 ± 0.03、4.27 ± 0.17、1.87 ± 0.12、2.52 ± 0.35）比较差异有统计学意义（ F = 62.62、159.81、112.70， P均< 0.05）；各组间Caspase3、Cyt-C、COXⅣ mRNA表达水平比较差异有统计学意义（ F = 9.20、7.33、14.87， P均< 0.05）；各组间活化Caspase3（cleaved-Caspase3）、Cyt-C、COXⅣ蛋白表达水平比较差异有统计学意义（ F = 31.42、8.01、83.30， P均< 0.05）。与对照组比较，NaAsO 2组L-02细胞内ROS水平、线粒体膜电位去极化比例、细胞总凋亡率明显增高（ P均< 0.05）；Caspase3、Cyt-C mRNA和cleaved-Caspase3、Cyt-C蛋白表达水平明显增高（ P均< 0.05），COXⅣ mRNA和蛋白表达水平则显著降低（ P均< 0.05）。与NaAsO 2组比较，NaAsO 2 + NAC组细胞内ROS水平、线粒体膜电位去极化比例、细胞总凋亡率明显下降（ P均< 0.05）；Caspase3 mRNA和cleaved-Caspase3蛋白表达水平明显降低（ P均< 0.05），Cyt-C mRNA和蛋白表达水平明显降低（ P均< 0.05），COXⅣ mRNA和蛋白表达水平明显增高（ P均< 0.05）。 结论:NaAsO 2可刺激L-02细胞产生大量ROS，诱发线粒体去极化，引发线粒体损伤，使Cyt-C向线粒体外释放增加，激活线粒体凋亡途径Caspase3蛋白酶而引起L-02细胞发生凋亡，这有可能是砷致肝损伤的主要作用机制之一。

目的:探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的可能机制及线粒体自噬在其中的作用。方法:体外培养H9c2心肌细胞，按随机数字表法分为3组（每组3个复孔）：对照组（NC组）、缺氧/复氧组（H/R组）、缺氧/复氧+N-乙酰半胱氨酸组（H/R+NAC组）。NC组细胞正常培养，H/R组细胞进行缺氧4 h复氧4 h处理，H/R+NAC组细胞进行缺氧4 h复氧4 h的同时给予终浓度为1.5 mmol/L的NAC。细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞活性，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）水平，2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）水平，5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）法检测线粒体膜电位水平，免疫印迹法（Western blot）检测线粒体自噬分子蛋白P62、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、磷酸酯酶与张力蛋白同源物诱导假定激酶1（PINK1）、帕金森病蛋白（Parkin）的蛋白水平，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果:与NC组比较：H/R组细胞存活率降低（ P<0.05），LDH和ROS水平升高（均 P<0.05），线粒体膜电位水平和P62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白水平降低（均 P<0.05），细胞凋亡率升高（ P<0.05）。与H/R组比较：H/R+NAC组细胞存活率升高（ P<0.05），LDH和ROS水平降低（均 P<0.05），线粒体膜电位水平和P62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白水平升高（均 P<0.05），细胞凋亡率降低（ P<0.05）。与NC组比较，H/R+NAC组细胞存活率，LDH、ROS、线粒体膜电位水平，P62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白水平和细胞凋亡率差异均无统计学意义（均 P>0.05）。 结论:NAC可以通过促进线粒体自噬水平从而减轻H/R对H9c2心肌细胞的损伤。

目的:探讨2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯(TPOL)对细胞凋亡的影响及其潜在机制.方法:在光照或非光照条件下用不同浓度的TPOL处理TPOL敏感的HEK293T细胞,或在TPOL处理前加入不同的抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、pifithrin-α和Z-DVED-FMK.CCK-8法测定细胞活力;膜联蛋白V/碘化丙啶染色定量凋亡细胞数;DCFH-DA染色结合流式细胞术测量活性氧(ROS)水平;JC-1染色评估线粒体膜电位;Western blot分析凋亡相关蛋白和细胞周期调节分子的表达.结果:TPOL以剂量依赖的方式增强HEK293T细胞的凋亡(P<0.05),与Bcl-2的减少、Bax和细胞色素C(Cyto C)的增加、激活的caspase-9和caspase-3的上调以及PARP的裂解有关(P<0.05).TPOL增强的caspase-3切割和PARP裂解可以被Z-DVED-FMK挽救(P<0.01).TPOL处理会导致细胞内ROS迅速增加、线粒体膜电位降低和Cyto C的释放(P<0.01),而ROS清除剂NAC可逆转这一现象(P<0.01).TPOL诱导的p21、p27、Rb和细胞周期蛋白依赖性激酶2的变化也可以被p53抑制剂pifithrin-α恢复(P<0.05).pifithrin-α预处理能不同程度恢复TPOL诱导的Bax、Bcl-2、切割的caspase-9、活化的caspase-3和裂解的PARP的变化(P<0.05).结论:TPOL可通过激活ROS依赖的p53/p21/p27/Rb/Bax/Cyto C/caspase信号诱导细胞凋亡,伴随ROS介导的线粒体膜损伤.

目的 探究4～6岁阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)患儿肠道代谢产物特征及其临床价值.方法 前瞻性纳入31例4～6岁OSAHS患儿作为试验组,24例4～6岁健康儿童作为对照组,记录相关临床指标.收集粪便标本,通过液-质联用非靶向代谢组学检测所有代谢产物.结果 共检测出206种代谢产物,主要为氨基酸及其衍生物.试验组儿童肠道代谢产物整体构成与对照组差异有统计学意义(P<0.05).共筛选出18种差异代谢产物,6种代谢产物(N-乙酰蛋氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、DL-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-异亮氨酸)用于诊断OSAHS的受试者操作特征曲线下面积大于0.7.其中N-乙酰蛋氨酸曲线下面积最大,为0.807,灵敏度为70.83%,特异度为80.65%.差异代谢产物与临床指标相关性分析显示,扁桃体肿大程度与肠内酯,尿酸与苯乙醛,血糖与N-乙酰蛋氨酸,胆固醇与9-六溴二苯醚和普鲁卡因呈正相关(P<0.05);扁桃体肿大程度与N-甲基酪胺,AST与吲哚丙烯酸和L-异亮氨酸,ALT与DL-苯丙氨酸、吲哚丙烯酸和L-异亮氨酸,尿酸与羟喹啉,尿素氮与N,N-二环己脲呈负相关(P<0.05).差异代谢产物影响的代谢功能通路主要有核黄素代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、赖氨酸降解和谷胱甘肽代谢等.结论 4～6岁OSAHS患儿肠道代谢产物与代谢功能发生改变,主要为氨基酸代谢紊乱,筛选出的肠道差异代谢产物作为OSAHS生物标志物具有潜在的筛查诊断价值.

目的 观察Adropin对低氧诱导的SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及氧化应激的影响,并探讨其可能机制.方法 以1％的O2作为诱导剂,建立PASMCs增殖及氧化应激的细胞模型,通过活性氧(ROS)激活剂H2O2,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及不同浓度Adropin(100、300、1000 nmol·L-1)干预24 h后,检测细胞增殖及ROS,筛选Adropin抑制增殖及氧化应激的最适浓度.选择1000 nmol·L-1 Adropin和/或核因子E2相关因子2(Nfr2)抑制剂ML385在低氧条件下孵育PASMCs 24 h,并设置Nrf2激活剂富马酸二甲酯(DMF)作为阳性对照组,通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖;DCFH-DA探针联合荧光酶标仪测定细胞内ROS的水平;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)的水平;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测Nrf2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E的表达.结果 与对照组相比较,H2O2及低氧均能够诱导PASMCs增殖及ROS生成,而不同浓度的Adropin(100、300、1000 nmol·L-1)和NAC均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖及ROS产生,且Adropin抑制增殖及ROS产生具有浓度依赖性.与低氧组相比较,DMF或Adropin(1000 nmol·L-1)干预后,PASMCs增殖及细胞内ROS水平下降,SOD、GPx、CAT活性增加,MDA水平下降,Nrf2表达上调(P＜0.05),而ML385能够逆转Adropin的上述作用(P＜0.05);DMF或Adropin能够通过抑制Cyclin D1与Cyclin E的表达,阻滞细胞周期于G0/G1期,从而抑制PASMCs增殖(P＜0.05),而ML385能够逆转Adropin上述作用(P＜0.05).结论 Adropin可通过抑制氧化应激抑制低氧诱导的PASMCs增殖,其机制可能与激活Nrf2有关.

目的 探讨磷酸三(1,3-二氣-2-丙基)酯[tri(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate,TDCIPP]暴露对小鼠睾丸支持细胞(TM4细胞)的毒性作用及其潜在作用机制.方法 分别用不同浓度的TDCIPP(0、12.5、25和50 μmol/L)以及50 μmol/L TDCIPP联合抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)处理TM4细胞24 h,CCK8法检测细胞活力,DCFH-DA探针法检测细胞内ROS水平,Western blot法检测细胞内氧死亡通路相关蛋白如KEAP1、PGAM5、AIFM1和磷酸化AIFM1(p-AIFM1)蛋白质水平.结果 TDCIPP以剂量依赖方式降低了 TM4细胞活力(P＜0.05);12.5、25 和 50 μmol/L TDCIPP 染毒组 TM4 细胞 ROS 水平分别为 9.44±1.42、17.25± 1.81 和 18.38±2.66,显著高于对照组的 5.08±0.90(P＜0.05);5 mmol/L NAC+50μmol/L TDCIPP组TM4细胞ROS水平为14.70±0.50,显著低于TDCIPP组的26.44±0.73(P＜0.05).KEAP1 siRNA+TDCIPP 组和 PGAM5siRNA+TDCIPP 组的TM4细胞活力分别为77.00±1.73和76.67±1.53,显著高于TDCIPP组的68.67±1.53(P＜0.05).25和50 pmol/L TDCIPP染毒组TM4细胞的KEAP1蛋白相对表达量分别为0.77±0.04和0.82±0.02,显著高于对照组的0.57±0.01(P＜0.05);TDCIPP染毒组TM4细胞PGAM5蛋白相对表达量分别为1.17±0.04、1.38±0.03和1.41±0.03,显著高于对照组的0.81±0.02(P＜0.05);AIFM1蛋白相对表达量分别为0.42±0.01、0.63±0.01 和 0.68±0.02,显著高于对照组的 0.34±0.02(P＜0.05);p-AIFM1蛋白相对表达量分别为1.73±0.02、1.52±0.02和0.73±0.01,显著低于对照组的 2.25±0.02(P＜0.05).5 mmol/L NAC+50 μmol/L TDCIPP 组 TM4 细胞的KEAP1、PGAM5 和 AIFM1 蛋白相对表达量分别为 0.61±0.01、0.58±0.01 和 0.48± 0.03,显著低于 TDCIPP 组的 0.86±0.12(P＜0.05)、0.74±0.02(P＜0.05)和 0.92± 0.01(P＜0.05);p-AIFM1蛋白相对表达量为0.45±0.11,显著高于TDCIPP组的0.23±0.01(P＜0.05).结论 TDCIPP诱导TM4细胞活力降低可能与ROS介导的KEAP1/PGAM5/AIFM1通路调控细胞发生氧死亡有关.

目的:验证新型细胞调节性死亡Parthanatos在子痫前期(PE)胎盘中的发生情况,探讨抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸乙酯(NACET)对PE滋养细胞的保护作用.方法:胎盘样本选自行剖宫产手术的PE患者15例(PE组)和正常妊娠分娩的产妇15例(NP组),利用蛋白质免疫印迹(West-em blot)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫荧光、透射电镜评估PE患者胎盘中Parthanatos的发生情况.通过细胞计数8(CCK8)、Western blot、免疫荧光、荧光探针分别验证二甲基胭(MNNG)及NACET(分别为对照组、MNNG处理组、MNNG+NACET处理组)对HTR8/Sveno细胞Parthanatos的诱导和抑制作用.结果:①与NP组胎盘相比,PE组胎盘多聚腺苷二磷酸(ADP)核糖基聚合酶1(PARP1)mRNA及蛋白的表达增高,多聚ADP核糖(PAR)累积增多,线粒体受损严重,凋亡诱导因子(AIFM1)核定位增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).②与对照组相比,MNNG处理组表现为可以引起HTR8/Sveno细胞PARP1蛋白的表达增高,PAR累积增多,细胞内活性氧增多,线粒体膜电位下降,AIFM1核定位增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).③与MNNG处理组相比,MNNG+NACET处理组中5 μmol/L的NACET能够显著提高细胞的存活率;伴随PARP1蛋白表达降低和PAR蛋白累积减少、细胞内活性氧水平降低、细胞核内AIFM1蛋白表达量降低、线粒体膜电位升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:PE胎盘中Parthanatos水平显著升高,MNNG可显著诱导HTR8/Sveno细胞发生PARP1依赖性的细胞调节性死亡,而NACET能够有效抑制MNNG诱导的滋养细胞Parthanatos的发生,有望成为PE临床治疗的新靶点.

目的:探讨黄芩素对人舌鳞状细胞癌(简称舌鳞癌)CAL27细胞增殖的影响,阐明其潜在的作用机制.方法:将对数生长期CAL27细胞分为对照组和不同浓度(12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 μmol·L-1)黄芩素组,采用结晶紫染色法观察各组细胞克隆形成情况,CCK-8法检测各组细胞增殖率,2',7'-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测各组细胞中活性氧(ROS)水平,罗丹明123(Rhodamine123)荧光探针检测各组细胞线粒体膜电位(MMP)水平.对数生长期CAL27细胞分为对照组和不同浓度(50、100和200 μmol·L-1)黄芩素组,采用流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率和细胞凋亡率.对数生长期 CAL27 细胞分为对照组、不同浓度(50和100 μmol·L-1)黄芩素组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组、50 μmol·L-1黄芩素+NAC组和100 μmol·L-1黄芩素+NAC组,采用DCFH-DA荧光探针和Rhodamine123荧光探针分别检测黄芩素与NAC联合作用后各组细胞中ROS和MMP水平.结果:结晶紫染色,与对照组比较,不同浓度黄芩素组细胞克隆形成数呈浓度依赖性减少,200 μmol·L-1黄芩素组细胞几乎无克隆形成.CCK-8法检测,与对照组比较,不同浓度黄芩素组细胞增殖率明显降低(P<0.05或P<0.01),且呈浓度依赖性.与对照组比较,不同浓度黄芩素组细胞中ROS水平明显升高(P<0.05),MMP水平明显降低(P<0.05).与对照组比较,不同浓度黄芩素组细胞中S期细胞百分率明显升高(P<0.05),G0/G1期细胞百分率明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).黄芩素与NAC联合作用后,与对照组比较,50和100 μmol·L-1黄芩素组细胞中ROS水平明显升高(P<0.05),MMP水平明显降低(P<0.05);分别与 50 和 100 μmol·L-1 黄芩素组比较,50 μmol·L-1 黄芩素+NAC组和 100 μmol·L-1 黄芩素+NAC组细胞中ROS水平明显降低(P<0.05),MMP水平明显升高(P<0.05).结论:黄芩素可以通过激活线粒体氧化应激通路抑制CAL27细胞增殖.

目的 通过建立单硝酸异山梨醇酯(ISMN)耐药动物模型,观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对预防硝酸酯耐药的实验效果,分析相关机制.方法 取成年雄性新西兰大白兔32只,体质量(2500± 200)g,随机分为对照组、常规组、耐药组和NAC组,每组8只.对照组不予用药;常规组经胃管灌服ISMN 25 mg,1/d;耐药组灌服ISMN 25 mg,1/12 h;NAC组同时灌服ISMN 25 mg和NAC 100 mg,1/12 h.7 d后处死所有实验兔,取腹主动脉,每5 mm剪为数段,分别检测血管环舒张反应以及血管组织总巯基(T-SH,微量酶标法)、超氧阴离子(O2-,化学比色法)、超氧化物歧化酶(SOD,黄嘌呤氧化酶法)、丙二醛(MDA,硫代巴比妥酸法)、内皮素-1(ET-1,双抗体夹心法)和亚硝酸盐(NO2-,硝酸还原酶法)水平.结果 随着硝酸甘油(GTN)浓度的递增,各组腹主动脉血管环的舒张幅度都呈现不同程度的增加.耐药组血管环的舒张幅度均明显小于其他3组,差异有统计学意义(P均<0.01);而对照组、常规组和NAC组之间的差异无统计学意义(P均>0.05).当GTN浓度增至10-4mol/L时,对照组、常规组和NAC组的舒张幅度分别达到(98.91±1.99)%、(95.59±3.97)%和(93.18±6.36)%;而耐药组仅达到(63.62±6.03)%,明显低于其他3组.T-SH含量和SOD活力由高到低依次为对照组、NAC组、常规组和耐药组,差异均有统计学意义(P均<0.05);与之相反,O2-、MDA、ET-1和NO2-含量由高到低则依次为耐药组、常规组、NAC组和对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05).结论 口服NAC可通过增加血管组织的巯基含量、抑制ISMN诱发的氧化应激和缩血管物质的生成来预防硝酸酯的耐药性,进而充分发挥其扩血管效应.

目的 探讨巯基供体N-乙酰半胱氨酸(NAC)对动脉粥样硬化模型兔硝酸酯耐药的影响及相关机制.方法 选择40只雄性新西兰大白兔,随机分为正常组、模型组(AS组)、硝酸酯组(ISMN组)、硝酸酯耐药组(NT组)和用药组(NT+NAC组),各8只.除正常组,其他各组通过球囊内皮剥脱联合高脂饮食建立腹主动脉粥样硬化模型.高脂饲料饲养8周后,ISMN组灌胃给予ISMN 25 mg,1/24 h;NT组灌胃ISMN 25 mg,1/12 h;NT+NAC组则同时灌胃ISMN 25 mg和NAC 100 mg,1/12 h;AS组和正常组不予干预.用药7 d后,取腹主动脉,分别进行病理学观察、血管环舒张反应检测以及血管总巯基(T-SH)、超氧阴离子(·O2-)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、内皮素-1(ET-1)和亚硝酸盐(NO2-)测定.结果 各建模组HE染色后,均可见内膜不同程度的增厚,大量泡沫细胞、平滑肌细胞和脂质沉积.各组血管环的舒张幅度均随硝酸甘油(NTG)浓度的增加而递增.当NTG为10-9 mol/L时,NT组血管舒张幅度则显著低于其余四组,差异有统计学意义(P均<0.05).当NTG浓度为10-8～10-4mol/L时,与正常组比较,AS组、ISMN组、NT组以及NT+NAC组血管舒张幅度均降低,差异有统计学意义(P均<0.05);NT组血管舒张幅度则显著低于其余四组,差异均有统计学意义(P均<0.05).T-SH含量由高至低依次为正常组、AS组、NT+NAC组、ISMN组以及NT组,各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05).·O2-、MDA、ET-1和NO2-含量:正常组、AS组、NT+NAC组、ISMN组、NT组呈升高趋势,除正常组与AS组外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05).NT组SOD含量低于正常组,且NT+NAC组SOD含量高于NT组,差异均有统计学意义(P均<0.05).结论 口服N-乙酰半胱氨酸可通过补充巯基、抑制氧化应激来改善动脉粥样硬化兔硝酸酯耐药的效应.