目的:探讨结核抗原Ag85作用于巨噬细胞后对霍奇金淋巴瘤细胞增殖、凋亡的影响，以及结核感染在霍奇金淋巴瘤进展中的可能作用。方法:采用Transwell嵌套法建立霍奇金淋巴瘤细胞株KM-H2与人单核细胞白血病细胞株THP-1（模拟巨噬细胞）非直接接触共培养体系。KM-H2细胞单独培养为KM-H2组，Ag85干预的KM-H2细胞为KM-H2+Ag85组，KM-H2细胞与THP-1细胞共培养为KM-H2+THP-1组，Ag85干预的KM-H2细胞与THP-1细胞共培养为KM-H2+THP-1+Ag85组。采用CCK-8法检测各组KM-H2细胞的增殖情况，绘制生长曲线；采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况；采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞p53、c-myc、bcl-2、血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）mRNA表达水平；采用蛋白质印迹法检测各组细胞bax、bcl-2蛋白的表达。结果:培养24、48 h后KM-H2+Ag85组细胞增殖能力均高于KM-H2组（均 P=0.001），而培养24、48、72 h后KM-H2+THP-1组细胞增殖能力均低于KM-H2组（均 P<0.05）；培养48、72 h后KM-H2+THP-1+Ag85组细胞增殖能力均低于KM-H2组（均 P<0.05），但与KM-H2+THP-1组相比，培养24、48 h后KM-H2+THP-1+Ag85组细胞增殖能力均增强，培养72h后两组间差异无统计学意义（ P>0.05）。KM-H2+Ag85组细胞凋亡率[（0.92±0.80）%]低于KM-H2组[（6.02±1.63）%]（ P<0.001），KM-H2+THP-1组细胞凋亡率[（8.57±0.57）%]高于KM-H2组（ P<0.05），而KM-H2+THP-1+Ag85组细胞凋亡率[（0.60±0.13）%]较KM-H2+THP-1组降低（ P<0.001）。KM-H2+Ag85组细胞bcl-2、VEGFR3 mRNA相对表达量均高于KM-H2组（ P值分别为0.018、0.017），c-myc mRNA相对表达量低于KM-H2组（ P=0.016），两组间p53 mRNA相对表达量差异无统计学意义（ P>0.05）；KM-H2+THP-1+Ag85组细胞p53 mRNA相对表达量低于KM-H2+THP-1组（ P=0.048），bcl-2、VEGFR3 mRNA相对表达量均高于KM-H2+THP-1组（ P值分别为0.016、0.021）。KM-H2+Ag85组细胞bax蛋白表达较KM-H2组降低（ P=0.019），bcl-2蛋白表达较KM-H2组增加（ P=0.001）；KM-H2+THP-1+Ag85组细胞bax蛋白表达较KM-H2+THP-1组降低（ P=0.011），两组间bcl-2蛋白表达差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:结核抗原Ag85可能通过影响巨噬细胞功能而抑制霍奇金淋巴瘤KM-H2细胞的凋亡，并增强其增殖活性。

目的:构建小鼠胰腺癌原发灶和肝转移灶成对类器官培养体系，探讨其形态学及生物学行为。方法:取6~8周龄C57BL/6小鼠，将携带荧光素酶的胰腺癌细胞PANC02注射入胰腺体尾部，待小动物活体成像仪监测到肝转移灶形成后处死小鼠，取出成对的胰腺癌原发灶和肝转移灶于体外类器官培养体系中培养。倒置相差显微镜下观察类器官的形成过程，苏木精-伊红染色观察类器官的形态结构；免疫组织化学和免疫荧光染色法检测类器官上皮细胞标志物CK19和增殖标志物Ki67蛋白的表达；蛋白质免疫印迹法和免疫组织化学检测类器官侵袭性标志物N-cadherin、E-cadherin、vimentin、snail、MMP9的表达；CellTiter-Glo ?3D Cell Viability Assay检测类器官对吉西他滨的药物敏感性，计算类器官的50%抑制浓度（IC 50）。 结果:成功构建了小鼠胰腺癌自发肝转移模型，并建立了胰腺癌原发灶和肝转移灶成对类器官培养体系。类器官呈球样生长，体外可连续传代达10代。肝转移灶类器官和胰腺癌原发灶类器官均呈管腔样结构，均表达上皮细胞标志物CK19和增殖标志物Ki67，且肝转移灶Ki67的阳性比例显著高于胰腺癌原发灶。肝转移性类器官侵袭性标志物N-cadherin、vimentin、snail、MMP9的表达水平显著高于胰腺癌原发灶类器官，而E-cadherin表达水平则显著低于胰腺癌原发灶类器官。肝转移灶类器官对吉西他滨的IC 50值为165.0 nM，高于胰腺癌原发灶类器官的108.5 nM。 结论:成功建立了可以稳定传代的小鼠胰腺癌原发灶和肝转移性类器官。

目的:探讨柚皮素（NGN）对创伤性脊髓损伤后运动功能修复的作用及其机制。方法:选取36只6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠，按照随机数字表法分为假手术组、生理盐水组和NGN组，每组12只。假手术组小鼠仅行椎板切除术，不损伤脊髓；生理盐水组和NGN组小鼠利用钳夹法进行脊髓损伤手术。3组小鼠均从术前3 d开始每天灌胃给药（假手术组和生理盐水组小鼠给予生理盐水灌胃，NGN组小鼠给予50 mg/kg NGN灌胃给药），手术当天不给药，术后第1天恢复灌胃给药，1次/d，持续7 d，之后隔天灌胃给药，持续28 d。采用BMS评分法评估小鼠运动功能的恢复情况。冰冻切片行HE和尼式染色评估脊髓组织学改变。Western blotting和免疫荧光染色实验检测组织自噬蛋白的表达水平。体外培养小鼠小胶质细胞BV2，分为NGN组（NGN处理）与对照组（空白溶剂处理），采用CCK-8法检测细胞活性，利用腺病毒荧光示踪体系评估自噬流情况。与神经元细胞N2a建立共培养体系后，采用CCK-8法检测细胞活性，采用细胞划痕实验检测细胞迁移愈合能力。结果:给予同等护理条件及康复活动下，损伤后第14、21、28天，NGN组小鼠BMS评分明显优于生理盐水组小鼠（ P<0.05）。NGN可改善脊髓损伤后神经元数量和形态，并减少损伤组织中LC3B和p62的蓄积（ P<0.05或 P<0.001）。体外实验表明NGN呈剂量依赖性（6.25、12.5、25、50 mmol/L）增加BV2细胞活性（ P<0.01），同时促进BV2细胞自噬发生和自噬溶酶体形成。细胞共培养条件下，NGN组BV2细胞可明显提高N2a细胞活性（ P<0.05）并促进细胞迁移（ P<0.01）。 结论:NGN可促进脊髓损伤后运动功能修复，其可能的机制是NGN通过提高小胶质细胞的自噬作用，促进神经元修复。

目的:构建具有损伤再生能力的新型小肠类器官，体外模拟肠道损伤、再生和修复过程。方法:分离6～8周龄、18～24 g无特定病原体动物级C57BL/6小鼠回肠黏膜隐窝结构，设计ENR、ENR＋肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和8C培养体系，分别构建肠道稳态、炎症损伤和损伤再生条件下的小肠类器官并观察形态。通过免疫荧光染色检测类器官包含的细胞类型和空间排布，以及损伤再生基因凝集素蛋白( Clu)、膜联蛋白A1( Anxa1)、干细胞抗原1( Sca1)和小鼠再生胰岛衍生蛋白3β( Reg3 b)的蛋白质表达情况。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测 Clu、 Anxa1、 Sca1、 Reg3 b的mRNA表达情况。统计学方法采用独立样本 t检验。 结果:8C和ENR培养体系下的小肠类器官均包含肠道干细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠道内分泌细胞，细胞空间排布与肠上皮基本一致。8C培养体系下的新型小肠类器官的扩增能力较ENR、ENR＋TNF-α培养体系下的小肠类器官明显增强，生长速度更快，结构更大、更复杂。qRT-PCR结果显示，8C培养体系下的新型小肠类器官再生基因 Clu、 Anxa1和 Sca1的mRNA相对表达水平均高于ENR和ENR＋TNF-α培养体系(0.68±0.31比0.20±0.07、0.36±0.19，0.48±0.13比0.07±0.02、0.18±0.11，0.56±0.20比0.02±0.01、0.08±0.04)，差异均有统计学意义( t＝4.82、2.77，8.62、4.89，8.58、7.50；均 P<0.05)。免疫荧光检测显示，8C培养体系下的新型小肠类器官再生基因 Clu、 Anxa1、 Sca1和 Reg3 b的蛋白质表达水平均高于ENR、ENR＋TNF-α培养体系(31.62±1.69比9.73±2.39、15.11±2.16，42.65±1.85比19.70±1.18、24.97±2.82，63.80±2.73比37.10±1.59、43.27±2.53，53.26±1.84比27.75±3.78、33.16±3.50)，差异均有统计学意义( t＝12.95、10.41，18.13、9.09，14.63、9.56，10.51、8.80；均 P<0.001)。 结论:新型培养体系下建立的小肠类器官具备损伤再生特征，为研究上皮组织器官再生提供了新的体外模型。

目的:建立正常小鼠胰腺导管类器官培养体系，初步探讨胰腺导管类器官的形态学及生理功能。方法:取6~8周龄C57BL/6小鼠胰腺组织，应用胶原酶Ⅳ消化分离并收集胰腺导管，用基质胶包埋后于完全培养基中培养，采用苏木精-伊红染色后观察胰腺导管类器官的形态结构；蛋白质免疫印迹法及免疫荧光染色法鉴定类器官的标志物表达及定位；琼脂糖凝胶电泳及免疫荧光染色法检测类器官离子通道和抗菌肽的表达及定位。结果:成功建立了可以稳定传代10代的小鼠胰腺导管类器官，类器官呈球样生长，形成管腔样结构，内部的空腔与胰腺导管组织的管腔相对应。胰腺导管类器官稳定表达祖细胞标志物SOX9及导管上皮细胞标志物KRT19，均定位于上皮细胞，不表达淀粉酶；稳定表达正常胰腺导管上皮细胞离子通道Clcn1、Kcnma1、CFTR、Slc12a5、Slc26a3、Slc26a6及Scnn1a，低表达Ano1，不表达Clcn3、Kcna1、Kcna2、Kcnd3、Kcnh1、Atp12a、Slc4a4、Slc9a1、Slc12a2及Slc26a11，其中CFTR在上皮细胞中高度表达；高表达抗菌肽Reg3a、CRAMP及糖蛋白2，低表达Defb1、Defb2及Defb3，不表达Defa1及Defa4，其中Reg3a及CRAMP均在上皮细胞内表达，且分泌至类器官的管腔内。结论:成功建立可以稳定传代的小鼠胰腺导管类器官，它能维持正常胰腺导管上皮细胞的诸多特征，可以作为研究胰腺导管上皮细胞生理学的体外模型。

目的:探讨RMT1-10体外诱导耐受性树突状细胞(Tol-DCs)对小鼠高危角膜移植排斥反应的抑制作用及其机制。方法:选取SPF级雄性BALB/c小鼠100只和C57BL/6小鼠50只，获取C57BL/6小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(imDCs)，按照诱导干预不同分为imDCs组(不干预)、成熟树突状细胞(mDCs)组(加入脂多糖)、RMT1-10组(加入RMT1-10和脂多糖)和IgG同型对照组(加入IgG同型抗体和脂多糖)，培养7 d后采用流式细胞术检测各组DCs表型CD11c、CD80、CD86、主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子(Tim)-4和CD103表达水平；采用酶联免疫吸附法测定细胞培养液上清液中白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)质量浓度。建立混合淋巴细胞培养体系，采用细胞计数试剂盒8法检测各组DCs刺激CD4 + T细胞增生的刺激指数(SI)。以角膜基质缝线法诱导BALB/c小鼠角膜新生血管，以4个象限新生血管均匀长入角膜中周区的小鼠作为受体。将80只受体小鼠采用随机数字表法随机分为imDCs组、mDCs组、RMT1-10组和IgG同型对照组，每组20只，各组分别于尾静脉注射相应DCs(1×10 6个/100 μl)。注射后7 d，以C57BL/6小鼠为供体行穿透角膜移植术。术后1个月，每日裂隙灯显微镜下观察受体小鼠角膜植片排斥体征，包括角膜混浊、水肿及新生血管。术后21 d，每组抽取5只受体小鼠，耳廓皮下注射20 μl(1×10 6个细胞)正常C57BL/6小鼠脾脏细胞，24 h后测量耳廓肿胀度评价迟发型超敏反应(DTH)。 结果:RMT1-10组DCs中CD80、CD86、MHC-Ⅱ和Tim-4阳性细胞占CD11c阳性细胞百分比均明显低于mDCs组，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；RMT1-10组Tim-4阳性细胞百分比明显低于imDCs组，CD103阳性细胞百分比明显高于其他3个组，差异均有统计学意义(均 P<0.001)。RMT1-10组细胞培养上清液中IL-10和TGF-β质量浓度明显高于其他组，差异均有统计学意义(均 P<0.001)。各组DCs对CD4 + T细胞增生的SI总体比较，差异均有统计学意义( F分组＝1 833.00， P<0.001； F比例＝230.40， P<0.001)。在每一细胞比例内，imDCs组SI均明显低于mDCs组，RMT1-10组SI均明显低于imDCs组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。各组角膜植片生存曲线总体差异有统计学意义( χ2＝77.69， P<0.001)，其中RMT1-10组角膜植片存活数量明显多于imDCs组，imDCs组角膜植片存活数量明显多于mDCs组，差异均有统计学意义( χ2＝9.74、31.02，均 P<0.01)。阳性对照组、mDCs组、IgG同型对照组、imDCs组、RMT1-10组和阴性对照组小鼠耳廓肿胀度分别为(503.6±17.2)、(475.7±17.6)、(456.2±18.8)、(225.2±39.4)、(118.1±12.6)和(106.4±7.4)μm，总体比较差异有统计学意义( F＝377.10， P<0.001)，其中mDCs组小鼠耳廓肿胀度略低于阳性对照组，imDCs组小鼠耳廓肿胀度明显低于IgG同型对照组，明显高于RMT1-10组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:RMT1-10可抑制小鼠高危角膜移植排斥反应，其作用机制可能为体外诱导imDCs转化为Tol-DCs并上调TGF-β和IL-10表达，经过继转移后促进受体抗原特异性免疫耐受，进而间接延长角膜植片存活时间。

目的:探究肺泡表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)能否通过调控滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell，Tfh)的分化参与调节哮喘病理过程。方法:6～8周的雌性野生型(wild-type，WT)及SP-A基因敲除( Sp- a-/-)型C57BL/6J小鼠，利用鸡卵白蛋白(ovalbumin，OVA)和氢氧化铝免疫构建哮喘模型(WT哮喘小鼠：8只， Sp- a-/-哮喘小鼠：8只)，并分别设立磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)处理的对照组(WT对照小鼠：6只， Sp- a-/-对照小鼠：4只)。HE染色观察小鼠肺部病理改变，流式细胞术检测脾脏和纵隔淋巴结中Tfh细胞及其亚群的组成，Tfh亚群根据其胞内干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素(interleukin，IL)-17和IL-4的表达情况，分别定义为IFN-γ ＋Tfh、IL-17 ＋Tfh和IL-4 ＋Tfh细胞。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)用于检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)E的水平。将T-B细胞共培养，检测培养体系中IgE抗体的水平。在体外，给予人肺泡表面活性蛋白A(human SP-A，hSP-A)处理并设立对照组，培养5 d后检测体系中Tfh亚群的分布情况。 结果:OVA激发后小鼠BALF中和肺组织内有大量炎症细胞浸润，WT及 Sp- a-/-哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数显著高于其相对应对照组小鼠[(11.38±1.43)×10 4比(6.40±0.68)×10 4，(14.38±1.52)×10 4比(6.25±0.48)×10 4， t值分别为2.61和3.64， P值均<0.05]，差异具有统计学意义。另外，OVA激发后，WT和 Sp- a-/-哮喘小鼠BALF中IgE的水平明显高于其相应的对照组小鼠[(16.85±2.50)pg/mL比(4.94±2.01)pg/mL，(25.52±3.17)pg/mL比(8.05±2.90)pg/mL， t值分别为3.63和3.58， P值均<0.05)]，且 Sp- a-/-哮喘小鼠BALF中IgE抗体的水平明显高于WT哮喘小鼠( t＝2.20， P<0.05)，差异具有统计学意义。进一步研究显示，Tfh亚群组成在哮喘模型的WT和 Sp- a-/-小鼠中存在不同，表现为 Sp- a-/-哮喘小鼠IL-4 ＋Tfh细胞比例高于WT哮喘小鼠，IFN-γ ＋Tfh细胞比例降低，但差异并不具有统计学意义( P>0.05)。Tfh细胞的亚群组成发生变化，其中IL-4 ＋Tfh比例与肺泡灌洗液中IgE水平呈正相关( r＝0.50， P<0.05)，而IFN-γ ＋Tfh比例与肺泡灌洗液中IgE水平呈负相关( r＝-0.56， P<0.05)。脾脏中IFN-γ ＋Tfh/IL-4 ＋Tfh的比值在 Sp- a-/-哮喘小鼠中显著低于WT小鼠( t＝2.31， P<0.05)，且与肺泡灌洗液中IgE呈负相关( r＝-0.55， P<0.05)。T-B细胞共培养实验发现， Sp- a-/-小鼠脾脏来源Tfh细胞具有更强的辅助B细胞合成IgE抗体的能力( t＝3.18， P<0.05)。后续的体外T细胞刺激实验证实，hSP-A处理可以上调培养体系中IFN-γ ＋Tfh细胞比例与IFN-γ ＋Tfh/IL-4 ＋Tfh的比值( t值分别为6.34和3.16， P值均<0.05)，但并未明显改变IL-4 ＋Tfh细胞比例( P>0.05)。 结论:异常的Tfh细胞亚群分布与哮喘的发生相关，SP-A可能通过稳定Tfh细胞亚群的分布，从而缓解哮喘气道炎症反应。

目的:探讨胚胎早期发育动态表型和动力学参数是否受培养液组分差异的影响。方法:回顾性队列研究分析广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心2016年10月至2018年12月期间收治的体外受精（ in vitro fertilization，IVF）周期患者的临床资料，根据使用的培养液品牌不同，将IVF周期分为Cook组和Vitrolife组，经1∶1倾向性评分匹配后，每组纳入59个，采用延时成像技术分析正常受精卵裂胚胎授精后68 h内的早期发育形态动力学。记录胚胎发育动态表型，比较两组胚胎7种发育动态表型构成的差异；计算正常表型胚胎的13个早期发育动力学参数，比较两组之间动力学参数的差异；基于两个已发表的time-lapse胚胎筛选模型，比较两组正常动态表型胚胎的等级分布差异。 结果:①Cook组胚胎发育动态表型构成如下：正常表型54.0%、胞质异常波动（abnormal first cytokinesis，A1 cyt）3.0%、不规则卵裂（abnormal cleavage，AC）17.4%、逆向卵裂（reverse cleavage，RC）5.2%、无序卵裂（chaotic cleavage，CC）3.2%、多核（multinucleation，Mn）3.5%以及混合表型13.7%；Vitrolife组胚胎发育动态表型构成如下：正常表型49.3%、A1 cyt 4.0%、AC 19.1%、RC 7.5%、CC 2.1%、Mn 6.4%以及混合表型11.6%，两组间表型构成差异没有统计学意义（ P>0.05）。②相较于Vitrolife组，Cook组正常动态表型胚胎13个发育动力学参数（tPNa、tPNf、t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8、cc2、s2、t5_PNf和t8_PNf）均略长，授精后68 h胚胎平均卵裂球数略少，但差异均无统计学意义（均 P>0.05）。③基于模型A，Vitrolife组与Cook组胚胎等级分布差异没有统计学意义（ P>0.05）；基于模型B，两组胚胎等级分布差异存在统计学意义（ P=0.040），其中Vitrolife组A +级胚胎比例较Cook组高［59.8%（125/209）比43.3%（94/217）］，而C级胚胎比例较Cook组低［9.6%（20/209）比20.3%（44/217）］。 结论:胚胎早期发育动态表型及动力学参数不受Cook与Vitrolife序贯培养液差异的影响，但不同time-lapse胚胎筛选模型对不同培养液体系的适用性存在差异，选择或建立模型时应充分考虑所使用的胚胎培养液体系。

目的:研究小鼠腐皮镰刀菌性角膜炎中中性粒细胞来源的基质金属蛋白酶8(MMP-8)对角膜组织的损伤作用及其机制。方法:取108只6~8周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠，采用腐皮镰刀菌感染法制备右眼真菌性角膜炎(FK)模型，裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜炎症情况并评分，依据FK模型眼角膜炎症评分将模型眼分为造模后0、12、24、48和72 h组。于相应时间点处死小鼠并取材角膜组织，采用Western blot法检测MMP-8、腺苷酸激活蛋白激酶α(AMPKα)及其丝氨酸172位点磷酸化形式(p-AMPKα)蛋白在角膜中的相对表达量；采用苏木精－伊红染色法检测各时间点组小鼠角膜中中性粒细胞数量；采用免疫荧光染色法观察角膜中中性粒细胞与MMP-8蛋白的共定位表达。体外角膜胶原降解实验中将角膜组织分为MMP-8组、缓冲液组和生理盐水组，分别采用100 μl活化的重组MMP-8、检测缓冲液和生理盐水处理角膜，采用羟脯氨酸检测试剂盒测定并比较各组角膜组织中羟脯氨酸质量分数。分别提取人外周血中性粒细胞和采集培养的腐皮镰刀菌孢子，将人中性粒细胞分为4个组，其中阴性对照组为培养的中性粒细胞，共培养组为中性粒细胞加孢子共培养，AICAR处理组和化合物C处理组分别向中性粒细胞和孢子共培养体系内加入p-AMPK蛋白酶激动剂AICAR和抑制剂化合物C，采用免疫荧光染色法检测各组人中性粒细胞中MMP-8蛋白的表达水平。结果:造模后24 h组小鼠模型眼出现角膜混浊，造模后72 h组出现角膜穿孔。造模后24、48和72 h组角膜炎症评分均高于12 h组，差异均有统计学意义(均 P<0.001)。造模后12、24和48 h组角膜中MMP-8蛋白相对表达量高于0 h组，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；模型眼角膜中MMP-8蛋白相对表达量与炎症评分呈中等强度正相关( rs＝0.50， P<0.05)。造模后24、48和72 h组角膜内p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα值高于0 h组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；角膜中p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα值与MMP-8蛋白相对表达量呈中等强度正相关( r＝0.54， P<0.01)。造模后24、48和72 h组角膜中中性粒细胞数目明显多于0 h组，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；角膜中中性粒细胞数目与炎症评分呈强正相关( rs＝0.77， P<0.001)，与MMP-8蛋白相对表达量呈中等强度正相关( r＝0.56， P<0.05)。模型眼角膜中MMP-8蛋白表达与中性粒细胞高度共定位。缓冲液组、生理盐水组和MMP-8组角膜羟脯氨酸质量分数分别为(0.52±0.02)、(0.51±0.03)和(0.27±0.02)μg/mg，组间总体比较差异有统计学意义( F＝156.63， P<0.01)，其中MMP-8组角膜羟脯氨酸质量分数低于缓冲液组和生理盐水组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。培养的镰刀菌孢子感染人中性粒细胞实验中，AICAR处理组MMP-8表达荧光强度值明显高于阴性对照组和化合物C处理组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:小鼠真菌性角膜炎中性粒细胞分泌的MMP-8可降解角膜基质层胶原纤维，导致角膜混浊或穿孔。人中性粒细胞中MMP-8蛋白的表达水平变化可能与AMPK活化有关。

目的·探究叶酸循环代谢对髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)免疫抑制作用的调控机制.方法·在C57BL/6小鼠骨髓细胞的培养体系中加入细胞因子粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),体外诱导MDSCs.利用流式细胞仪检测诱导MDSCs的程序性死亡受体配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)表达水平和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生水平.采用磁珠分选出小鼠脾脏CD8+T细胞并用Celltrace violet或CFSE标记,再与MDSCs共培养,72 h后用流式细胞术检测CD8+T细胞增殖情况.通过实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测MDSCs中叶酸循环相关代谢酶的表达水平.采用叶酸循环代谢酶亚甲基四氢叶酸脱氢酶 2(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2)抑制剂DS18561882(DS18)和叶酸拮抗剂培美曲塞(Pemetrexed)处理MDSCs,并用流式分析检测MDSCs产生ROS和线粒体ROS的水平.将DS18或培美曲塞处理后的MDSCs与磁珠分选出来并用Celltrace violet或CFSE标记的CD8+T细胞共培养,72 h后用流式细胞术检测CD8+T细胞增殖情况.利用RNA测序(RNA-seq)检测DS18和培美曲塞处理后MDSCs在转录组水平的变化.建立小鼠结肠癌(mouse colon cancer cells,MC38)和Lewis 肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)皮下瘤模型.造模后第10天开始,采用Isotype抗体、抗CD8单抗(1 mg/kg,清除CD8+T细胞)、培美曲塞以及抗CD8单抗联合培美曲塞处理MC38荷瘤小鼠;利用Isotype抗体、抗Gr1单抗(1.25 mg/kg,清除MDSCs)、培美曲塞以及抗Gr1单抗联合培美曲塞处理MC38荷瘤小鼠;分别给予MC38和LLC荷瘤小鼠培美曲塞(50 mg/kg)、抗PD-1单克隆抗体(250 μg/kg)以及培美曲塞联用抗PD-1单克隆抗体治疗;第14天收集小鼠肿瘤组织,记录肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线.结果·流式结果显示诱导后的骨髓细胞PD-L1的表达升高,ROS的产生也增加,且明显抑制CD8+T细胞的增殖.qPCR结果显示MDSCs中叶酸循环相关代谢酶MTHFD2等表达升高.给予DS18和培美曲塞处理MDSCs会影响MDSCs的累积,抑制MDSCs的ROS产生,并解除对CD8 T细胞的免疫抑制.RNA-seq结果表明2种叶酸循环抑制剂处理后,与MDSCs分化相关基因S100钙结合蛋白a8(S100 calcium binding protein a8,S100a8)等下调,与MDSCs抑制功能相关基因如与ROS产生有关的基因细胞色素b-245β链(cytochrome b-245 beta chain,Cybb)等也有所下调.与对照组相比,培美曲塞处理组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制.与培美曲塞处理组相比,抗CD8单抗联合培美曲塞处理组肿瘤进展加剧;与抗CD8单抗处理组相比,抗CD8单抗联合培美曲塞处理组肿瘤进展受到限制.清除MDSCs能显著抑制肿瘤生长,然而在清除MDSCs的荷瘤小鼠中,培美曲塞的抗肿瘤作用显著低于培美曲塞单独处理的小鼠.与抗PD-1抗体单独治疗相比,培美曲塞联用抗PD-1抗体治疗组的肿瘤生长限制更为显著.结论·培美曲塞依赖CD8+T细胞发挥抗肿瘤作用,并通过重编程MDSCs为抗肿瘤表型,进一步阻碍肿瘤生长.通过调控MDSCs叶酸循环阻断其免疫抑制能力,可增强免疫检查点阻断剂治疗肿瘤效果.