目的:探讨SPAG6基因沉默和地西他滨在体内外对SKM-1细胞凋亡和PTEN启动子甲基化的作用。方法:慢病毒载体转染SKM-1细胞沉默SPAG6基因的表达，地西他滨处理细胞后CCK-8检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot和甲基化特异性PCR检测PTEN的蛋白表达和甲基化情况，并构建非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠异体移植瘤模型，TUNEL法观察肿瘤组织凋亡，免疫组化检测PTEN在组织中表达情况。结果:慢病毒转染后SPAG6干扰组SPAG6基因被成功沉默；CCK-8检测结果提示地西他滨处理能够降低SKM-1细胞的存活率，同时流式细胞术检测显示地西他滨处理组的细胞凋亡率[（17.35±3.37）%]高于未处理组[（5.09±2.06）%]，且SPAG6基因沉默联合地西他滨处理组的凋亡率最高[（36.34±4.00）%]；地西他滨处理后DNMT1的表达降低而PTEN表达升高，同时PTEN启动子甲基化程度降低，而经地西他滨处理后的SPAG6干扰组的PTEN去甲基化引起的蛋白表达升高效果最明显；NOD/SCID小鼠异体瘤移植模型中地西他滨组的肿瘤体积明显小于生理盐水组，而地西他滨处理SPAG6干扰组的小鼠肿瘤体积最小，且经TUNEL检测发现其凋亡程度最高（阳性比值为3.57±0.48）。结论:SPAG6基因沉默在SKM-1细胞中能增强地西他滨诱导的凋亡和PTEN去甲基化作用，并且在NOD/SCID异体瘤移植模型小鼠中能够增强地西他滨的抗肿瘤特性。

目的 研究septins基因家族成员SEPT12在人类精子发生过程的作用及其对精子运动力和精子超微结构的影响.方法 对收集的375例弱畸精子症患者外周血提取DNA进行全外显子测序(WES),筛选出一例携带SEPT12复合杂合突变的特发性不育患者,行Sanger测序验证,家系共分离分析.用苏木精-伊红染色(HE)及扫描电镜(SEM)分析患者精子形态畸形,透射电镜(TEM)分析精子超微结构缺陷.然后,通过Western blot及免疫荧光(IF)分析突变对其蛋白水平及位置的影响及缺陷结构标志物位置及水平的变化情况.结果 在1位弱畸精子症患者中筛选并鉴定SEPT12 基因复合杂合突变 c.C332A(p.T111K)和 c.406_416 del TGCTCGTATTG(p.q 136 VFS*39).Sanger 测序验证,符合家系共分离遗传模式.突变导致其蛋白表达缺失、精子活力降低和精子形态畸形,主要包括短尾、卷尾、精子头部不规则.精子超微结构显示精子鞭毛中段与主段连接处的环缺失、精子头部顶体膜脱落、核空泡.精子鞭毛中段线粒体鞘排列紊乱、中央二联管缺失、微管双联体缺失及部分放射轴辐缺失.Western blot及IF结果显示SEPT家族相关蛋白SEPT4蛋白水平降低,SEPT6蛋白不变,顶体相关蛋白ACTL7A和ACROSIN蛋白缺失,线粒体及轴丝相关蛋白TOMM20,SPAG6和RSPH3蛋白水平显著降低.结论 SEPT12基因突变引起SEPT12蛋白缺失,导致精子鞭毛中段与主段连接处环缺失,引起精子顶体、线粒体鞘及鞭毛组装异常.

The establishment of left-right asymmetry is a fundamental process in animal development.Interference with this process leads to a range of disorders collectively known as laterality defects,which manifest as abnormal arrangements of visceral organs.Among patients with laterality defects,congenital heart diseases(CHD)are prevalent.Through multiple model organisms,extant research has established that myosin-Id(MYO1D)deficiency causes laterality defects.This study investigated over a hundred cases and identified a novel biallelic variant of MYO1D(NM_015194:c.1531G＞A;p.D511N)in a consanguineous family with complex CHD and laterality defects.Further examination of the proband revealed asthenoteratozoospermia and shortened sperm.Afterward,the effects of the D511N variant and another known MYO1D variant(NM_015194:c.2293C＞T;p.P765S)were assessed.The assessment showed that both enhance the interaction with β-actin and SPAG6.Overall,this study revealed the genetic heterogeneity of this rare disease and found that MYO1D variants are correlated with laterality defects and CHD in humans.Furthermore,this research established a connection between sperm defects and MYO1D variants.It offers guidance for exploring infertility and reproductive health concerns.The findings provide a critical basis for advancing personalized medicine and genetic counseling.

目的 利用机器学习法筛选鼻咽癌(NPC)关键特征基因并分析其与免疫细胞相关性.方法 从基因表达数据集(GEO)下载NPC训练集数据GSE12452与GSE13597以及验证训练集数据GSE53819.首先,对训练集数据进行合并,并筛选差异表达基因(DEG);其次,对DEG进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因集富集分析(GSEA)以及免疫细胞浸润分析;再次,采用最小绝对收缩选择(LASSO)算法和支持向量机(SVM)算法对训练集数据中NPC相关特征基因进行识别并在验证集中检验,同时利用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)确定关键特征基因;最后,分析关键特征基因与免疫细胞的相关性.结果 共得到55个DEG,43个下调基因,12个上调基因;其GO功能主要富集在体液免疫反应、细胞分化、中性粒细胞激活以及趋化因子受体结合等方面;而KEGG主要富集在细胞介素17(IL-17)信号通路上;GSEA富集在细胞周期、细胞外基质受体相互作用、癌症通路以及DNA复制.免疫细胞浸润分析显示,初始B细胞、记忆B细胞以及CD4+静息记忆细胞在NPC显著降低,而CD8+T细胞、CD4+初始T细胞、活化CD4+记忆T细胞、滤泡辅助T细胞、M0和M1巨噬细胞在NPC显著增加.通过LASSO和SVM筛选的特征基因中,仅卷曲螺旋结构域19(CCDC19)、层连蛋白β1亚基(LAMB1)、精子相关抗原6(SPAG6)和RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)四个关键特征基因ROC的AUC在训练集与验证集均大于0.9,且与免疫细胞浸润密切相关.结论 通过机器学习算法筛选出NPC发生过程中的关键特征基因CCDC19、LAMB1、SPAG6以及RAD51AP1,并与免疫细胞浸润密切相关.

目的 探究5-氟尿嘧啶(5-FU)介导氧化应激治疗结肠癌的关键基因.方法 从GSE193865和GSE164742数据集中筛选5-FU介导氧化应激治疗结肠癌的共同差异基因(DEGs),并对共同DEGs进行功能富集,构建PPI网络筛选关键基因.基于TCGA数据集和GSE164742数据集,分析关键基因在结肠癌中的表达、相关性及其与预后的关系.利用分子对接实验验证5-FU对关键基因的靶向作用.结果 筛选出29个共同DEGs;这29个基因在功能上与P53信号通路、细胞周期等6条信号通路和有丝分裂细胞周期过程、微管等10项功能有关.PPI网络分析筛选得到7个关键基因(AURKA、CDCA8、CCNB1、KIF14、SPAG5、BUB1B和KIF20A);这7个关键基因均在结肠癌中高表达,且5-FU可显著抑制结肠癌细胞中这7个关键基因的高表达(均P＜0.05);在TC-GA和GSE193865数据集中这7个关键基因的表达之间均具有较好的相关性(r＞0.6,均P＜0.05)a这7个关键基因的高表达与结肠癌患者总体生存不良密切相关(Logrank P＜0.05).5-FU与这7个关键基因之间存在靶向作用.结论 成功筛选7个与5-FU介导氧化应激治疗结肠癌相关的关键基因.

目的 研究精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6,SPAG6)基因是否以P53依赖方式促进TRAIL诱导的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞凋亡.方法 通过P53kdRNA慢病毒转染人结肠癌细胞株HCT116筛选P53基因沉默的最佳靶点,利用筛选出来的最佳靶点序列转染SKM-1细胞;加入嘌呤霉素提高转染效率,RT-PCR及Western blot检验P53基因的干扰效果,构建SKM-1 P53kd细胞模型.用SPAG6kd RNA慢病毒载体转染SKM-1和SKM-1 P53kd细胞,RT-PCR及Western blot验证.用CCK-8法检测重组人可溶性TRAIL蛋白(rTRAIL)对SKM-1细胞的适宜作用浓度.Western blot检测rTRAIL处理后SKM-1和SKM-1 P53kd细胞株中Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达水平.结果 构建了SKM-1 P53kd细胞模型,转染率在90％以上,P53基因在mRNA和蛋白表达水平较对照组均显著降低(P＜0.01).SPAG6kd RNA慢病毒载体成功感染SKM-1细胞和SKM-1 P53kd细胞,转染率均在80％以上,SPAG6基因表达较对照组明显降低(P＜0.01).随着rTRAIL浓度的增加,细胞生长逐渐被抑制,30 ng/mL TRAIL诱导的细胞凋亡与对照组差异没有统计学意义,100 ng/mL和300 ng/mL TRAIL显著诱导SPAG6kd细胞凋亡(P＜0.05),而P53基因沉默与否并没有影响该结果,rTRAIL处理后细胞凋亡标志分子明显激活或水平升高,细胞中Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达水平在SKM-1和SKM-1 P53kd细胞中差异无统计学意义(P＞0.05).结论 SPAG6基因以非P53依赖方式促进TRAIL诱导的MDS细胞凋亡.

目的 采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9对斑马鱼的精子相关抗原6(Spag6)基因进行编辑,建立Spag6基因敲除斑马鱼模型.方法 针对斑马鱼Spag6基因,利用生物信息学选取靶位点,构建向导RNA(gRNA)表达载体并体外转录,将gRNA和Cas9 mRNA混合物显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中,24~48 h提取基因组DNA,PCR扩增出目的片段,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定编辑效果.结果 取3个靶位点(S1、S2、S3)进行实验,选择gRNA浓度较高的S1和S3进行注射.限制性酶切及测序的结果显示S3已产生编辑效应.结论 通过CRISPR/Cas9系统成功地获得Spag6基因编辑的突变体,为进一步探讨斑马鱼Spag6基因的体内功能奠定了基础.

目的 探讨SPAG6在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中的表达水平与临床参数相关性以及基因启动子甲基化状态对SPAG6转录调控的影响.方法 采用RT-qPCR及Western blot检测18例MDS及MDS-AML患者和20例健康对照者骨髓细胞SPAG6表达水平;甲基化特异性PCR(MS-PCR)法检测MDS患者和对照组(包括初诊缺铁性贫血患者和健康体检人群)SPAG6启动子甲基化状态;分析SPAG6启动子甲基化状态及表达水平与患者临床参数相关性.结果 与健康对照组比较,MDS患者SPAG6表达水平明显升高,且SPAG6启动子区域呈现异常低甲基化(P<0.01).SPAG6表达水平与患者年龄、骨髓原始细胞比例、危险分层有相关性(P<0.05),与患者性别无相关性(P>0.05).SPAG6基因启动子异常低甲基化状态与患者年龄、疾病危险分层有相关性(P<0.05),与患者性别、骨髓原始细胞比例无相关性(P>0.05).结论 SPAG6在MDS患者中高表达,并且与疾病发生、进展以及不良预后相关,表观遗传调控可能是SPAG6转录调控的重要机制之一.

目的:初步探讨精子相关抗原6(SPAG6)在小鼠精子发生过程中顶体形成阶段的表达及其调控作用. 方法:采用Western印迹检测出生后小鼠睾丸发育不同阶段(第8、12、16、20、24、28、30、35天)中SPAG6的表达;免疫荧光观察SPAG6在生精细胞中的定位;分别构建SPAG6和SPINK2蛋白表达质粒,以AH109和CHO细胞为对象,采用酵母双杂交及细胞内共定位实验检测SPAG6与SPINK2蛋白间相互作用;免疫荧光检测SPINK2在SPAG6基因敲除(KO)小鼠的睾丸生精细胞中的表达与定位. 结果:小鼠出生后第16～28天,SPAG6表达显著升高,且定位于圆形精子细胞的顶体;酵母双杂交实验显示SPAG6/SPINK2组能在选择性培养基(SD/-Leu/-Trp/-His)中生长;CHO细胞共转染SPAG6和SPINK2表达质粒时,SPAG6与SPINK2共定位在细胞核周围;SPAG6 KO小鼠睾丸生精细胞中未检测到SPINK2表达及定位于精子顶体. 结论:SPAG6与SPINK2形成蛋白复合体,并可能通过调控SPINK2的稳定表达参与精子顶体形成.

目的 研究与探讨西玛津对小鼠精母细胞(GC-2 spd)增殖的影响及作用机制.方法 COS-7细胞共转染pAP1-luc和Spag6基因的表达质粒,荧光素酶报告基因实验检测SPAG6对AP-1转录活性的影响.以不同浓度西玛津(0、5、25、125 μg/mL)染毒GC-2 spd细胞24、48和72 h,采用CCK-8法检测细胞存活率.西玛津染毒24h后,western blot检测SPAG6和COPS5蛋白的表达变化,qPCR检测促凋亡因子Bax及抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表达.结果 COS-7细胞内过表达SPAG6能抑制AP-1的转录活性.与对照组比较,25和125 μ g/mL西玛津染毒组中GC-2spd细胞存活率、细胞内SPAG6蛋白及Bax mRNA的表达水平均下降,差异具有统计学意义(P＜0.05),然而COPS5蛋白及Bcl-2mRNA的表达没有显著变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 西玛津对GC-2spd细胞具有毒性作用,可能通过抑制SPAG6蛋白表达从而调节AP-1介导的凋亡基因的表达,诱导生精细胞凋亡.