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SPAG6基因沉默和地西他滨对SKM-1细胞凋亡和PTEN甲基化的影响
编辑人员丨4天前
目的:探讨SPAG6基因沉默和地西他滨在体内外对SKM-1细胞凋亡和PTEN启动子甲基化的作用。方法:慢病毒载体转染SKM-1细胞沉默SPAG6基因的表达,地西他滨处理细胞后CCK-8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot和甲基化特异性PCR检测PTEN的蛋白表达和甲基化情况,并构建非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠异体移植瘤模型,TUNEL法观察肿瘤组织凋亡,免疫组化检测PTEN在组织中表达情况。结果:慢病毒转染后SPAG6干扰组SPAG6基因被成功沉默;CCK-8检测结果提示地西他滨处理能够降低SKM-1细胞的存活率,同时流式细胞术检测显示地西他滨处理组的细胞凋亡率[(17.35±3.37)%]高于未处理组[(5.09±2.06)%],且SPAG6基因沉默联合地西他滨处理组的凋亡率最高[(36.34±4.00)%];地西他滨处理后DNMT1的表达降低而PTEN表达升高,同时PTEN启动子甲基化程度降低,而经地西他滨处理后的SPAG6干扰组的PTEN去甲基化引起的蛋白表达升高效果最明显;NOD/SCID小鼠异体瘤移植模型中地西他滨组的肿瘤体积明显小于生理盐水组,而地西他滨处理SPAG6干扰组的小鼠肿瘤体积最小,且经TUNEL检测发现其凋亡程度最高(阳性比值为3.57±0.48)。结论:SPAG6基因沉默在SKM-1细胞中能增强地西他滨诱导的凋亡和PTEN去甲基化作用,并且在NOD/SCID异体瘤移植模型小鼠中能够增强地西他滨的抗肿瘤特性。
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编辑人员丨4天前
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Y-box结合蛋白1通过沉默信息调节因子1 mRNA稳定性调节抑制人颗粒细胞凋亡在早发性卵巢功能不全中的作用与机制
编辑人员丨1个月前
目的:探讨Y-box结合蛋白1(YBX1)调节沉默信息调节因子1(SIRT1)对颗粒细胞增殖和凋亡的影响,研究YBX1 和SIRT1 在早发性卵巢功能不全(POI)患者及卵巢功能正常患者间表达水平差异及临床意义.方法:留取2022 年6 月至2023 年7 月于江苏大学第四附属医院生殖医学中心进行体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕的POI患者(POI组)及卵巢储备功能正常患者(对照组)的颗粒细胞和血清,利用免疫印迹(WB)检测YBX1 蛋白表达水平;利用实时荧光定量核酸扩增法(RT-qPCR)检测 YBX1 及 SIRT1 mRNA 表达水平,并分析血清中其与卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)、窦卵泡数(AFC)的相关性;利用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)、细胞计数试剂8(CCK8)检测细胞增殖、原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;RT-qPCR检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl2)、Bcl2 相关X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达情况;RNA免疫沉淀(RIP)实验检测YBX1 与SIRT1的相互作用.结果:与对照组患者相比,POI组患者颗粒细胞和血清中YBX1 蛋白及SIRT1 mRNA的表达降低(P<0.05);血清中YBX1、SIRT1 mRNA表达与FSH、LH负相关(r<0,P<0.05),与E2、AMH、AFC正相关(r>0,P<0.05);在颗粒细胞中上调YBX1 后SIRT1 蛋白表达量、SIRT1 mRNA的稳定性、EdU阳性率、细胞活性、PCNA mRNA表达量、Bcl2/BAX比值均增加(P<0.05),Caspase-3 mRNA表达量、TUNEL阳性率均降低(P<0.05).结论:YBX1 和SIRT1 在POI患者中表达水平显著下调,且其表达水平与临床卵巢功能指标相关;YBX1 结合SIRT1 mRNA增强其稳定性,可能促进颗粒细胞增殖,抑制细胞凋亡,提示YBX1 和SIRT1 有望成为POI诊疗的新靶点.
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编辑人员丨1个月前
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基于机器学习鼻咽癌关键特征基因筛选及其与免疫细胞相关性分析
编辑人员丨2024/2/3
目的 利用机器学习法筛选鼻咽癌(NPC)关键特征基因并分析其与免疫细胞相关性.方法 从基因表达数据集(GEO)下载NPC训练集数据GSE12452与GSE13597以及验证训练集数据GSE53819.首先,对训练集数据进行合并,并筛选差异表达基因(DEG);其次,对DEG进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因集富集分析(GSEA)以及免疫细胞浸润分析;再次,采用最小绝对收缩选择(LASSO)算法和支持向量机(SVM)算法对训练集数据中NPC相关特征基因进行识别并在验证集中检验,同时利用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)确定关键特征基因;最后,分析关键特征基因与免疫细胞的相关性.结果 共得到55个DEG,43个下调基因,12个上调基因;其GO功能主要富集在体液免疫反应、细胞分化、中性粒细胞激活以及趋化因子受体结合等方面;而KEGG主要富集在细胞介素17(IL-17)信号通路上;GSEA富集在细胞周期、细胞外基质受体相互作用、癌症通路以及DNA复制.免疫细胞浸润分析显示,初始B细胞、记忆B细胞以及CD4+静息记忆细胞在NPC显著降低,而CD8+T细胞、CD4+初始T细胞、活化CD4+记忆T细胞、滤泡辅助T细胞、M0和M1巨噬细胞在NPC显著增加.通过LASSO和SVM筛选的特征基因中,仅卷曲螺旋结构域19(CCDC19)、层连蛋白β1亚基(LAMB1)、精子相关抗原6(SPAG6)和RAD51相关蛋白1(RAD51AP1)四个关键特征基因ROC的AUC在训练集与验证集均大于0.9,且与免疫细胞浸润密切相关.结论 通过机器学习算法筛选出NPC发生过程中的关键特征基因CCDC19、LAMB1、SPAG6以及RAD51AP1,并与免疫细胞浸润密切相关.
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编辑人员丨2024/2/3
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DnaJ热休克蛋白家族成员C9在肺腺癌中的表达及预后价值
编辑人员丨2023/10/21
目的 探讨DnaJ热休克蛋白家族成员C9(DNAJC9)在肺腺癌(LUAD)组织中的表达、预后、甲基化情况及与肿瘤免疫浸润的关系.方法 利用肿瘤基因组计划(TCGA)中LUAD的表达及临床数据分析DNAJC9的差异表达及预后价值.采用免疫组化法检测40例LUAD患者的癌组织及配对正常组织DNAJC9的蛋白表达;利用UALCAN数据库及TCGA Wanderer数据库对DNAJC9启动子区域甲基化位点进行分析;利用TIMER数据库和单样本基因集富集分析(ssGSEA)对DNAJC9表达与LUAD免疫浸润水平的关系进行分析;根据String数据库分析与DNAJC9相互作用的蛋白,利用FUNRICH富集分析工具对这些基因进行功能富集分析.结果 DNAJC9在LUAD组织中的表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.01).免疫组化法显示,DNAJC9蛋白在LUAD组织中的表达率为80.0%(32/40),高于癌旁组织的45.0%(18/40),差异有统计学意义(P<0.05).高表达患者的总生存率、无疾病生存率和无进展生存率均低于低表达者,差异有统计学意义(P<0.05).DNAJC9的表达与是否存在TP53突变显著相关(P<0.05).DNAJC9基因启动子区域甲基化水平在肿瘤组织中低于正常组织,且和该基因序列表达相关的甲基化位点与其表达水平呈负相关(P<0.05).DNAJC9表达与LUAD免疫细胞浸润水平相关.蛋白相互作用网络分析发现,微小染色体维持复合物成分6(MCM6)、核糖核苷酸还原酶催化亚基M1(RRM1)、核自身抗原精子蛋白(NASP)、皮瓣结构特异性内切酶(FEN1)、脱氧尿苷三磷酸酶(DUT)、复制因子C亚基4(RFC4)、序列相似的家族149成员B1(FAM149B1)、MutS同源2(MSH2)、染色体的结构维持2(SMC2)、小染色体维持复合体成分2(MCM2)等蛋白与DNAJC9密切相关.富集分析显示,这些基因参与DNA合成、G2/M检查点等信号通路及多种致癌过程.结论 DNAJC9的低甲基化水平使DNAJC9在LUAD组织中呈高表达,其高表达提示预后不良,与免疫细胞的浸润相关.
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编辑人员丨2023/10/21
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精子相关抗原6基因以非P53依赖方式促进TRAIL诱导的骨髓增生异常综合征细胞凋亡
编辑人员丨2023/8/6
目的 研究精子相关抗原6(sperm-associated antigen 6,SPAG6)基因是否以P53依赖方式促进TRAIL诱导的骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞凋亡.方法 通过P53kdRNA慢病毒转染人结肠癌细胞株HCT116筛选P53基因沉默的最佳靶点,利用筛选出来的最佳靶点序列转染SKM-1细胞;加入嘌呤霉素提高转染效率,RT-PCR及Western blot检验P53基因的干扰效果,构建SKM-1 P53kd细胞模型.用SPAG6kd RNA慢病毒载体转染SKM-1和SKM-1 P53kd细胞,RT-PCR及Western blot验证.用CCK-8法检测重组人可溶性TRAIL蛋白(rTRAIL)对SKM-1细胞的适宜作用浓度.Western blot检测rTRAIL处理后SKM-1和SKM-1 P53kd细胞株中Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达水平.结果 构建了SKM-1 P53kd细胞模型,转染率在90%以上,P53基因在mRNA和蛋白表达水平较对照组均显著降低(P<0.01).SPAG6kd RNA慢病毒载体成功感染SKM-1细胞和SKM-1 P53kd细胞,转染率均在80%以上,SPAG6基因表达较对照组明显降低(P<0.01).随着rTRAIL浓度的增加,细胞生长逐渐被抑制,30 ng/mL TRAIL诱导的细胞凋亡与对照组差异没有统计学意义,100 ng/mL和300 ng/mL TRAIL显著诱导SPAG6kd细胞凋亡(P<0.05),而P53基因沉默与否并没有影响该结果,rTRAIL处理后细胞凋亡标志分子明显激活或水平升高,细胞中Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达水平在SKM-1和SKM-1 P53kd细胞中差异无统计学意义(P>0.05).结论 SPAG6基因以非P53依赖方式促进TRAIL诱导的MDS细胞凋亡.
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编辑人员丨2023/8/6
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利用CRISPR/Cas9系统建立斑马鱼Spag6基因敲除模型
编辑人员丨2023/8/6
目的 采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9对斑马鱼的精子相关抗原6(Spag6)基因进行编辑,建立Spag6基因敲除斑马鱼模型.方法 针对斑马鱼Spag6基因,利用生物信息学选取靶位点,构建向导RNA(gRNA)表达载体并体外转录,将gRNA和Cas9 mRNA混合物显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中,24~48 h提取基因组DNA,PCR扩增出目的片段,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定编辑效果.结果 取3个靶位点(S1、S2、S3)进行实验,选择gRNA浓度较高的S1和S3进行注射.限制性酶切及测序的结果显示S3已产生编辑效应.结论 通过CRISPR/Cas9系统成功地获得Spag6基因编辑的突变体,为进一步探讨斑马鱼Spag6基因的体内功能奠定了基础.
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编辑人员丨2023/8/6
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不育症患者合并前列腺癌和精囊结石超声表现1例
编辑人员丨2023/8/6
患者男,37岁,间断肉眼血尿5个月,加重伴尿频、尿痛1个月入院.患者自诉备育1年,其妻子曾以"不孕"就诊于我院妇科门诊,后经输卵管造影及其他检查均显示正常,因此排除了女方不孕症的可能.患者近1个月出现无痛性肉眼血尿加重,射精时出现腹股沟区疼痛.肛门指诊:前列腺Ⅱ度增大,中央沟消失,左侧叶未触及结节,右侧叶质地偏硬,表面不光滑,可触及结节,有压痛,边界触及不清.总前列腺特异抗原(TPSA ) 45 μg/L,游离前列腺特异抗原(FPSA) 6.3 μg/L .精液检查:精液量3.8 ml,pH 7.40,精子总活力12.01%,前向运动力11.69%,精子浓度70.84× 106/ml,精子总数280.60 × 106.尿常规检查:红细胞25 792.6/μl,白细胞5 992.6/μl .经腹泌尿系超声检查:前列腺大小51 mm×40 mm×39 mm,内回声不均,内部血流信号丰富,与膀胱后壁分界不清,右侧输尿管全程扩张,右侧输尿管膀胱壁内段处周围膀胱壁明显增厚,与增大的前列腺无明显分界,增厚膀胱壁内部血流信号丰富(图1),右肾重度积水,双侧精囊腺体积增大,回声不均,精囊内可见10 mm×5 mm弧形强回声,后伴声影(图2).超声初步诊断:前列腺占位,右肾积水,右侧输尿管增宽,膀胱后壁增厚,精囊腺结石.入院后临床初步诊断:前列腺占位,精囊结石,右肾重度积水.完善相关检查后,在我院泌尿外科行手术治疗.术中剖开精囊腺发现结石1枚,大小约10 mm×5 mm,术后病理结果:前列腺腺癌,Gleason分级(2+4=6) .免疫组化结果:CK-H (-), Ki67 (< 10% +), P5043 (部分+), PSA (+), CK-L (+) .最终诊断:前列腺腺癌、精囊腺结石.术后患者恢复良好,2周后出院.
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编辑人员丨2023/8/6
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梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织来源iPSCs系的建立
编辑人员丨2023/8/6
目的 利用梗阻性无精子症(OA)和非梗阻性无精子症(NOA)患者的睾丸组织建立诱导性多能干细胞(iPSCs)系,比较两者建系过程有无差别.方法 分别取3例OA患者和特发性NOA患者5~6 mm3的睾丸组织,组织块培养方法进行原代培养,传至3~4代转染仙台病毒,待细胞增殖满后转移至饲养层细胞上继续培养,第21~22天挑取克隆,建立iPSCs系并进行多能性和分化能力的鉴定.结果 两株iPSCs系均成功建立,建系过程无明显差异,碱性磷酸酶(AP)染色均为阳性;八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定基因相关蛋白2(SOX2)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤排斥抗原-1-60(TRA-1-60)的免疫荧光染色均为阳性;小鼠体内的畸胎瘤实验也表明获得的两株iPSCs系具有向3个胚层分化的潜能.结论 利用仙台病毒非基因整合方法,OA患者和特发性NOA患者的睾丸组织均能建立iPSCs系.
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编辑人员丨2023/8/6
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mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠模型的构建与鉴定
编辑人员丨2023/8/6
目的:为研究支架蛋白JLP在肾脏中的生理功能,建立小鼠精子相关抗原(mSpag9)肾脏特异性基因敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路.方法:构建mSpag9基因重组载体,通过电转打靶转染胚胎干细胞(ES细胞),将筛选出的阳性ES细胞克隆,经显微注射至超排小鼠的囊胚腔后移植于受体小鼠,从子代筛选嵌合体小鼠,与携带flp位点C57/BL6N小鼠杂交后得到mSpag9flox/+基因敲除小鼠,自交筛选出mSpag9flox/flox小鼠,再与KSP-CreERT2小鼠杂交得到mSpag9flox/flox-Cre肾脏特异性基因敲除小鼠并进行鉴定,待小鼠成长至5周,使用Tamoxifen(10 mg/mL葵花籽油溶解)腹腔注射(0.04 mg/g)诱导Cre重组酶特异性表达于肾小管上皮细胞.结果:经PCR扫描后得到10株阳性ES细胞克隆,其中6株使用Southern Blot鉴定;经显微注射后得到4只雄性、5只雌性嵌合体小鼠,与flp小鼠杂交后得到9只mSpag9flox/+基因敲除小鼠,将自交得到的mSpag9flox/flox小鼠与KSP-CreERT2小鼠交配筛选出mSpag9flox/+-Cre+3只小鼠,将其与mSpag9flox/flox小鼠回交得到基因型为mSpag9flox/flox-Cre+小鼠,即为mSpag9肾脏特异性基因敲除小鼠.结论:该模型利用Cre-Loxp系统实现基因mSpag9的基因打靶,Tamxifen诱导基因mSpag9实现该基因在肾小管上皮细胞上敲除,为进一步研究mSpag9基因及支架蛋白在肾脏生理病理进展中所发挥的作用提供工具.
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编辑人员丨2023/8/6
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广东省人类精子库13705例供精志愿者淘汰原因分析
编辑人员丨2023/8/6
目的 分析人类精子库志愿者淘汰原因,促进人类精子库对志愿者进行规范筛选,提高筛选质量.方法 回顾性分析广东省专科医院人类精子库自2003年成立以来至2017年累计15年招募的全部13705例供精志愿者的筛选资料,采用描述性统计学方法对志愿者的淘汰原因进行分析.结果 筛选期间80.5% 志愿者进行了1次精液检查,19.5% 进行了2次精液检查.共有54.7%(7498/13705)的志愿者因精液质量没有达到捐精标准被淘汰;45.3%(6207/13705)的志愿者筛选精液质量达到捐精标准后又进行了传染病、性传播性疾病和遗传病等相关检查.全部检查筛选合格的志愿者4160名,占30.3%.共有2047名志愿者因实验室检测项目结果异常被淘汰,占33.0%.淘汰原因如下:4.14%(257/6207)乙肝表面抗原阳性,0.19%(12/6207)丙肝抗体阳性,0.11%(7/6207)梅毒抗体阳性,0.03%(2/6207)人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体阳性,3.63%(225/6207)优生四项抗体阳性,0.14%(9/6207)衣原体阳性,6.61%(410/6207)支原体阳性,0.03%(2/6207)淋菌阳性,0.27%(17/6207)细菌培养有致病菌生长,11.64%(722/6207)地中海贫血筛查异常,4.29%(266/6207)G6PD酶缺乏,1.92%(118/6207)染色体核型异常.结论 捐精志愿者病原体的筛查阳性率均低于普通人群,人类精子库须严格把握志愿者淘汰原则,加强志愿者招募时的宣传教育工作.
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编辑人员丨2023/8/6
