目的:探究清除Vγ4T细胞在小鼠皮肤紫外线损伤后表皮组织修复中的作用及其机制。方法:该研究为实验研究。将54只6~8周龄雌性C57BL/6J野生型小鼠按照随机数字表法分为Vγ4T细胞清除组和对照组（每组27只），分别腹腔注射亚美尼亚仓鼠抗小鼠Vγ4T细胞受体（TCR）单克隆抗体200 μg、等量同型对照IgG抗体。注射后1周（之后均在此时间点取小鼠），每组取3只小鼠（之后均从这2组另取小鼠），从背部皮肤组织和腋窝、腹股沟淋巴结中分别提取真皮细胞和淋巴结细胞，行流式细胞术检测真皮细胞和淋巴结细胞中Vγ4T细胞比例；每组取5只小鼠，观察背部皮肤情况，之后行苏木精-伊红（HE）染色观察皮肤组织结构并测量表皮组织厚度；每组取5只小鼠，提取表皮细胞后行流式细胞术检测表皮细胞中树突状表皮T细胞（DETC）比例。每组取3只小鼠，分别设为Vγ4T细胞清除+5次紫外线辐射（UVR）组和对照+5次UVR组，每日1次共行5次UVR，每日照射后即刻观察背部皮肤情况；每组取5只小鼠，分别设为Vγ4T细胞清除+1次UVR组和对照+1次UVR组，均行1次UVR后即刻行HE染色后测量表皮组织厚度。每组取3只小鼠，分别设为单纯Vγ4T细胞清除组、单纯对照组；再另取3只小鼠，分别设为Vγ4T细胞清除+1次UVR组和对照+1次UVR组；均同前处理后，采用实时荧光定量反转录PCR法检测表皮组织中胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、角质形成细胞生长因子（KGF）、Vγ5TCR、白细胞介素15（IL-15）、IL-1β、IL-23、自然杀伤细胞2族成员D（NKG2D）、组织相容性抗原60（H60）、小鼠UL16结合蛋白样转录子1（Mult1）、维甲酸早期诱导蛋白1（Rae1）的mRNA表达。结果:注射后1周，Vγ4T细胞清除组小鼠真皮细胞、淋巴结细胞中Vγ4T细胞比例均明显低于对照组（ t值分别为27.99、13.12， P<0.05）；Vγ4T细胞清除组和对照组小鼠皮肤大体情况和组织结构无明显区别，表皮组织厚度相近（ P>0.05）；Vγ4T细胞清除组小鼠表皮细胞中DETC比例为（3.9±0.8）%，明显高于对照组的（1.6±0.5）%（ t=4.84， P<0.05）。与对照+5次UVR组相比，Vγ4T细胞清除+5次UVR组小鼠进行1次UVR后皮肤鳞屑增多，照射2次出现鳞屑样痂皮，照射3~5次鳞屑样痂皮明显增多。行UVR后即刻，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织厚度较对照+1次UVR组明显增加（ t=11.50， P<0.05）。与单纯对照组相比，单纯Vγ4T细胞清除组小鼠表皮组织中Vγ5TCR的mRNA表达明显上调（ t=41.16， P<0.05），IL-23的mRNA表达明显下调（ t=6.52， P<0.05）；与单纯对照组相比，对照+1次UVR组小鼠表皮组织中Vγ5TCR、KGF的mRNA表达均明显上调（ t值分别为15.22、13.22， P<0.05），IGF-Ⅰ、IL-23的mRNA表达均明显下调（ t值分别为3.71、4.95， P<0.05）；与单纯Vγ4T细胞清除组相比，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中IGF-Ⅰ、KGF的mRNA表达均明显上调（ t值分别为11.40、18.88， P<0.05），IL-1β的mRNA表达明显下调（ t=4.42， P<0.05）；与对照+1次UVR组相比，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中Vγ5TCR、IGF-Ⅰ、KGF的mRNA表达均明显上调（ t值分别为4.52、15.24、9.43， P<0.05）；4组小鼠表皮组织中IL-15的mRNA表达总体相近（ P>0.05）。与单纯对照组相比，单纯Vγ4T细胞清除组表皮组织中NKG2D、Rae1的mRNA表达均明显上调（ t值分别为3.67、47.40， P<0.05），对照+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显上调（ t值分别为5.30、6.50、9.16， P<0.05）；与单纯Vγ4T细胞清除组相比，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、H60、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显下调（ t值分别为4.57、4.13、4.67、27.36， P<0.05）；与对照+1次UVR组相比，Vγ4T细胞清除+1次UVR组小鼠表皮组织中NKG2D、H60、Mult1、Rae1的mRNA表达均明显下调（ t值分别为5.77、8.18、12.90、8.08， P<0.05）。 结论:清除Vγ4T细胞有利于DETC增殖和毒性下调，可能促进UVR后小鼠表皮损伤修复 。

目的:观察三氧化二砷(ATO)对急性髓系白血病细胞KG1a细胞表面NKG2D配体UL16结合蛋白1(ULBP1)表达的影响，探讨其调节ULBP1表达的分子机制。方法:常规体外培养KG1a细胞，采用细胞增殖/毒性检测试剂(CCK8)检测不同浓度ATO对KG1a细胞的增殖抑制率；应用实时荧光定量反转录(RT)－PCR方法检测KG1a细胞ULBP1 mRNA表达的影响；流式细胞术检测ATO对KG1a细胞表面ULBP1蛋白表达的影响。加入毛细血管扩张性共济失调突变和RAD3相关激酶(ATM/ATR)抑制剂咖啡因，观察其是否影响ATO对KG1a细胞ULBP1 mRNA及蛋白的表达。采用Western blot法观察ATO对KG1a细胞中CHK1、CHK2蛋白及其磷酸化表达的影响。结果:不同浓度(1、2、3、4、5 μmol/L)ATO均可抑制KG1a细胞的增殖，呈浓度依赖性，其对KG1a细胞的半数抑制浓度(IC 50值)为2.7 μmol/L。荧光定量RT－PCR法检测结果示ATO可使KG1a细胞ULBP1 mRNA的相对表达水平升高，ATO在浓度分别为1、2、3、4、5 μmol/L时，与未加药组比较，ULBP1 mRNA相对表达水平分别升高至(1.86±0.30)倍、(3.02±0.71)倍、(3.16±0.75)倍、(4.80±0.70)倍、(3.70±0.89)倍，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与未加药组相比，当ATO浓度分别为1、2、3、4、5 μmol/L时，ULBP1蛋白相对表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。咖啡因预先处理KG1a细胞2 h再联合ATO共同孵育KG1a细胞24 h，ULBP1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低。在咖啡因浓度为8 mmol/L时，ULBP1 mRNA相对表达水平由不用咖啡因处理组的(9.55±0.38)倍降为(6.36±0.93)倍，差异有统计学意义( P<0.05)；流式细胞术检测结果发现，当咖啡因浓度分别为2、4、8 mmol/L时，ULBP1蛋白相对表达水平由不用咖啡因处理组的(3.50±0.08)倍分别降为(2.17±0.07)倍、(2.02±0.06)倍、(1.75±0.06)倍，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。CHK1和CHK2蛋白相对表达水平均随ATO浓度的升高而降低，而CHK1和CHK2磷酸化蛋白的相对表达水平均随ATO浓度的升高而升高。 结论:ATO诱导上调KG1a细胞ULBP1 mRNA及蛋白的表达，ATM/ATR－CHK1/CHK2通路可能参与这一过程。

目的:观察微小核糖核酸-10b(miR-10b)对脑胶质瘤细胞免疫效应的调节作用并探讨其作用机制.方法:取人脑胶质瘤细胞U251进行培养和传代,获得处于对数生长期的细胞.按照1.0×105个/ml浓度制备细胞悬液,并设置对照组、过表达组、低表达组、空白组,每组6个复孔.对照组、过表达组、低表达组分别采用脂质体转染法转染阴性对照、miR-10b模拟物、miR-10b抑制剂,空白组予以等量无菌生理盐水.分离和培养1例健康志愿者外周血自然杀伤(NK)细胞.MTT法检测不同效靶比时NK细胞的杀伤活性;流式细胞仪检测各组NK细胞表面NK细胞激活受体(NKG2D)表达,并检测各组人脑胶质瘤细胞U251表面主要组织相容性复合物Ⅰ链相关基因A(MICA)、UL16结合蛋白2(ULBP2)、UL16结合蛋白3(ULBP3)表达.结果:对照组、过表达组、低表达组转染效率分别为(93.55±2.05)%、(95.67±3.14)%、(94.18±3.26)%;与对照组和空白组相比,过表达组miR-10b表达升高,低表达组miR-10b表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05),且对照组和空白组miR-10b表达差异无统计学意义(P>0.05);与对照组和空白组相比,过表达组NK细胞不同效靶比杀伤活性均降低、NKG2D表达降低,低表达组NK细胞不同效靶比杀伤活性均增高、NKG2D表达增高,差异均有统计学意义(P<0.05),各组NK细胞杀伤活性均随效靶比增加而增高,差异均有统计学意义(P<0.05),且对照组与空白组相比,相同效靶比NK细胞杀伤活性、NKG2D表达差异均无统计学意义(P>0.05);与对照组和空白组相比,过表达组人脑胶质瘤细胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表达均降低,低表达组人脑胶质瘤细胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表达均增高,差异均有统计学意义(P<0.05),且对照组与空白组人脑胶质瘤细胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表达差异均无统计学意义(P>0.05).结论:抑制miR-10b表达能够增加NK细胞表面NKG2D和人脑胶质瘤细胞U251表面MICA、ULBP2、ULBP3表达,增强NK细胞对人脑胶质瘤细胞U251的杀伤活性.

目的:配对盒基因6(paired box gene 6,PAX6)主要在胚胎发育中发挥调控作用,其异常表达与多种肿瘤的发生、发展有关,在不同肿瘤中可发挥促癌或抑癌的作用.本研究旨在观察过表达PAX6对肝癌细胞生长及自然杀伤(natural killer,NK)细胞对肝癌细胞杀伤能力的影响及其分子机制.方法:采用ELISA技术检测68例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者和10例健康人外周血的PAX6、可溶性主要组织相容性复合体I类样蛋白A(soluble major histocompatibility complex class I-like protein A,sMICA)和可溶性UL16结合蛋白2(soluble UL16 binding protein 2,sULBP2)的表达水平;体外培养肝癌细胞HepG2和LM3及人正常肝细胞LO2,将PAX6过表达质粒(PAX6-OE)和空载体(NC)转入HepG2和LM3细胞中构建稳定细胞株,分别采用real-time PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光等方法检测HepG2和LM3细胞中PAX6的表达水平;在HepG2和LM3细胞中过表达PAX6,采用CCK-8法和细胞划痕实验检测细胞生长和迁移能力,ELISA法检测其上清液中sMICA和sULBP2的分泌水平,蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、去整合素样金属蛋白酶10(disintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10)的蛋白质表达水平;采用流式细胞术检测NK细胞对2种肝癌细胞的杀伤能力.结果:与健康人相比较,HCC患者血清中PAX6表达水平显著降低(P=0.002),而sMICA和sULBP2的表达水平显著增高(P=0.004和P<0.001).Real-time PCR、蛋白质印迹法结果显示:与正常肝细胞LO2相比,HepG2和LM3细胞PAX6的mRNA和蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05).免疫荧光结果亦可见肝癌细胞HepG2和LM3中PAX6的表达均低于正常肝细胞LO2.与NC组比较,PAX6-OE组肝癌细胞HepG2和LM3的增殖及迁移能力下降(均P<0.05);PAX6-OE组的HepG2和LM3细胞中MMP2、MMP9、ADAM10的蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05),且PAX6-OE组的HepG2和LM3细胞上清液中sMICA和sULBP2的分泌水平均显著低于NC组(均P<0.05).流式细胞术显示:与NC组比较,PAX6-OE组NK细胞对HepG2和LM3细胞的杀伤率显著增高(均P<0.05).结论:PAX6在HCC患者血清及肝癌细胞系中表达降低,过表达PAX6可抑制肝癌细胞生长,增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效率,其机制与PAX6抑制金属蛋白酶的表达、降低sMICA和sULBP2的分泌水平有关.

目的 探讨靶向人类表皮生长因子受体2(Her-2)的曲妥珠单抗(Trastuzumab)与UL16结合蛋白2(ULBP2)的融合蛋白(T-ULBP2)激活自然杀伤(NK)细胞,杀伤乳腺癌细胞SK-BR-3的治疗策略及治疗效果.方法 使用重叠聚合酶链反应(PCR)法通过G4S柔性肽将曲妥珠单抗重链C末端及人ULBP2胞外区基因连接,构建人工程载体pCDNA3.1中,通过脂质体转染法将质粒转入人胚肾细胞HEK-293中进行表达.流式细胞术检测T-ULBP2对乳腺癌SK-BR-3细胞的结合能力.噻唑蓝(MTT)法检测T-ULBP2是否保留亲本曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞的增殖抑制能力.通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验验证T-ULBP2激活NK细胞杀伤肿瘤细胞的效果.流式细胞术检测T-ULBP2是否可以诱导NK-92细胞的活化.结果 成功表达融合蛋白T-ULBP2.流式细胞术检测T-ULBP2与乳腺癌细胞SK-BR-3的结合率为79.5％,与亲本曲妥珠单抗结合率(72.9％)相当.结论 成功构建并表达了T-ULBP2.T-ULBP2具有与亲本曲妥珠单抗相似的乳腺癌细胞结合能力和抑制肿瘤增殖能力.

目的:探讨人巨细胞病毒UL138基因表达对胃癌细胞免疫相关功能的影响.方法:构建UL138基因真核表达重组质粒,转染BGC-823胃癌细胞,经Western blot及免疫荧光验证UL138表达,通过基因芯片结合生物信息学技术分析UL138表达对胃癌细胞功能的影响,荧光定量PCR进一步验证胃癌细胞中免疫相关分子的表达,Western blot分析免疫原性死亡相关蛋白的变化.结果:Western blot及免疫荧光证实重组质粒转染后胃癌细胞表达UL138;基因芯片差异基因分析显示UL138的表达上调了370个基因表达,下调了206个基因的表达;生物信息学分析提示这些差异基因的表达参与了胃癌细胞骨架重构、细胞黏附等并与消化系统疾病相关.荧光定量PCR分析显示UL138的表达上调了IL1A、IL6、IL11、IL8、IL1RL1、IL7R、IL13RA2、CCL3L1、CCL5、TNFAIP3、TNFRSF21、VEGFA、CD44、CD55、CD59、CD274 16种炎症相关细胞因子基因表达并下调了CXCL10、IFNAR1基因的表达.此外,Western blot结果显示UL138的表达上调了免疫原性死亡相关蛋白ERp57的表达(P＜0.01),不影响HSP70的表达(P＞0.05).结论:UL138基因的表达能促进胃癌细胞促炎相关细胞因子表达并诱导免疫原性细胞死亡的特征.

目的 探究靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2激活NK细胞治疗结直肠癌的体内外活性.方法 通过重叠延伸PCR技术并利用柔性肽G4S将靶向EGFR的抗体(西妥昔单抗)基因与UL16结合蛋白2基因连接起来,建立重组载体,再利用毕赤酵母表达系统进行表达;利用流式细胞仪测定目标融合蛋白对HCT116细胞的结合力;利用MTT法检测目标融合蛋白在体外对HCT116细胞的增殖抑制作用;通过ADCC法测定目标融合蛋白激活NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力.结果 通过基因工程法以及毕赤酵母表达,成功地获得本研究的目标融合蛋白,通过Western blot实验结果表明目标融合蛋白Cetuximab-ULBP正确表达以及成功装配.通过流式细胞仪实验结果表明Cetuximab-ULBP和结直肠癌细胞HCT116的结合率为79.21％,和西妥昔单抗的结合率(73.53％)相当,目标抗体仍然保持了母体抗体结合HCT116细胞的活性.MTT实验结果表明,西妥昔单抗组和目标融合蛋白组对HCT116细胞的增殖均有抑制作用,并且呈浓度依赖性.西妥昔单抗组的抑制HCT116细胞增殖率为73.76％,目标融合蛋白组抑制HCT116细胞增殖率为71.98％,两者活性相当,并且增殖抑制作用呈浓度依赖性.目标融合蛋白能显著增强结直肠癌HCT116细胞的杀伤作用.选用NK92细胞作为效应细胞,当效靶比为100∶1时,西妥昔单抗和目标融合蛋白都能够增强NK92的杀伤HCT116肿瘤细胞的作用,其中目标融合蛋白组的细胞裂解率是(45.34±7.14)％,而西妥昔单抗组的细胞裂解率是(38.24±6.11)％,两者比较,具有统计学差异(P＜0.05).结论 与单一西妥昔单抗相比,靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2通过介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞而增强其抗肿瘤活性,在临床上可作为一种结直肠癌治疗的新方法.

人自然杀伤细胞家族2成员D(NKG2D)配体包括主要组织相容性复合体Ⅰ类肽相关序列A(MICA)、MICB、UL16结合蛋白(ULBP),均定位于6号染色体上;由胞外结构域、跨膜区和胞质结构域三部分组成,在肝细胞癌等多种肿瘤细胞既能单独表达又可共同表达.其与NKG2D相互结合的亲和力从高到低依次为ULBP1、MICA、MICB,通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)等信号通路,使自然杀伤(NK)细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、颗粒酶增加,并使肝癌细胞Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)表达上调,促进靶细胞溶解.诱导肝癌细胞表达MICA、MICB、ULBP1,可显著增强NK细胞对其的敏感性,多途径发挥对肝癌细胞的细胞毒性效应.

目的:研究复方苦参对自然杀伤细胞(NK细胞)杀伤白血病干细胞(LSC)的影响及机制.方法:检测NK细胞对K 562细胞、复方苦参干预前后LSC的杀伤作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况.检测K 562细胞、复方苦参干预前后LSC细胞表面的NKG2D配体人巨细胞病毒UL 16蛋白的结合蛋白(ULBP1)、MHC-Ⅰ类链相关分析A或B(MICA/B)水平.结果:复方苦参提高LSC对NK细胞杀伤作用的敏感性.复方苦参增加NK细胞对LSC诱导凋亡作用.复方苦参可上调LSC表面的NKG2D配体ULBP1、MICA/B水平.结论:复方苦参增强LSC对NK细胞杀伤的敏感性和凋亡诱导作用.

目的 探讨CD34+ CD38-KG1a白血病干细胞抵抗同种异体自然杀伤(NK)细胞杀伤作用的机制.方法 采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34+ CD38-KG1a细胞和4例健康个体外周血中NK细胞,并采用流式细胞术检测纯度;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞在不同效靶比(5∶1,10∶1,20∶1)下对K562和CD34+ CD38-KG1a细胞的杀伤作用;聚合酶链式反应-序列特异性引物法分析NK细胞KIR和CD34+ CD38-KG1a细胞HLA-Ⅰ基因分型;流式细胞术检测K562和CD34+ CD38-KG1 a细胞表面主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类链相关分子A/B、人巨细胞病毒UL16结合蛋白(ULBP)1～3和人类白细胞抗原(HLA)-Ⅰ类分子的表达.结果 分选的CD34+ CD38--KG1a细胞和NK细胞纯度分别为(94.25±2.16)％、(91.70±2.05)％.NK细胞在各效靶比下对CD34+ CD38-KG1a细胞的杀伤率均低于K562细胞(P＜0.05).4例健康个体NK细胞KIR基因型为KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2,CD34+ CD38-KG1a细胞HLA-Ⅰ基因型为A30、30,B51、78,Cw4、16.K562细胞高表达NKG2D配体,CD34+CD38-KG1a细胞几乎不表达NKG2D配体,CD34+ CD38-KG1a细胞中NKG2D配体表达率显著低于K562细胞(P＜0.05);K562细胞中几乎不表达HLA-Ⅰ,CD34+ CD38-KG1a细胞高表达HLA-Ⅰ,CD34+ CD38-KG1a细胞中HLA-Ⅰ的表达率显著高于K562细胞(P＜0.05).结论 CD34+ CD38-KG1a细胞明显抵抗同种异体NK细胞的杀伤作用,其机制可能与高表达HLA-Ⅰ分子和低表达NK2D配体有关.