目的:探讨内皮细胞和血管组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的小泛素样修饰在糖尿病加速动脉粥样硬化中的作用。方法:2014年9月至2017年1月选取14周龄雄性健康Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）32只，按随机数字表法分为对照假手术组、对照动脉损伤组、糖尿病动脉损伤组和泛素结合酶9（UBC9）转染组，每组8只。制备1型糖尿病大鼠模型，各组均有1只大鼠造模失败被排除。采用超声仪检测损伤侧颈总侧动脉和健侧颈总动脉收缩期和舒张期内径、动脉内膜厚度，计算标化颈总动脉舒张期直径（sCADD）；采用HE染色和免疫组织化学染色检测内膜增殖情况，在中膜面积相当的情况下计算内膜面积与中膜面积比值。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在高糖中培养24 h后采用实时反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测白细胞介素（IL）-8和IL-1β mRNA表达水平，蛋白质印迹法检测动脉组织UBC9的表达水平，小泛素样修饰试剂盒检测PPARγ小泛素样修饰水平。体外培养HUVEC，检测在不同浓度和不同时间的高糖刺激下PPARγ小泛素样修饰水平。在体内和体外利用慢病毒过表达UBC9，再检测PPARγ小泛素样修饰水平。结果:对照假手术组、对照动脉损伤组和糖尿病动脉损伤组颈总动脉损伤8周后动脉内膜厚度、内膜增殖面积和内膜面积与中膜面积比值逐渐增加[（0.026 ± 0.018）、（0.084 ± 0.007）和（0.264 ± 0.022） mm，（0.18 ± 0.09） × 10 6、（0.32 ± 0.06） × 10 6和（1.64 ± 0.22） × 10 6 μm 2，0.345 ± 0.073、0.570 ± 0.080和2.710 ± 0.220]，sCADD逐渐降低（0.903 ± 0.084、0.800 ± 0.071和0.330 ± 0.036），差异有统计学意义（ F =10.40、9.40、8.20和8.60， P<0.05）。高糖培养HUVEC 24 h后，糖浓度10、20和40 mmol/L时IL-8 mRNA分别为1.00 ± 0.11、3.57 ± 0.22和4.07 ± 0.40，IL-1β mRNA分别为1.00 ± 0.07、3.32 ± 0.29和5.13 ± 0.19，差异有统计学意义（ F = 73.05和205.80， P<0.05）。糖尿病动脉损伤组动脉组织PPARγ小泛素样修饰水平和UBC9表达水平明显低于对照动脉损伤组（0.46 ± 0.25比1.00 ± 0.21和0.45 ± 0.02比1.00 ± 0.07），差异有统计学意义（ P<0.05）；两组PPARγ表达水平比较差异无统计学意义（0.94 ± 0.07比1.00 ± 0.04， P>0.05）。糖浓度10、20和40 mmol/L时UBC9表达水平和PPARγ小泛素样修饰水平逐渐降低（0.99 ± 0.05、0.80 ± 0.06和0.62 ± 0.05，1.00 ± 0.05、0.57 ± 0.13和0.55 ± 0.08），差异有统计学意义（ F = 21.02和14.31， P<0.05），PPARγ表达水平比较差异无统计学意义（1.00 ± 0.03、0.90 ± 0.04和0.91 ± 0.05， F = 3.11， P>0.05）。对HUVEC进行0、6、12、24、48 h的20 mmol/L高糖刺激后，UBC9表达水平和PPARγ小泛素样修饰水平逐渐下调（1.00 ± 0.09、0.75 ± 0.05、0.70 ± 0.08、0.38 ± 0.04和0.35 ± 0.03，1.00 ± 0.03、0.86 ± 0.01、0.59 ± 0.01、0.51 ± 0.11和0.35 ± 0.08），差异有统计学意义（ F = 36.06和33.13， P<0.05），但PPARγ表达水平比较差异无统计学意义（1.00 ± 0.03、1.14 ± 0.02、1.18 ± 0.17、0.98 ± 0.01和1.04 ± 0.05， F = 1.90， P>0.05）。在糖尿病大鼠动脉中过表达UBC9后，组织学分析结果显示，对照动脉损伤组、糖尿病动脉损伤组和UBC9转染组UBC9相对表达水平分别为1.53 ± 0.18、1.00 ± 0.22和3.62 ± 0.35，三组比较差异有统计学意义（ F = 5.64， P<0.05）。超声检测结果显示，对照动脉损伤组、糖尿病动脉损伤组和UBC9转染组颈动脉内膜厚度逐渐增厚[（0.077 ± 0.015）、（0.216 ± 0.007）和（0.125 ± 0.014） mm]，差异有统计学意义（ F = 27.18， P<0.05）。组织学分析结果显示，对照动脉损伤组、糖尿病动脉损伤组和UBC9转染组颈动脉损伤后内膜增殖面积分别为（0.335 ± 0.066） × 10 6、（1.053 ± 0.103） × 10 6和（0.544 ± 0.040） × 10 6 μm 2，内膜面积与中膜面积比值分别为0.630 ± 0.063、2.030 ± 0.052和0.930 ± 0.100，三组比较差异均有统计学意义（ F = 13.58和53.96， P<0.05）。 结论:高血糖下调HUVEC和大鼠动脉组织UBC9表达水平及抑制PPARγ小泛素样修饰的作用，揭示高血糖下调的UBC9和PPARγ小泛素样修饰水平是糖尿病加速动脉粥样硬化的重要机制。

目的:评价电针预处理对大鼠脑缺血再灌注时皮质Ubc9表达的影响。方法:清洁级健康雄性SD大鼠80只，8～12周龄，体重200～250 g，按照随机数字表法分为4组( n＝20)：假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I/R组)、电针预处理组(E组)和假电针组(SE组)。S组仅暴露颈部血管，不插入线栓阻闭；其余3组采用线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，栓塞2 h后拔出线栓恢复灌注。E组和SE组造模前5 d行电针刺激，E组选取百会穴(大鼠头顶部两耳连线中点)电针刺激，参数为2/12 Hz疏密波，强度1 mA，30 min/d，连续5 d，最后1次电针刺激24 h后造模，SE组选取刺激点为百会穴旁开1 cm，其余操作参数同E组。于再灌注24和48 h时行神经功能缺陷评分，随后处死大鼠取大脑皮质缺血半暗带组织，TUNEL法检测细胞凋亡情况并计算凋亡率，Western blot法检测Ubc9和结合状态小泛素样修饰蛋白(SUMO)2/3的表达。 结果:与S组比较，其余3组再灌注24和48 h时神经功能缺陷评分和皮质细胞凋亡率升高，Ubc9和结合状态SUMO2/3表达上调( P<0.05)；与I/R组和SE组比较，E组再灌注24和48 h时神经功能缺陷评分和皮质细胞凋亡率降低，Ubc9和结合状态SUMO2/3表达上调( P<0.05)。 结论:电针预处理减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的机制与进一步上调Ubc9表达，从而增强SUMO2/3化修饰有关。

目的:运用分子生物学方法观察小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-related modifier，SUMO）通路成员在骨肉瘤中的表达特点，为基于蛋白质SUMO化修饰的靶向治疗提供理论依据。方法:收集2017年1月至2019年6月于我院就诊并手术的新鲜骨肉瘤组织样本18例，经Western blot及免疫组织化学方法检测癌灶及癌旁SUMO通路核心成员SUMO1、SAE1、Ubc9、SENP1的蛋白表达水平。分别干涉SUMO1、干涉UBC9及过表达SENP1，进行如下分组：空白对照组、对照组、siR-SUMO1组、siR-Ubc9组和SENP1组。Western blot验证基因转染效率，细胞增殖检测试剂盒检测EdU的阳性表达率，划痕实验及Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力，流式细胞术检测细胞凋亡率。以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为研究对象，评估三种治疗方案的副作用。结果:Western blot及免疫组织化学结果均显示，骨肉瘤组织中SUMO1、SAE1、Ubc9的蛋白表达水平均明显高于癌旁组织（ P<0.05），但SENP1明显低于癌旁组织。基于143B骨肉瘤细胞的实验结果表明，siR-SUMO1组、siR-Ubc9组、SENP1组均能够明显抑制骨肉瘤细胞中SUMO通路的活化，表现为较对照组和无义组更低的肿瘤细胞增殖率（ P<0.05），更低的细胞迁移和侵袭能力（ P<0.05），以及更高的细胞凋亡率（ P<0.05）；然而基于BMSCs的实验结果表明，siR-SUMO1组和siR-Ubc9组能够明显抑制BMSCs的增殖，诱导细胞凋亡，表现出极大的治疗副作用，但SENP1组对BMSCs的增殖和凋亡几乎没有影响（ P>0.05）。 结论:SUMO通路在骨肉瘤中被异常激活，外源性补充或内源性激活SENP1是靶向治疗的备选方案之一。

目的 探讨泛素结合酶9(ubiquitin conjugating enzyme 9,UBC9)介导SUMO化修饰在同型半胱氨酸诱导巨噬细胞焦亡中的作用.方法 首先采用细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)法和Western blot检测不同浓度(0 μmol/L、50μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L 和 200 μmol/L)同型半胱氨酸对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的活力及焦亡的影响;采用Western blot检测不同组细胞中UBC9、SUMO化修饰蛋白SUMO-1、炎症因子IL-1β的表达水平;qRT-PCR检测干扰前后UBC9的mRNA表达,同时检测干扰UBC9后,UBC9、焦亡相关蛋白、IL-1β及SUMO-1相关表达.结果 当采用100 μmol/L的Hcy刺激后,巨噬细胞的活力影响最小且焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1表达最明显(P＜0.001);与Control组相比,Hcy组IL-1β的表达水平升高(P＜0.01),SUMO-1表达升高(P＜0.01);与Control组相比,Hcy组中UBC9蛋白水平及mRNA水平表达均增高(P＜0.05);转染si-UBC9后,与si-NC+Hcy 组相比,si-UBC9+Hcy 组 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、UBC9、SUMO-1 表达降低(P＜0.01).结论 同型半胱氨酸诱导巨噬细胞焦亡的发生,其机制与上调泛素结合酶9发生SUMO化修饰有关.

目的:探讨电针对慢性压迫性损伤(CCI)模型大鼠神经病理性疼痛的缓解作用及相关机制.方法:选取雄性SD大鼠40只,随机数字表法分为假手术组、模型组、电针组与电针+激活剂组,每组10只.构建慢性压迫性损伤(CCI)大鼠模型,并按组别进行相应干预.测定大鼠痛觉敏感性,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清中IL-1β、IL-6和IL-8表达水平,RT-qPCR检测大鼠脊髓中CRMP2、Ubc9 mRNA及Western bolting检测大鼠脊髓中坍塌反应调节蛋白2(CRMP2)、泛素结合酶9(Ubc9)蛋白水平.结果:CCI大鼠模型建成后,各组大鼠PWLD均显著升高且＞4 s,差异具有统计学意义(P＜0.05);在给予大鼠相应干预后,与假手术组比较,模型组大鼠患健侧PWLD显著升高,差异具有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,电针组和电针+激活剂组大鼠患健侧PWLD更低,差异具有统计学意义(P＜0.05);与假手术组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6和IL-8水平升高,差异具有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,电针组和电针+激活剂组大鼠血清IL-1 β、IL-6和IL-8水平降低,差异具有统计学意义(P＜0.05);与假手术组比较,模型组大鼠脊髓CRMP2、Ubc9 mRNA和蛋白表达水平更低,差异具有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,电针组和电针+激活剂组大鼠脊髓CRMP2、Ubc9 mRNA和蛋白表达水平更高,差异具有统计学意义(P＜0.05);电针+激活剂组各指标均优于电针组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:电针可有效缓解CCI模型大鼠神经病理性疼痛,其作用机制可能是电针刺激穴位后引起机体CRMP2、Ubc9表达水平增加,抑制炎症反应,诱导镇痛.

目的 通过诱导低氧诱导因子(HIF)-1α蛋白去类泛素化修饰降低子宫内膜癌干细胞的干性维持潜能,并增加其对化疗药物的敏感性.方法 利用慢病毒质粒介导基因转染沉默KLE子宫内膜癌细胞泛素载体蛋白9(Ubc9)表达,免疫印迹方法检测Ubc9、小泛素相关修饰蛋白(SUMO)-1和HIF-1α蛋白表达水平;96孔板中培养并计算肿瘤干细胞克隆形成率及克隆球直径;流式细胞周期术检测细胞周期变化;MTT细胞毒性实验和流式细胞凋亡方法检测Ubc9沉默对子宫内膜癌干细胞对化疗药物顺铂的治疗敏感性.结果 免疫印迹结果显示,Ubc9基因沉默效果良好,共价结合状态的SUMO-1及HIF-1α蛋白水平明显下降(P＜0.05);Ubc9基因沉默使子宫内膜癌干细胞克隆形成率由(31.61 ±5.29)％下降至(11.42±3.07)％,同时细胞周期由G1向G2期后移,顺铂IC50由44.37mg/L下降至7.39 mg/L,细胞凋亡率由(26.22±4.03)％下降至(41.59±5.37)％.结论 通过沉默Ubc9基因表达能够诱导HIF-1α蛋白去SUMO化修饰,进而降低子宫内膜癌干细胞干性维持能力,并增强其化疗敏感性,为未来子宫内膜癌的基因治疗提供了新的参考和借鉴.

Objective This study elucidated the function and role of SUMOylation in type Ⅰ endometrial carcinoma. Methods Fifty type Ⅰ endometrial carcinoma cases and para-cancer tissue samples were collected. The expression levels of ubiquitin-conjugating enzyme E2 I (Ube2i, Ubc9) and small ubiquitin-like modifier 1 (SUMO1)/sentrin-specific peptidase 1 (SENP1) proteins were examined using immunohistochemistry and the correlation with clinicopathological parameters was analyzed. Results Ubc9 expression in type Ⅰ endometrial carcinoma tissues was significantly higher than that in the para-cancer tissues; in contrast, the expression of the SENP1 protein was markedly lower than that in the para-cancer tissues. Ubc9 and SENP1 expression levels were negatively correlated and were associated with tumor differentiation, but not age, depth of invasion, tumor stage, and lymph node metastasis. Conclusion SUMOylation modification plays a major role in the pathogenesis and development of type Ⅰ endometrial carcinoma. Thus, it could be a potential target for the treatment of endometrial cancer.

卵巢上皮癌是常见的妇科肿瘤之一,由于缺乏有效的早期筛查手段,5年生存率较低,是病死率最高的妇科肿瘤.小泛素样修饰物(small ubiquitin-related modifiers,SUMOs)为一组类泛素蛋白,这类蛋白可与多种基因以共价结合的方式形成多种功能类型的底物蛋白[1],泛素结合酶9(ubiquitin-bind-ing enzyme 9,Ubc9)是SUMO过程中的唯一的结合酶[2],研究表明:Ubc9蛋白在多种肿瘤中表达上调,外源性下调Ubc9的表达可抑制肿瘤生长,可能成为肿瘤治疗潜在的基因靶点[3].p53是研究最多的肿瘤抑制基因之一,在肿瘤的发生及进展等过程中发挥着重要作用 [4].本研究以卵巢上皮癌为研究对象,分析Ubc9及P53在卵巢上皮癌中的表达情况及相关性,为卵巢癌的研究提供新的思路和实验依据.

目的 观察缺血缺氧状态下不同低温对人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)表达小泛素样修饰蛋白(SUMO)化相关蛋白的影响,探讨SUMO化在深低温停循环(DHCA)过程中对人神经系统的保护作用.方法 在18℃、26℃、30℃、37℃环境中进行4 h缺氧的细胞与正常培养细胞对比,观察细胞缺氧后形态,微板法检测再灌注24 h后培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平,WestemBlot检测缺氧后UBC9、SUMO1、SUMO2/3水平及再灌注24 h后caspase-3水平,qPCR检测缺氧后UBC9的mRNA表达情况.结果 LDH检测结果示,糖氧剥夺(OGD)4h使LDH漏出量显著增加,低温可减少LDH漏出(P＜0.05,n = 6). Western Blot结果显示,与37℃ OGD组相比,低温干预可上调结合态SUMO1表达,温度越低表达量越高,18℃组明显高于30℃组(P＜0.05,n = 6),但18℃组与26℃组差异无统计学意义(P＞0.05,n=6);低温干预可同时上调结合态及游离态SUMO2/3表达(P＜0.05,n = 6),但与37℃ OGD组相比,并不额外增加SUMO2/3蛋白结合游离比(P ＞0.05,n = 6);OGD和低温对UBC9蛋白表达影响均不显著(P＞0.05,n = 6);OGD损伤4h再灌注24h后Caspase-3蛋白水平明显上调,低温干预下调Caspase-3表达(P＜0.05,n = 6).qPCR结果显示,OGD和低温对UBC9蛋白表达影响均不显著(P＞0.05,n = 3).结论 细胞遭受缺血缺氧时,低温可增加SUMO蛋白整体表达水平,提高SUMO1蛋白结合能力,提高神经细胞抗缺血缺氧耐受能力.短时间缺血缺氧情况下,26℃和30℃的神经保护作用与18℃深低温效果相近.

SUMO化修饰具有广泛的功能,包括调控神经突触的形成和传递.神经突触和免疫突触共享某些特性,而蛋白激酶Cθ(protein kinase Cθ,PKCθ)是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)家族中唯一能在抗原刺激后定位于免疫突触中央超分子活化簇的一员.为了探讨SUMO化修饰对免疫突触的影响,该文采用“Ubc9融合介导的SUMO化修饰系统(Ubc9 fusion-directed SUMOylation system,UFDS)”方法检测Ubc9-PKCθ与SUMO的相互作用;应用体外定点突变技术构建多个SUMO化修饰位点突变的Ubc9-PKCθ;通过荧光显微镜观察Raji B-Jurkat T细胞之间的接触面.结果显示,Ubc9-PKCθ能被SUMO化修饰,且抗原刺激后能在免疫突触聚集;而当多个SUMO化修饰位点突变后,Ubc9-PKCθ的SUMO化水平显著下调,抗原刺激后虽然还是被招募到免疫突触上,但呈现弥散状态.综上所述,Ubc9融合表达时SUMO化修饰影响PKCθ在免疫突触的聚集.