目的:探讨不同粒径大小对γ辐照中脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）中胶原结构的影响以及辐照保护剂的有效性。方法:取同一供体的冻干皮质骨，依据Urist改良法制备不同粒径的（0.5~1.0 mm、1.2~2.8 mm、3.3~4.7 mm及5.7~7.0 mm）DBM样品，按照不同剂量分为：0 kGy、15 kGy、25 kGy及25 kGy（辐照保护剂），真空密封后储存于-80℃冰箱待用。通过扫描电镜观察胶原表面形态，大体观察胶原表面结构损伤的程度；将样品按照0.2 g/ml生理盐水比例在50℃条件下72 h，利用浸提液颜色深度观察胶原被辐照损伤的程度；使用2，4-二硝基苯肼（吸光光度计法）测定样品中羰基含量；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺钠凝胶电泳法（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）测定样品中胶原分子量的变化；利用差示热量扫描法（differential scanning calorimetry，DSC）检测样品热变性温度以观察胶原热稳定性。结果:样品浸提液颜色与γ辐照剂量相关度较高，未辐照样品浸提液颜色清亮，而在同粒径下随辐照剂量加大浸提液黄色逐渐加深，5.7~7.0 mm粒径组颜色相对较浅；25 kGy组相比于25 kGy+保护剂组浸提液颜色加深。扫描电镜观察到γ辐照导致胶原结构紊乱，纤维断裂，随着辐照剂量增大损伤区域增多，当粒径增大时，损伤区域有减少的趋势；相比于25 kGy组，25 kGy+保护剂组胶原结构性破坏减少。差示热量扫描法得出样品热交换曲线，随着粒径增大，热变性温度有增高的趋势，粒径间对比有统计学差异（ F=189.4， P<0.001）；同粒径间差异不明显。SDS-PAGE发现同粒径下γ辐照剂量愈大，胶原分子量愈小；同辐照条件下随粒径较小，高分子量胶原含量减少明显；225 kGy+保护剂组相比于25 kGy组，高分子量增多。羰基含量结果显示在同一粒径下，γ辐照使羰基含量增多，0.5~1.0 mm组（ F=13.631， P=0.002），1.2~2.8 mm组（ F=6.390， P=0.016），3.3~4.7 mm组（ F=5.630， P=0.023），5.7~7.0 mm组（ F=4.150， P=0.048）的差异均有统计学意义，不同粒径间随着粒径增大羰基含量逐渐减小但差异统计学意义（ F=0.560， P=0.650）。 结论:γ辐照与胶原的氧化损伤具有明显的剂量反应关系，随着γ辐照剂量的增加，胶原损伤程度逐渐增加；DBM的粒径大小影响着胶原对γ辐照的敏感度，随着粒径的减小，DBM颗粒更易被γ辐照损伤；辐照保护剂在辐照过程中对胶原有一定程度的保护作用。

目的:研究羔羊胃维生素B12胶囊原料药的药效物质基础。方法:用0.9%氯化钠溶液提取，通过饱和硫酸铵沉淀，采用二乙基氨乙基纤维素52和高压液相色谱(HPLC)方法分离、纯化凝乳酶和胃蛋白酶。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相色谱-串联质谱测定相对分子质量。用HPLC分析原料药的氨基酸组成和抗氧化活性。依次用水、磷酸盐缓冲液和碳酸氢钠完全提取原料药，并进行体外1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐自由基消除活性测定。利用热水提法提取原料药中的糖蛋白，测定其对青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、粪肠球菌的促生长活性，分别用HPLC和气相色谱-质谱方法分析其氨基酸和单糖组成。结果:纯化得到2种不同离子强度的凝乳酶F6-2、F7-2和胃蛋白酶F7-1的酶活力分别为27 557.10、17 532.60和17 728.15 U/g；SDS-PAGE分析显示3种酶的相对分子质量相似，为35 000~40 000。原料中含有16种氨基酸，其中疏水性氨基酸占总氨基酸含量的33.03%。当样品浓度为5 g/L时，3种提取物的ABTS自由基清除活力分别为(37.80±0.45)%、(23.20±0.78)%、(62.80±0.74)%; DPPH自由基清除活力分别为(57.87±0.55)%、(5.03±0.25)%和(26.67±3.10)%。糖蛋白提取物对青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、粪肠球菌均有促生长作用，其中对德氏乳杆菌保加利亚亚种和粪肠球菌的促进作用差异均有统计学意义( P均<0.05)。糖蛋白的蛋白质链由15种氨基酸组成，多糖链由葡萄糖和乳糖2种单糖组成。 结论:利用多种色谱方法从羔羊胃原料药中分离、分析到至少2种凝乳酶和1种胃蛋白酶成分；原料药富含抗氧化活性成分；羔羊胃中糖蛋白成分具有体外促益生菌生长活性。

目的 探讨茶多酚对长波紫外线(ultraviolet A,UVA)、中波紫外线(ultraviolet B,UVB)所致人皮肤成纤维细胞(human skin fi-broblasts,HSF)急性光损伤的防护作用及其对Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶mRNA表达的影响.方法 不同浓度茶多酚(0、2.5、5、10、20和40g/ml)孵育HSF细胞24h,MTT法检测各细胞增殖活性,筛选适宜浓度茶多酚;将HSF细胞分为空白组、药物组、UVA照射组、UVB照射组、UVA+茶多酚组、UVB+茶多酚组,采用27'-二氯荧乙酰乙酸盐(2'7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平,酶生化法测定各组乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放水平,单细胞凝胶电泳法检测DNA损伤情况,采用实时荧光定量PCR(Quantita-tive Real-time PCR,qRT-PCR)检测核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信号通路下游各Ⅱ相解毒酶mRNA的表达情况.结果 茶多酚浓度为5 μg/ml时,对HSF细胞增殖活性无明显影响,故后续实验采用5μg/ml浓度.与空白对照组相比,UVA及UVB照射组ROS水平、LDH释放水平明显升高,DNA损伤加重;与单纯光照组相比,加茶多酚预处理后行光照组ROS水平、LDH释放水平降低,DNA损伤减轻,差异具有统计学意义(P＜0.05);与空白对照组相比,药物组过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(γ-glutamyl eystine ligase catalytic subunit,GCLC)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(γy-glutamyl cystine ligase modulatory subunit,GCLM)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、醌氧化还原酶1(Nui-none oxidoreductase 1,NQ01)的mRNA表达均增加(P＜0.05).结论 茶多酚能有效清除ROS,降低LDH水平,减轻DNA损伤,防护UV致HSF细胞急性光损伤,机制可能与其促进Ⅱ相解毒酶及抗氧化物酶mRNA表达相关.

目的:通过蛋白质组学筛选和验证肾透明细胞癌中潜在肿瘤标志物.方法:采用比较蛋白质组学方法筛选正常肾组织和肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)组织中的差异表达蛋白,通过二维差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)和傅里叶变换离子回旋共振质谱(Q-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry,FT-ICR MS)分离并鉴定16例RCC组织及其相应的正常组织中差异显著的蛋白,并进一步通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、Western印迹和免疫组织化学在RNA和蛋白水平进行验证.结果:通过2D-DIGE共筛选出1 873个蛋白质点,选取68个表达差异大于1.5倍的蛋白质点进行鉴定,成功鉴定出51个蛋白质(P＜0.05),其中16个蛋白表达上调,35个表达下调.采用qRT-PCR和Western印迹验证16例肿瘤和对照组织,结果表明在肿瘤组织中NNMT和Annexin Ⅳ表达显著升高,而ACY1和Calbindin显著下调(P＜0.01).同时针对ACY1和Annexin Ⅳ蛋白分别在53例和47例样本中进行免疫组织化学,结果显示相较于对照组织,ACY1在肾透明细胞癌中表达显著降低(P＜0.001),而Annexin Ⅳ显著升高(P＜0.001).结论:ACY1和Annexin Ⅳ可作为肾透明细胞癌的肿瘤标志物.

目的 分析结直肠癌(CRC)组织和正常癌旁组织之间的差异表达蛋白质,探讨其与CRC疾病特征的关系. 方法 应用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳法(2D-PAGE)分析12例配对CRC组织和正常癌旁组织之间的差异表达蛋白,并运用激光解吸电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)和MS/MS法对差异表达的蛋白质标记点进行鉴定和分析.找出CRC组织中表达上调的蛋白脯氨酰-4-羟化酶(P4HB)β亚单位作为兴趣蛋白后,通过Western-blot验证,并运用免疫组织化学技术检测P4HB在CRC中的表达情况,分析其与CRC的临床病理特征及预后的关系. 结果 2D-PAGE分析和MALDI-TOF-MS鉴定结果显示,CRC组织中 P4HB表达丰度比正常黏膜组织上调2.01倍(P<0.01).Western-blot结果显示,CRC组织中P4HB的表达水平明显高于其配对的正常黏膜组织[(1.36 ± 0.54)vs(0.74 ± 0.35)](P<0.05).P4HB蛋白在CRC组织、腺瘤组织和正常黏膜组织中的表达阳性率依次减低,分别为43.85%(82/187),19.35%(12/62)及12.67%(19/150),三者间的差别均有统计学意义(P<0.001).P4HB蛋白表达与CRC的TNM分期(P=0.003)、肿瘤分化程度(P=0.020)、肿瘤大小(P<0.001)有关,而与患者的性别(P=0.880)、年龄(P=0.464)及肿瘤部位(P=0.293)无关.Log-rank检验结果显示,在CRC患者中,P4HB表达阳性组与阴性组的生存时间差别无统计学意义(P=0.110). 结论 CRC组织中P4HB表达上调,这与CRC更晚的分期、低分化及较大的肿瘤相关.

目的 探讨薤白皂苷化合物对血小板活化和聚集作用的影响,探讨薤白皂苷化合物处理后的血小板差异表达的蛋白质.方法 采用流式细胞术及血小板聚集仪测定阿司匹林及不同剂量薤白皂苷化合物对二磷酸腺苷(ADP)诱导的大鼠血小板膜糖蛋白CD62P表达水平以及血小板聚集率的影响.分离对照组及最优剂量组处理的血小板并提取蛋白质,采用二维凝胶电泳分离并行基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-TOF)分析,采用Mascot软件搜索数据库,鉴定差异表达蛋白质.结果 (1)薤白皂苷高剂量组显著抑制ADP诱导的大鼠血小板膜糖蛋白CD62P表达和血小板聚集,且抑制作用呈一定量效趋势;(2)筛选出30个差异蛋白,并质谱成功鉴定7个:Calreticulin、Actin、LIM and SH3 domain protein 1、RCG55135、Protein phosphatase 1、Suppressor of IKBKE 1、Ribulose-5-phosphate-3-epimerase.结论 薤白皂苷显著抑制ADP诱导大鼠活化及聚集,差异蛋白Calreticulin、Actin、LIM and SH3 domain protein 1、RCG55135、Protein phosphatase 1、Suppressor of IKBKE 1、Ribulose-5-phosphate-3-epimerase可能在薤白皂苷抗血小板活化及聚集过程中起关键作用.

目的:通过分析脾胃湿热证模型大鼠血清蛋白质的差异表达,从蛋白质组学角度探讨脾胃湿热证的证候实质.方法:应用血清蛋白质组学、生物信息学等系统生物学方法,采用二维凝胶电泳(2-DE)分离技术分离脾胃湿热证模型大鼠血清蛋白质,获得差异表达蛋白质,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TrOF-MS)和数据库鉴定差异表达蛋白质.结果:发现12个具有明显表达差异的蛋白质斑点,经鉴定可以确定的9个蛋白质分别是备解素B因子、凝血因子Ⅱ、C-反应蛋白、alpha-胰蛋白酶抑制剂重链H4、载脂蛋白AI、重组人载脂蛋白AI、血小板凝血酶敏感蛋白、α-巨球蛋白、补体3.结论:筛选出来的差异表达蛋白质主要涉及机体免疫、物质代谢、炎症反应及血液流变学等,通过对脾胃湿热证模型大鼠蛋白质组差异表达的研究,从理论和技术的角度为运用蛋白质组学对脾胃虚实证候实质的深入研究提供了借鉴.

目的 研究细胞因子信号抑制物1(SOCS1)在超负荷心室乳头肌中的表达,了解其在心室乳头肌承载负荷后结构重建中的表达特点以及在影响细胞信号转导的立方水母毒素-1(CfTX-1)预处理作用下的生物力学特性.方法 昆明小鼠腹主动脉-静脉穿刺造瘘(n=5),2周后取心室乳头肌匀浆后提取总蛋白,另设正常组(n=5)施假手术作对照.离体培养则采用正常小鼠左心室乳头肌(n=20),负荷培养组心室乳头肌倍比牵拉固定于硅胶板,松弛培养组不予牵拉负荷,两组内均另设一个组添加SOCS1质粒转染.上述各组心室乳头肌均于培养液中37℃培养3 d后,匀浆并提取总蛋白,10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白,以含SOCS1的23 ku条带为目标条带,计算机图像法测其积分光密度(IOD)值.采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测SOCS1蛋白的表达,并测其印迹IOD值.采用微分定位器牵拉造瘘小鼠心室乳头肌至初始负荷为1 g,待稳定后顺序瞬间牵拉15 mm,观察第1次及第5次牵拉时的被动张力特性曲线,计算心室乳头肌在任氏液及CfTX-1预处理后的最大被动张力(PTmax)和最大被动张力下降速度(DV).结果 造瘘组心室乳头肌总蛋白中23 ku条带及SOCS1印迹IOD值均高于正常组,差异均具有统计学意义(均P<0.01).松弛转染培养组心室乳头肌总匀浆液中23 ku条带的IOD值显著高于负荷转染及负荷非转染培养组,差异均具有统计学意义(均P<0.01),且后两组间差异无统计学意义(P>0.05).负荷转染培养组心室乳头肌总匀浆液以及胞核匀浆液中SOCS1印迹IOD平均值均高于负荷非转染培养组和松弛转染培养组,差异均具有统计学意义(均P<0.01).造瘘组心室乳头肌的PTmax和极限PTmax均低于正常组,DV高于正常组,而极限DV低于正常组,差异均具有统计学意义(均P<0.01).结论 SOCS1的表达对长度负荷较为敏感,其作为超负荷敏感信号在改善心肌适应性、保护心肌结构及维护舒缩功能方面具有更深层的积极作用.CfTX-1对改善心室乳头肌顺应性也具有积极作用.

目的 研究淫羊藿苷基于成骨细胞和破骨细胞蛋白质组学的抗骨质疏松作用机制.方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞的增殖,ELISA法测定碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性,茜素红染色观察成骨细胞骨矿化结节的形成,以骨片上形成的骨吸收陷窝的数目和面积表征破骨细胞的骨吸收活性,以二维凝胶电泳观察成骨及破骨细胞蛋白质组的变化,应用TOF/MS/MS对差异表达的蛋白进行鉴定.结果 淫羊藿苷显著增加成骨细胞的骨形成,抑制破骨细胞的骨吸收,上调或下调成骨和破骨细胞各9个蛋白的表达.结论 淫羊藿苷通过参与能量代谢、氧化应激、嘌呤合成和细胞生长分化的等生物学过程调控骨代谢.

[目的]探讨肺腺癌患者和健康志愿者尿蛋白质差异表达谱,寻找具有诊断价值的生物标志物.[方法]选取肺腺癌患者的尿标本13例,以22例健康志愿者尿标本作为对照组,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)技术和MS-Thermo-Orbitrap-Velos质谱对肺腺癌患者和健康志愿者尿进行蛋白质组学比较.采用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)验证质谱结果.应用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评估差异蛋白的临床价值.[结果]表达谱共鉴定出365个差异表达蛋白质,表达上调蛋白质185个、表达下调蛋白质180个,筛选出凝血与免疫通路相关蛋白质10个,ROC分析发现纤维蛋白溶酶原(plasminogen,PLG)和纤维蛋白原γ(Fibrinogen gamma chain,FGG)的敏感性和特异性均＞80％,且曲线下面积(area under curve,AUC)＞0.8.ELISA法实验结果与质谱结果趋势一致,FGG、PLG作为联合检测项目鉴别肺腺癌与健康人群的AUC为0.947,相对单一检测项目FGG(0.844)和PLG(0.934)的诊断效能更高(P＜0.05).但是,肺腺癌患者尿中FGG、PLG表达水平与患者的年龄、性别、吸烟、临床分期均无关.[结论]尿中FGG与PLG可以作为辅助肺腺癌诊断的标志物,但其与肺腺癌的各项临床参数之间无明显联系,需要进一步扩大样本进行分析.