目的 调查多哥冈比亚按蚊(Anopheles gambiae s.l.)中kdr和ace-1的等位基因突变,为该地区蚊媒传染病防制提供科学依据.方法 蚊虫样本采集自多哥2个疟疾高发地区东莫诺(Est-mono)和阿涅(Anié)的6个村庄.所有蚊虫均用于蚊种鉴定以及kdr和ace-1基因分型.结果 An.coluzzii和An.gambiae是在6个采集地点发现的2个冈比亚按蚊复合组中的近缘物种,其中An.gambiae占主导地位,占比约为96.53%.在所有检测到的蚊虫样品中,冈比亚按蚊复合组在kdr 1014位点具有高频率的突变,其中An.gambiae在奥古库利代(Ogou koulidé)、巴纳(Bana)、阿福莱(Afolé)地区突变频率达到100.0%,凯普西(Kepssi)、伊格博梅吉(Igbomedji)的突变频率为97.5%,科洛科佩(Kolocopé)地区突变频率为91.1%,1014F的等位基因频率为85.5%～100.0%,3个地区的An.coluzzii 1014位点的突变频率均为100.0%,1014F的等位基因频率为90.0%～100.0%,突变纯合度较高.An.gambiae在kdr 1575的突变频率为6.6%～24.3%,1575Y的等位基因频率为3.2%～12.2%,所有检测到的突变类型均为杂合突变,An.coluzzii的1575位点未检测到突变.冈比亚按蚊复合组在ace-1基因的119位点也检测到了突变,其中An.gambiae的突变频率为8.8%～15.0%,119S等位基因频率为4.4%～7.5%,An.coluzzii的突变频率为0～20.0%,119S等位基因频率为0～10.0%,所有检测到的119S突变均为杂合突变.结论 由于本研究中检测到的多哥冈比亚按蚊kdr突变频率很高,疟疾蚊媒可能对拟除虫菊酯类杀虫剂已产生高度抗性,同时可能对有机磷或氨基甲酸酯类杀虫剂也产生一定的抗性.提示当地相关病媒管理部门在今后的疟疾病媒控制及耐药性管理规划中应着重考虑杀虫剂耐药问题,并定期进行监测.

[目的]在全基因组上鉴定中华按蚊Anopheles sinensis血红素过氧化物酶(heme peroxidase,HPX)家族基因,并预测其基本特征,探究双翅目中5种代表性昆虫HPX基因的系统发育关系和进化.[方法]以NCBI数据库中黑腹果蝇Drosophila melanogaster和家蚕Bombyx mori等昆虫HPX基因编码的氨基酸序列为询问序列,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组上HPX家族基因,并鉴定了冈比亚按蚊Anopheles gambiae、致倦库蚊Aedes aegypti和埃及伊蚊Culex quinquefasciatus基因组上的HPX基因;基于冈比亚按蚊HPX基因的命名系统,对中华按蚊HPX基因进行命名;运用生物信息学方法预测了中华按蚊HPX基因的特征,包括基因的结构及在scaffold的定位,氨基酸的替换率和保守结构域,蛋白质3D结构等,通过与冈比亚按蚊共线性分析定位了中华按蚊HPX基因在染色体上的位置;基于HPX核苷酸序列,采用PAUP4.0和MEGA6.0软件利用最大相似法构建了5个双翅目代表性种HPX基因的系统发生树.[结果]中华按蚊基因组共有20个HPX基因,冈比亚按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊基因组分别有18,14和12个HPX基因.这4种蚊虫的HPX蛋白都被分类进入Peroxinectin,Peroxidasin,DBLPX和DUOX 4个亚家族,其氨基酸的分子量介于61.6～186.6 kD之间(除AsHPX8为29.6 kD).中华按蚊20个HPX基因共具有98个外显子,75个内含子,其外显子与内含子分布模式在基因间差异较大.中华按蚊HPX基因被定位到10个scaffold上,对应到冈比亚按蚊的2R,3R,2L,3L和X染色体.这些中华按蚊HPX基因编码的氨基酸序列(除DUOX)都具有1个血红素结合位点和5个Ca2+结合位点,在N端和C端各具有2个半胍氨酸位点并界定了两个二硫键.中华按蚊与冈比亚按蚊同源基因对的ω值都小于1,说明HPX基因在进化过程中没有受到明显的环境选择压力.系统发育关系研究表明,5种双翅目昆虫的HPX基因可以分为16个组,其中11个组在进化上呈明显的单系,具有至少83％的bootstrap支持.[结论]本研究提供了中华按蚊的HPX基因的基础信息.不同蚊虫种具有相似分子量的HPX蛋白,这与HPX家族蛋白结构的高度保守性有关.蚊虫的DUOX随着主要功能位点的缺失逐渐失去其功能,这与其特殊环境适应相关.DBLPX亚家族的peroxidase结构域在HPX家族所有亚家族中是最保守的.

[目的]利用计算机模拟技术,对冈比亚按蚊Anopheles gambiae犬尿氨酸甲酰胺酶(kynurenine forrnamidase,KFase)的潜在抑制剂进行虚拟筛选,以获得可以削弱冈比亚按蚊作为中间宿主传播疟疾等蚊媒疾病的候选杀蚊剂.[方法]下载冈比亚按蚊KFase的氨基酸序列,通过BLAST方法查询不同物种中的同源蛋白质,并利用MEGA6最大似然法(maximum likelihoodmethod)构建进化树,选择适于作为模板的同源蛋白黑腹果蝇Drosophila melanogaster KFase晶体结构(PDB ID:4E14),对冈比亚按蚊KFase进行三维建模.利用随机森林算法对小分子化合物数据库进行筛选,并对筛选结果进行处理,模拟自然条件下有机小分子与冈比亚按蚊KFase的结合以及分子对接,从而筛选出冈比亚按蚊KFase的潜在抑制剂.[结果]获得3个小分子化合物与冈比亚按蚊KFase结合的亲和能较低,分别是:N-(2,4-diketo-1H-pyrimidin-6-yl)-2-fluoro-benzamide;3-(4-fluorophenyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylic acid;N-(2-oxo-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-b] pyridin-5-yl)-succinamic acid.它们与冈比亚按蚊KFase结合的亲和能分别为:-9.0,-8.7和-8.9 kcal/mol.[结论]N-(2,4-diketo-1H-pyrimidin-6-yl)-2-fluoro-benzamide,N-(2-oxo-2,3-dihydro-1 H-imidazo[4,5-b] pyridin-5-yl)-succinamic acid和3-(4-fluorophenyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylic acid是冈比亚按蚊犬尿氨酸甲酰胺酶的潜在竞争性抑制剂,这些化合物是否可作为杀蚊剂的候选化合物有待实验验证.

AaCPR100A是本实验室从埃及伊蚊RNAseq数据库中获得的预测与表皮结构相关的基因.本文拟通过生物信息学和分子生物学技术,探究埃及伊蚊表皮AaCPR100A基因的序列特点,并分析其在埃及伊蚊的时空表达特征.埃及伊蚊表皮AaCPR100A蛋白序列AaCPR100A ORF长度为765 bp,编码254个氨基酸,蛋白分子量约为28.6 kDa,1～16位氨基酸残基为信号肽,其氨基酸序列中含有表皮蛋白CPR家族中的RR-1基序.埃及伊蚊与白纹伊蚊、 致倦库蚊、 冈比亚按蚊和黑腹果蝇的氨基酸同源性分别为95％、72％、61％、54％.qRT-PCR结果显示AaCPR00A基因在表皮和卵期表达量最高,并随发育阶段呈现显著递减变化.结果表明,埃及伊蚊AaCPR100A表达具有时空和组织特异性特征.

[目的]对MDCht9基因进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得重组蛋白,并测其酶学活性.[方法]构建邻位连接树研究MDCht9基因的分类归属及其与黑腹果蝇、冈比亚按蚊和致倦库蚊几丁质酶的进化关系,采用生物信息学软件,分析MDCht9基因及编码蛋白的理化性质,信号肽、二级结构等,预测蛋白质的功能;根据其cDNA序列设计引物,PCR扩增,以pET28(+)为载体构建重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中,异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,质谱鉴定纯化蛋白.几丁质酶活测定:以4MU-(GlcNAc)3为底物,测定重组蛋白的酶学活性.[结果]系统发育树表明MDCht9基因与果蝇Cht9基因同源性最高,其ORF全长1 401 bp,编码466个氨基酸,理论分子量为50 827.2 Da,等电点为6.97,属于亲水性蛋白.MDCht9基因编码蛋白的第1-22氨基酸为信号肽,剪切位点位于第22与第23位氨基酸之间.MDCht9蛋白的功能结构域位于第24-357位氨基酸间,是18家族几丁质糖基水解酶的催化域,第413-466位氨基酸之间的序列为几丁质结合区域.MDCht9蛋白的二级结构及三级结构显示有3种类型:以无规则卷曲为主(Cc),其次为α-螺旋(Hh)和β折叠(Ee).构建了具有正确序列的MDCht9重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达;通过亲和层析柱纯化的重组蛋白质谱鉴定,与MDCht9序列一致,提示MDCht9重组蛋白获取成功.酶学活性表明不同浓度的MDCht9重组蛋白均有几丁质酶活性,而且呈现一定的量效关系,0.18 mg/mL重组蛋白的4 MU生成量为53.63 U,0.045 mg/mL重组蛋白的4 MU生成量为9.97 U.[结论]采用原核表达系统成功获得MDCht9的重组蛋白,且重组蛋白有较强的酶活性,为进一步研究其功能奠定了基础.

[目的]麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是一种典型的专性滞育昆虫,滞育过程中经历酷暑和严寒.本研究旨在探讨麦红吸浆虫热激蛋白基因Hsp40在滞育中的作用.[方法]以麦红吸浆虫滞育前幼虫为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆Hsp40全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR技术分析其在滞育不同阶段幼虫及越夏滞育幼虫在短期(≤120 min)极端高温(35 ～ 50℃)和越冬滞育幼虫在短期极端低温(0～-15℃)胁迫下的表达模式.[结果]克隆获得麦红吸浆虫Hsp40基因,命名为SmHsp40(GenBank登录号:MH001167),其cDNA全长1 553 bp,开放阅读框长为1 074 bp,编码357个氨基酸,相对分子量为40.87 kD,理论等电点为5.31.推导的氨基酸序列中含有Hsp40蛋白家族典型的J结构域和HPD基序.蛋白序列相似性和系统进化关系分析表明,SmHsp40蛋白与冈比亚按蚊Anophelesgambiae等长角亚目(Nematocera)昆虫Hsp40的相似性最高、亲缘关系最近.麦红吸浆虫滞育不同时期幼虫SmHsp40表达量存在显著差异,进入滞育后表达量上调;滞育进程中,夏季7-8月和冬季12月至翌年1月表达量显著高于其他季节.与未处理的对照相比,40℃处理越夏滞育幼虫和-10℃处理越冬滞育幼虫lh明显诱导SmHsp40的表达,但超过45℃或低于-15℃极端温度处理诱导效果均不明显.[结论]SmHsp40参与了麦红吸浆虫滞育进程,可能在滞育状态的维持及滞育期间耐热和耐寒能力的调控方面起重要作用.

内向整流钾离子通道(inwardly-rectifying potassium channels,Kir)在动物体内承担着重要的生理功能.有关昆虫Kir的研究虽然不多,但近5年来却取得许多重要进展,本文就昆虫Kir近年来的研究进展进行评述.目前对昆虫Kir的研究主要集中在双翅目与半翅目,对基因组的分析以及基因克隆研究表明,昆虫Kir基因数量较少,远低于哺乳动物.双翅目的冈比亚按蚊Anopheles gambiae与埃及伊蚊Aedes aegypti有5～6个Kir基因,黑腹果蝇Drosophila melanogaster仅3个Kir基因,半翅目的褐飞虱Nilaparvata lugens与热带臭虫Cimex lectularius也只有3个Kir基因,而大豆蚜Aphis glycines的Kir基因数则减少到2个,第3个Kir基因的丢失可能与其马氏管的退化有关.系统进化分析表明昆虫Kir具有3个亚家族,但与哺乳动物的7个Kir亚家族没有直系同源关系.尽管如此,昆虫Kir具有与哺乳动物Kir类似的基本结构特征:由4个亚基组成四聚体通道,每个亚基具有2个跨膜区(TM1与TM2),TM1与TM2之间具K+选择过滤序列.昆虫的Kir基因主要在唾液腺与马氏管中高水平表达,Kir抑制剂可阻断唾液腺与马氏管的分泌活性,从而影响昆虫的取食与排泄活动并使昆虫致死,说明这2类组织器官的分泌活性与Kir有关,Kir介导的K+跨膜转运驱动了这类组织中上皮细胞的分泌活动.更为重要的发现是氟啶虫酰胺对褐飞虱Kir具有很高的阻断活性,并影响其唾液分泌与排泄功能,证明了Kir就是该杀虫剂的分子靶标.最后本文还对昆虫Kir研究中存在的科学问题进行了分析,展望了开发靶向Kir的新型杀虫剂的研究前景.

[目的]Toll信号通路是昆虫天然免疫系统的重要组分,其中Toll受体在激活昆虫病原菌侵染免疫应答方面发挥了关键作用.本研究旨在探究斯氏按蚊Anopheles stephensi Toll受体基因在抵抗微生物侵染和维持肠道菌群稳态过程中的功能.[方法]根据冈比亚按蚊Anopheles gambiae Toll受体家族的蛋白氨基酸序列,通过序列同源比对鉴定斯氏按蚊中相应的Toll受体基因;运用荧光定量PCR检测Toll受体基因在未感染病原菌的斯氏按蚊脂肪体中的相对表达量,以及在真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana和革兰氏阴性细菌胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp.carotovora侵染斯氏按蚊过程中的表达变化;最后,在斯氏按蚊雌成蚊胸部显微注射As Toll1A和AsToll5A的双链RNA进行RNA干扰后,检测RNAi处理的斯氏按蚊受真菌侵染后的存活率、肠道细菌含量变化以及抗菌肽基因表达变化.[结果]在斯氏按蚊中共鉴定到8个Toll受体基因,即As TollA,AsToll5A,AsToll6,AsToll7,AsToll8,AsToll9,AsToll1O和As Toll11.通过荧光定量PCR检测发现,未感染病原菌的斯氏按蚊雌成蚊脂肪体中AsToll5A表达量最高,As TollA表达量次之,其余Toll受体基因表达量极低.在球孢白僵菌和胡萝卜软腐欧文氏菌侵染过程中,与对照(注射PBS)比较,As Toll1A和As Toll5在斯氏按蚊中的表达量显著升高,其余Toll受体基因表达变化不显著或降低.RNA干扰结果表明,As TollA或AsToll5A的表达受到抑制后,斯氏按蚊对球孢白僵菌的抵抗能力显著降低,肠道细菌总量与对照(dsGFP)比较显著增多.而且,抑制As Toll1A后抗菌肽基因DEF1和GAM1的表达受到显著抑制;抑制AsToll5A后仅有GAM1表达量下调.[结论]斯氏按蚊Toll受体在结构和功能上具有高度的保守性,其中As TollA和AsToll5A能响应病原真菌和革兰氏阴性细菌侵染并且影响肠道菌稳态.

目的 对斯氏按蚊MyD88基因进行生物信息学分析,并研究其在抗约氏疟原虫感染中的作用.方法 首先,通过VectorBase数据库获取斯氏按蚊MyD88基因cDNA序列,并利用VectorNTI、DNAMAN等软件对MyD88基因cD-NA序列进行生物信息学分析.然后,根据MyD88的cDNA序列设计Real-time PCR引物,提取斯氏按蚊总RNA,通过反转录合成cDNA,利用Real-time PCR方法检测MyD88基因在蚊各个生活史阶段转录水平情况及其在约氏疟原虫感染后的转录水平变化.结果 斯氏按蚊MyD88基因位于斯氏按蚊KB664619号染色体155 163～158 066 bp的反义链上,包含两个外显子,其cDNA全长1 383 bp,编码460个氨基酸.系统发育树结果显示,斯氏按蚊与大劣按蚊和冈比亚按蚊系统发育的距离近,其氨基酸序列同源性达79％.对斯氏按蚊各时期MyD88基因转录水平的研究结果显示,吸食正常血和感染血均能够上调MyD88的转录,吸血后3d和5d吸感染血组MyD88基因转录水平上调明显,显著高于正常血组和未吸血组.结论 本研究证实了Toll信号通路中的MyD88基因在蚊抗疟原虫感染的天然免疫中发挥了重要作用,在感染后3d时作用明显.

目的 嗅觉系统在蚊虫吸血和寻找产卵地等活动中发挥着十分重要的作用.该研究对白纹伊蚊吸血前后气味受体(odorant receptors,ORs)OR10基因的表达水平进行探讨.方法 通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增白纹伊蚊OR10,采用荧光定量PCR检测雄蚊、吸血雌蚊和未吸血雌蚊OR10基因的表达量.结果 扩增获得OR10基因的开放阅读框全长为1 128bp,编码376个氨基酸.与埃及伊蚊和冈比亚按蚊的OR10基因的氨基酸序列一致性分别为86.13％和69.69％.荧光定量PCR发现雄蚊OR10基因的表达量最低为1,雌蚊OR10基因的表达量为1.535±0.274,高于雄蚊,吸血后的雌蚊OR10基因的表达量最高,为2.284±0.203,且未吸血与吸血后的雌蚊OR10基因的表达量差异有统计学意义(F=32.067,P=0.001).结论 白纹伊蚊吸血前后气味受体OR10基因表达水平差异有统计学意义,进一步辅证了OR10蛋白可能参与蚊虫吸血后寻找产卵地的行为.