遗传性视网膜变性(IRD)发病机制复杂多样，常常导致不可逆盲，目前尚缺乏有效的治疗方法。近年来，针对IRD的基因治疗显示出广阔的应用前景，而如何将基因药物递送至靶细胞并安全、高效地表达成为目前研究发展的关键点。病毒载体系统转染效率较高，但具有潜在的免疫反应和生物安全等问题，其临床应用的局限性使非病毒载体系统的开发应运而生。DNA纳米复合体是新型非病毒载体的研究热点之一，这种聚合物/DNA复合物纳米粒子由多肽、脂质、多糖等物质压缩和包裹DNA而成，在IRD的应用上取得了较大的进展。此外，非病毒载体在成本、制备难易度、包装容量及安全性上均显示出其优势，为视网膜色素变性、Stargardt病、先天性视网膜劈裂、Leber先天性黑矇等IRD的基因治疗提供了新的研究思路。本文对近年来非病毒载体系统在转染效率、靶向性和安全性等方面的进展及其在IRD基因治疗中的应用进行综述。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。

目的:为纳米材料在航海食品保鲜中的应用提供理论依据。方法:通过对国内外研究现状和结果的分析、总结，综述了复合纳米包装膜材料和复合纳米涂膜材料在蔬果和动物性食品保鲜以及军事食品中的应用效果以及目前存在的一些应用问题。结果:纳米材料在食品保鲜中具有良好的效果，尤其是在抗菌抑菌、氧化分解乙烯、抑制蔬果呼吸等方面得到业界的肯定。目前应用较多的仍为蔬果类，纳米材料在动物性食品保鲜以及军事食品的应用上也有一定价值，其相应产品有待开发。结论:纳米材料保鲜技术的研究目前处于起步阶段，还有存在一些问题。通过进一步研究改进，纳米材料保鲜技术会成为食品保鲜技术的发展趋势。

外泌体是由细胞释放到细胞外环境的、直径为30~100 nm的脂质双层膜小囊泡，存在于几乎所有体液中。外泌体携带大量蛋白质、DNA和RNA等，参与细胞间物质的交换与信号的转导。在EB病毒相关性肿瘤中，外泌体是EB病毒microRNA（miRNA）重要的运载体和储存库，协助病毒成分在宿主体内传递，促使肿瘤形成。本文综述复习近年发表的相关文献，主要介绍外泌体的合成、选择性包装递送miRNA的机制以及外泌体miRNA在EB病毒相关性肿瘤中的作用，为EB病毒相关性肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)LOC101927476在卵巢癌细胞中的表达及其对卵巢癌生物学特征的影响。方法:选取2018—2019年于中国医学科学院肿瘤医院手术治疗的卵巢癌患者。采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测卵巢癌细胞系3AO、OVCA429、TOV21G、A2780、SKOV3以及22例卵巢癌原发瘤和转移瘤组织中LncRNA LOC101927476的表达水平，采用TCGA数据库中卵巢癌转录组测序数据验证LncRNA LOC101927476和GATA4的表达，采用慢病毒包装体系构建过表达LOC101927476(OE-LOC101927476组)和空载(OE-EV组)慢病毒并转染至3AO细胞。设计单链向导RNA(sgRNA)，利用CRISPR/Cas9构建LncRNA LOC101927476敲除细胞系。采用Transwell法和划痕实验检测LncRNA LOC101927476对卵巢癌细胞侵袭和转移能力的影响。采用细胞计数盒8(CCK-8)法检测细胞的增殖能力。结果:real-time PCR显示，22例卵巢癌患者中，20例转移灶中LncRNA LOC101927476的表达水平低于原发灶。Transwell迁移实验显示，OE-EV组3AO细胞的穿膜细胞数为(1 024±76)个，高于OE-LOC101927476组[(699±65)个， P＝0.003]；sg-Control组OVCA429细胞的穿膜细胞数为(363±27)个，低于sg-LOC101927476组[(472±40)个] ，差异有统计学意义( P＝0.011)。Transwell侵袭实验显示，OE-EV组3AO细胞的穿膜细胞数为(661±95)个，高于OE-LOC101927476组[(357±63)个]，差异有统计学意义( P＝0.006)；sg-Control组OVCA429细胞的穿膜细胞数为(309±13)个，低于sg-LOC101927476组[(512±72)个] ，差异有统计学意义( P＝0.005)。划痕实验显示，培养48 h时，OE-LOC101927476组3AO细胞的划痕愈合比例为(10.86±0.63)%，低于OE-EV组[(57.38±4.42)%]，差异有统计学意义( P＝0.009)；培养24 h时，sg-LOC101927476组OVCA429细胞的划痕愈合比例为(59.98±1.34)%，高于sg-Control组[(23.15±2.03)%]，差异有统计学意义( P＝0.004)。CCK-8结果显示，OE-LOC101927476组3AO细胞的增殖能力明显减弱，在过表达LncRNA LOC101927476后第4天时，OE-LOC101927476组3AO细胞的吸光度( A)值为2.07±0.08，与OE-EV组(2.29±0.04)比较，差异有统计学意义( P＝0.009)。sg-LOC101927476组OVCA429细胞的增殖能力提高，在敲降LncRNA LOC101927476的表达后第4天时，sg-LOC101927476组OVCA429细胞的 A值为(2.13±0.03)，与sg-Control组(1.93±0.03)比较，差异有统计学意义( P＝0.001)。OE-LOC101927476组3AO细胞中GATA4的相对表达水平为1.86±0.25，与OE-EV组(1.00±0.00)比较，差异有统计学意义( P＝0.001)。在LncRNA LOC101927476高表达的患者中，GATA4的表达水平为(2.93±0.35)，高于LncRNA LOC101927476低表达的患者(0.29±0.06)，差异有统计学意义( P＝0.001)。 结论:LncRNA LOC101927476能够抑制卵巢癌的侵袭、迁移和增殖。

目的:比较腺相关病毒(AAV)不同血清型对小鼠视网膜层的趋向性。方法:构建pFastBacDual-inCap衣壳质粒和pFastBacDual-ITR-CMV-EGFP基因组质粒；包装重组腺相关病毒2型(rAAV2)、rAAV6、rAAV8、rAAV9；以感染复数(MOI)2000的比例感染HEK293T细胞，24 h后观察荧光表达；应用随机数字表法将C57BL/6小鼠分为rAAV2、rAAV6、rAAV8、rAAV9组和对照组，每组5只，分别双眼玻璃体腔注射rAAV2、rAAV6、rAAV8、rAAV9和磷酸盐缓冲液(PBS)各1 μl，注射后2周，制作眼球冰冻切片以及视网膜铺片，分别应用倒置荧光显微镜和激光扫描共焦显微镜观察rAAV不同血清型增强型绿色荧光蛋白(EGFP)荧光强度和感染部位。应用倒置荧光显微镜观察玻璃体腔注射rAAV2后2周、1个月、3个月EGFP荧光强度变化。结果:重组病毒对HEK293T的感染效率从高到低依次为rAAV2、rAAV6、rAAV8和rAAV9，转导效率分别为39.5%、18.4%、8.7%和4.6%；在小鼠视网膜中，rAAV2和rAAV6在神经节细胞表达水平较高，rAAV8和rAAV9在视网膜色素上皮(RPE)和光感受器细胞中表达水平较高；rAAV2介导EGFP可于注射后2周、1个月、3个月内在视网膜稳定表达。结论:rAAV不同血清型对视网膜RPE细胞和神经节细胞具有高趋向性和高效表达，rAAV2玻璃体腔注射后转导效率较高，且在注射后3个月内稳定表达。

目的:探究肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)是否可以激活Raw264.7巨噬细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP OmpA基因序列(GenBank Number：AJ000998.1)，以本科室保存的KP菌株基因组为模板，设计引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增OmpA全长序列并经同源重组酶连接至慢病毒表达载体pLVX-AcGFP1-N1。将该重组表达载体与慢病毒包装质粒pLP1，pLP2和pLPVSV-G共转染HEK293T细胞，收集慢病毒液并感染Raw264.7巨噬细胞，经有限稀释法筛选获得表达KP OmpA的Raw264.7单克隆细胞株。使用蛋白质印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)表达。组间比较采用 t检验。 结果:成功包装出慢病毒并获得稳定表达KP OmpA的Raw264.7细胞系，KP OmpA稳转细胞系胞内NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β灰度值显著高于空载细胞系(1.17±0.01比0.71±0.01， t＝31.170， P<0.01；2.25±0.06比1.43±0.07， t＝8.909， P<0.05；1.82±0.06比1.25±0.01， t＝8.900， P<0.05；1.41±0.06比0.58±0.01， t＝12.860， P<0.01)。KP OmpA稳转细胞系细胞上清中IL-1β和IL-18表达量显著高于空载细胞系[(215.70±14.93) pg/ml比(20.37±9.86) pg/ml， t＝10.920， P<0.01；(115.90±14.88) pg/ml比(15.40±4.72) pg/ml， t＝6.434， P<0.05]。 结论:肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpA可以激活Raw264.7巨噬细胞NLRP3炎症小体，并上调炎性因子IL-1β和IL-18表达。

目的:探讨S100A7通过细胞内外作用影响宫颈癌细胞迁移和侵袭的作用机制。方法:收集2007年5月至2007年12月在青岛大学附属医院妇科行手术治疗的5例宫颈鳞状细胞癌(简称鳞癌)和3例腺癌组织标本，采用免疫组化SP法检测其S100A7蛋白的表达。通过慢病毒包装系统构建过表达S100A7的宫颈癌细胞HeLa和C33A，作为实验组，采用免疫荧光实验观察过表达S100A7宫颈癌细胞的形态变化，Transwell实验检测S100A7对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响，实时荧光定量聚合酶链反应(RT－qPCR)检测宫颈癌细胞上皮－间质转化标志分子E－cadherin、N－cadherin、vimentin和fibronectin mRNA的表达。收集宫颈癌细胞条件培养基，采用Western blot法检测细胞外S100A7蛋白的表达。将收集的细胞条件培养基加入Transwell下层小室，检测细胞外S100A7对宫颈癌细胞运动能力的影响。分离纯化C33A细胞培养上清的外泌体，采用Western blot法检测S100A7、CD81和肿瘤易感基因101的表达。将外泌体和宫颈癌细胞共孵育进行Transwell实验，检测实验组和对照组外泌体对宫颈癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:S100A7蛋白在宫颈鳞癌组织中呈阳性表达，在宫颈腺癌组织中不表达。成功构建稳定过表达S100A7的HeLa和C33A细胞。实验组C33A细胞呈梭形间叶性细胞形态，对照组细胞则趋向于多边形上皮样形态。实验组HeLa细胞Transwell迁移实验和侵袭实验的穿膜细胞数分别为(152.00±39.22)个和(115.38±34.57)个，均高于各自对照组[(105.13±15.75)个和(79.50±13.68)个，均 P<0.05]；实验组HeLa和C33A细胞中E－cadherin mRNA的表达均下降(均 P<0.05)；实验组HeLa细胞中N－cadherin和fibronectin mRNA的表达、实验组C33A细胞中fibronectin mRNA的表达均增高(均 P<0.05)。Western blot检测结果显示，实验组HeLa细胞的培养上清中检测到S100A7蛋白表达。加入实验组条件培养基的HeLa细胞迁移实验和侵袭实验穿膜细胞数分别为(192.60±24.41)个和(105.40±27.38)个，明显高于对照组[(98.80±47.24)个和(84.50±13.51)个，均 P<0.05]。成功提取C33A细胞培养上清中的外泌体，S100A7表达阳性。与实验组细胞提取的外泌体共孵育的C33A细胞迁移实验和侵袭实验的穿膜细胞数分别为(251.00±49.82)个和(524.60±52.74)个，明显高于对照组[(143.00±30.85)个和(389.00±63.23)个，均 P<0.05]。 结论:S100A7介导宫颈癌细胞发生上皮－间质转化，并可在外泌体中发挥作用，促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭。

目的:构建跨膜蛋白(transmembrane protein，TMEM)240慢病毒载体，并在人神经母细胞瘤细胞中表达。方法:提取人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的RNA，逆转录成cDNA并作为模板，聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增TMEM240的CDS序列，与pLVX-EGFP-N1载体连接，转化、验菌送公司测序，pLVX-TMEM240-EGFP-N1质粒与慢病毒包装质粒共转染293Ta细胞，收取上清，感染SH-SY5Y，嘌呤霉素筛选，获得表达TMEM240的SH-SY5Y细胞，将感染pLVX-EGFP-N1的SH-SY5Y细胞作为对照组，感染pLVX-TMEM240-EGFP-N1的SH-SY5Y细胞为实验组。通过共聚焦显微镜、实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR，Real-time PCR)和Western blot检测细胞中TMEM240表达。结果:测序结果显示pLVX-TMEM240-EGFP-N1质粒构建成功；共聚焦显微镜下，表达TMEM240的细胞内出现点状绿色荧光；Real-time PCR及Western blot结果表明细胞内TMEM240表达。结论:成功构建TMEM240慢病毒载体，慢病毒在基因和蛋白水平均引起TMEM240表达升高。

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤，酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性，流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能，Fortebio测定抗体亲和力，抗体全长测序，经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)；人EGFR单克隆抗体杂交瘤系，经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因，构建scFv，克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接，克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体，使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞，获得包装病毒，感染293V细胞，FACS测定CAR膜表达，ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况，转染激活人外周血T细胞，验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3，具备高度配受体封阻性能，经人源化改造后，亲和力稳定(2.67×10 －10 mol/L)，EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2)，其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后，细胞膜表面表达EGFR-scFv，检测培养上清存在PD-L1-ScFv；CTZ0431-2感染293V细胞后，细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达，双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体，EGFR-CAR中度结合亲和力，此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。