目的:建立野百合碱、倒千里光碱和千里光宁3种吡咯烷生物碱(PA)所致的急性肝窦阻塞综合征(HSOS)小鼠模型，并对3种模型进行评价。方法:将48只雄性C57小鼠分为4组：对照组、野百合碱组、倒千里光碱组和千里光宁组(每组12只)，分别予以PBS(300 μL)、野百合碱溶液(800 mg/kg)、倒千里光碱溶液(100 mg/kg)、千里光宁溶液(100 mg/kg)灌胃1次。于灌胃后24 h分析4组小鼠死亡数、成模数、肝功能和肝脏病理形态学变化。统计学方法采用单因素方差分析、Bonferroni法、卡方检验。结果:灌胃后24 h时野百合碱组、倒千里光碱组、千里光宁组分别死亡0、9、0只，存活小鼠成模9、3、6只，3组死亡数比较差异有统计学意义( χ2＝21.734， P<0.05)，成模数比较差异无统计学意义( χ2＝2.836， P>0.05)。野百合碱组、倒千里光碱组、千里光宁组ALT水平分别为(111.72±37.62)、(562.97±242.42)、(3 891.40±1 009.44) U/L，AST水平分别为(156.96±64.95)、(331.22±120.83)、(2 107.55±532.80) U/L，TBil水平分别为(41.66±10.42)、(79.43±18.45)、(120.80±17.44) μmol/L，均高于对照组[分别为(31.40±10.98) U/L、(34.66±13.00) U/L、(16.91±2.89) μmol/L]，差异均有统计学意义(Bonferroni法， P均<0.008 3)；倒千里光碱组与千里光宁组ALT、AST水平比较差异均有统计学意义(Bonferroni法， P均<0.008 3)，TBil水平比较差异无统计学意义( P>0.008 3)；倒千里光碱组与野百合碱组TBil水平比较差异有统计学意义(Bonferroni法， P＝0.002)，ALT、AST水平比较差异均无统计学意义( P均>0.008 3)；千里光宁组与野百合碱组ALT、AST和TBil水平比较差异均有统计学意义(Bonferroni法， P均<0.008 3)。野百合碱组、倒千里光碱组、千里光宁组小鼠肝组织可见肝细胞凝固性坏死，中央静脉内皮下出血，肝窦扩张，红细胞淤滞于肝血窦中，正常的小叶结构被破坏；野百合碱组和倒千里光碱组主要表现为肝腺泡3区肝细胞坏死、肝窦扩张淤血；千里光宁组主要表现为肝腺泡1区和2区肝细胞坏死和淤血。野百合碱组成模小鼠的肝组织病理学改变为中、重度，倒千里光碱组、千里光宁组均为重度。 结论:成功建立了野百合碱、倒千里光碱和千里光宁3种PA所致小鼠急性HSOS模型，其中野百合碱更合适。

背景:倒千里光碱是能长期抑制成熟肝细胞分裂增生的肝化学毒剂.目的:联合应用倒千里光碱和肝脏1/3切除建立肝损伤大鼠模型,肝损伤观察大鼠肝细胞和卵圆细胞增殖情况,以及成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系.方法:SD雄性大鼠30只,随机分为2组,每组15只.①倒千里光碱/肝脏1/3切除组:腹腔注射倒千里光碱,30 mg/ kg,共注射2次,每次间隔2周;②1/3肝切除组:用生理盐水代替倒千里光碱.两组大鼠在末次注射4周后行肝脏1/3切除术.观察两组大鼠术后不同时间点肝脏病理形态变化、细胞增殖情况和CK19、C-kit免疫组织化学检测情况.结果与结论:①倒千里光碱/肝脏1/3切除组大鼠术后20 d体质量仍低于术前,肝脏增大明显小于肝脏1/3切除组,苏木精-伊红染色示胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性,汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生;②肝脏1/3切除组术后20 d 体质量恢复接近术前,肝脏损害较倒千里光碱/肝脏1/3切除组轻,Brdu免疫荧光示成熟肝细胞大量增生,术后14 d见肝卵圆细胞增生,多出现在肝细胞索中,形态和免疫组织化学标记与倒千里光碱/肝脏1/3切除组卵圆细胞一致;③结果提示,成功构建了倒千里光碱联合肝脏1/3切除的急性肝损伤大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞和成熟肝细胞增殖的现象,证实肝细胞更新与损伤后再生是肝流域中肝内外源肝干细胞及成熟肝细胞共同作用的结果.

背景:近年研究证实,干细胞移植的成功与否、移植后细胞功能的发挥均与体内微环境密切相关.正常生理情况下,肝脏不易接受外源性细胞,因此,在目前的细胞移植研究中,通常会先建立一个移植动物模型,通过造成宿主肝脏的损伤或降低宿主肝脏的免疫反应等方式,为外源细胞的植入和增殖创造一个良好的移植条件.目的:观察GFP转基因小鼠胎肝干细胞在脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐/倒千里光碱联合1/3肝切除(L-CL2MDP/RS/PH)模型大鼠肝脏内的定植和分布情况.方法:①以孕15 d GFP转基因小鼠为供体,分离培养胎肝干细胞,荧光显微镜观察GFP表达,并行免疫细胞化学鉴定;②将30只SD大鼠随机分为实验组和对照组,实验组腹腔注射倒千里光碱溶液(30 mg/kg,共2次,每次间隔2周),术前1 d每只大鼠静脉注射1 mL脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐(L-CL2MDP)溶液,行1/3部分肝脏切除后经脾内移植GFP转基因小鼠胎肝干细胞,对照组用生理盐水分别代替L-CL2MDP和倒千里光碱溶液,不进行1/3部分肝脏切除;③移植后3,15,30 d取出两组大鼠肝脏行冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP阳性肝干细胞在大鼠肝脏的分布,并通过免疫组化染色方法检测抗小鼠C-Kit抗体在移植大鼠肝内的表达.结果与结论:①镜下观察分离的肝干细胞大小均匀,呈鹅卵石形态.培养5 d后细胞体积逐渐增大,呈类圆形或梭形,荧光显微镜下可见绿色荧光,免疫细胞化学检测第3代肝干细胞表达CD34、AFP;②胎肝干细胞移植后3 d在荧光显微镜下发现实验组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞,移植后30 d大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达;③移植后3,15,30 d在实验组大鼠肝脏组织可见C-Kit阳性细胞表达;④结果表明,GFP转基因小鼠胎肝干细胞成功移植于L-CL2MDP/RS/PH模型大鼠脾内,植入的细胞能够在大鼠肝脏中存活,并出现不同程度增殖.

探讨千里光菲灵碱对人宫颈癌HeLa、Caski细胞增殖、自噬的影响及其可能的作用机制.MTT法检测千里光菲灵碱对HeLa、Caski细胞增殖的影响;免疫荧光法检测GFP-LC3/HeLa和GFP-LC3/Caski两种细胞内自噬体的形成情况;免疫印迹法检测千里光菲灵碱对自噬相关蛋白表达的影响;荧光共定位法检测自噬体与溶酶体的融合情况;建立荷宫颈癌HeLa、Caski细胞移植瘤裸鼠模型,检测千里光菲灵碱对移植瘤生长的抑制作用.结果显示,千里光菲灵碱呈时间和剂量依赖性抑制HeLa、Caski两种宫颈癌细胞的增殖;千里光菲灵碱可诱导HeLa、Caski细胞内自噬体的形成和LC3-II蛋白的增加及P62蛋白的减少,表明千里光菲灵碱可诱导HeLa、Caski细胞发生自噬;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合自噬下游抑制剂氯喹(CQ)显著增加了LC3-II及P62的蛋白表达,同时荧光共定位显示千里光菲灵碱诱导的自噬体可与溶酶体实现共定位,表明千里光菲灵碱可诱导完整自噬流;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合自噬上游抑制3-甲基腺嘌呤(3MA)剂显著增加了LC3-II的蛋白表达,显著降低了HeLa、Caski细胞的存活率,表明抑制自噬可增强千里光菲灵碱对宫颈癌细胞增殖的抑制作用;与单药千里光菲灵碱相比,千里光菲灵碱联合MEK抑制剂显著降低了P-ERK1/2的蛋白表达,减少了自噬体的形成,表明千里光菲灵碱诱导的HeLa、Caski细胞自噬依赖于MEK/ERK1/2途径;另外,千里光菲灵碱可显著抑制宫颈癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长.

中药土三七具有破血散瘀、行气摄血、消肿止痛等功能,民间常用于骨折以及跌打损伤后的治疗.直到上世纪八十年代,侯景贵等首次报道了服用土三七导致肝小静脉闭塞病(Hepatic veno-occlusivedisease,HVOD)的临床病例[1],引起了人们对土三七肝毒性方面研究.HSOS又名肝窦阻塞综合征(Hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS),在西方国家,造血干细胞移植以及肝移植后大量使用化疗药物为HSOS主要病因;而在中国,导致HSOS的病因主要是由于服用含吡咯烷生物碱(Pyrrolizidine alkaloids,PAs)的中草药,如野百合、土三七、猪屎豆、千里光等,以土三七最常见,普遍认为土三七所含的PAs成分是导致HSOS的主要病因[2].其导致的HSOS具有发病率高、难以确诊、预后差、死亡率高的特点,近年来陆续有文献报道土三七致HSOS临床案例,且呈上升趋势.本文旨在对土三七的分类及其活性成分、以及土三七导致HSOS的发病机制、病理特点、诊断、治疗及预后等进行分析整理,以期能为该疾病的预防治疗提供一定参考.

肝小静脉闭塞症(hepatic venular occlusion disease,HVOD)又称肝窦阻塞综合征,其病理过程是肝小叶中央静脉和内皮下静脉内皮细胞受损、肿胀、纤维化,引起血管狭窄和闭塞,从而导致肝细胞萎缩,肝脏弥漫性纤维化等.我国HVOD常见病因主要是接触吡啶类生物碱(pyridine alkaloids,PA),如土三七、千里光等,而西方国家因造血干细胞移植相关的化疗药物、免疫抑制剂的应用所致HVOD较常见[1-3].研究[3]表明,90％患者在接触土三七后1个月内起病,提示绝大多数PA-HVOD患者呈急性病程.本文通过1例土三七致急性HVOD及相关文献学习来进一步探讨此类病例.

目的 建立款冬花中毒性成分克氏千里光碱的含有量测定方法,考察蜜炙对其影响.方法 采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术进行定量分析,比较蜜炙前后款冬花中克氏千里光碱的含有量.结果 所建立的含有量测定方法经方法学验证,并成功应用于款冬花及其蜜炙品中克氏千里光碱含有量的测定;款冬花蜜炙后,克氏千里光碱含有量显著降低.结论 该方法简便快速、准确灵敏,可用于款冬花的质量控制的完善提供参考;蜜炙对款冬花可能具有一定的减毒作用.

目的:建立一种同时测定15个吡咯里西啶生物碱(pyrrolidine alkaloids,PAs)及其氮氧化物的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC/MS/MS),完成15批不同来源的款冬花样品的含量测定.从而初步了解不同来源款冬花中PAs的分布现状,为药材的安全合理使用提供相关参考.方法:采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(3.0 mm×150 mm,1.8 μm),流动相为含0.05％甲酸和2.5 mmol·L-1甲酸铵的水溶液(A)以及含0.05％甲酸和2.5 mmol·L-1甲酸铵的甲醇(B),梯度洗脱,流速0.4 mL·min-1,进样量2 μL,柱温40℃.采用Agilent 1290-6470 QQQ型超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪,离子化模式为ESI+,多反应监测模式(MRM).利用外标法计算药材样品中所测成分的含量,通过计算不同成分的相对标准偏差(RSD)对样品间的差异进行分析.结果:建立的测定方法灵敏度高,分离度良好,方法学考察结果良好.样品测定结果表明,15批药材均含有PAs及其氮氧化物,且所含PAs种类基本相同.克氏千里光碱(senkirkine)是款冬花中最主要的PAs类成分.药材款冬花中不同PAs的含量与分布有较大差异.结论:款冬花中普遍含有吡咯里西啶生物碱及其氮氧化物,且以具有显著肝毒性的克氏千里光碱为其中最主要种类.针对PAs的含量测定为确保款冬药材的用药安全提供了有效的保证.

吡咯里西啶生物碱(PAs)是一种天然毒性物质,可导致显著的肝毒性、肺脏毒性、遗传毒性、神经毒性和胚胎毒性等,甚至死亡.因此含PAs的中草药及制剂一直是世界卫生组织等国际组织及国家严密监控的对象.PAs广泛存在于我国多种药用植物中,涉及中药成方制剂数百种.《中国药典》2015年版明确规定了千里光药材中阿多尼弗林碱的限量,但对含有该药材的制剂并未做任何规定,对其他数十种相关制剂中阿多尼弗林碱的限量也未做规定.该研究收集了包括《中国药典》收录的千柏鼻炎片、千柏鼻炎胶囊等常用的14种含千里光的中药制剂,并采用UPLC-MS技术检测了阿多尼弗林碱的含量.结果 在8种制剂中均检测到了阿多尼弗林碱,包括千柏鼻炎片、千柏鼻炎胶囊等,其平均含量远高于德国、荷兰和新西兰的相关标准.且同一复方不同批次间含量差异较大,最高质量分数为156.10 μg·g-1,按该批制剂推荐用量每日摄人阿多尼弗林碱最高达1 030.26 μg,提示服用含千里光的制剂需注意其用药安全,对复方中千里光药材含量较高的制剂尤其应该注意阿多尼弗林碱的限量检查.

目的:优化千里光药材的提取工艺,为其进一步开发利用提供方法参考.方法:采用80℃水浴回流提取的方法提取千里光药材.采用高效液相色谱法测定绿原酸和金丝桃苷的含量,色谱柱为Diamonsil C18,流动相为0.2％冰醋酸水溶液-甲醇(82:18,V/V),柱温为35℃,流速为1.0 mL/min,检测波长分别为327 nm,进样量为5μL;采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮(以芦丁计)和总生物碱(以苦参碱计)的含量,检测波长分别为509、208 nm.在单因素试验的基础上,以乙醇体积分数(A,％)、溶剂倍量(B,mL/g)、提取时间(C,h)、提取次数(D,次)为考察因素,以绿原酸、金丝桃苷、总黄酮和总生物碱的含量为评价指标,通过信息熵赋权法计算上述各指标的权重系数并以此计算其综合评分,按L9(34)正交试验设计优化千里光提取工艺并进行验证.结果:千里光药材的最佳提取工艺为加入8倍量50％乙醇,回流提取3次,每次1.5 h;3次验证试验结果显示,所得提取液中绿原酸、金丝桃苷、总黄酮和总生物碱含量的RSD均小于1.5％(n=3).结论:优化的提取工艺重复性好、稳定可行,可用于千里光药材的提取.