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绿色荧光裸小鼠髓源巨噬细胞的极化培养及特征
编辑人员丨5天前
目的:探讨巨噬细胞为适应肿瘤微环境(tumor micro-environment,TME)需要而在其自身极化层面上发生谱系变化模型的特征,为进一步研究TME中巨噬细胞的可塑性提供参考。方法:取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因并已建成近交系的Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU裸小鼠骨髓细胞,分别在巨噬细胞集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1,CSF-1)、IFN-γ+LPS、IL-4诱导下,培养出M0、M1和M2亚型,倒置荧光显微镜观察GFP。免疫细胞化学染色法检测巨噬细胞标志蛋白和极化蛋白,并进一步与人脑胶质瘤干细胞SU3共培养。 结果:倒置荧光显微镜下,原始骨髓细胞和条件培养基培养出的M0、M1和M2都发出强烈的绿色荧光。瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色后,普通显微镜下能观察到巨噬细胞固有的可塑性。免疫细胞化学染色检测CD11C和CD206标志蛋白表达都呈阳性,CD68只在M1巨噬细胞上为弱阳性,CSF-1和CSF-1R在各亚型细胞上都呈强阳性。在共培养的干细胞球体中观察到了绿色荧光细胞浸润,并发生了吞噬反应。结论:本研究建立了绿色荧光裸小鼠的髓源性巨噬细胞谱系模型,包含M0、M1和M2亚型,都有巨噬细胞固有的可塑性,表达共同的标志蛋白和极化相关蛋白,具有巨噬细胞固有的吞噬功能,可用于与肿瘤细胞之间相生相克表征的研究,特别是需要示踪研究时,可通过巨噬细胞发出的绿色荧光进行识别。
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编辑人员丨5天前
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GABA能视网膜神经节细胞的中枢投射区域及其在视网膜中的分布、形态研究
编辑人员丨5天前
目的:探究γ-氨基丁酸(GABA)能视网膜神经节细胞的中枢投射区域以及投射到上丘的GABA能视网膜神经节细胞在视网膜中的分布情况及其形态特点。方法:取6只GABA转运蛋白(vGAT)-cre转基因小鼠(实验1组)及6只野生型C57BL/6小鼠(对照1组),于双侧眼内玻璃体腔注射腺相关病毒rAAV-EF1α-DIO-EGFP-EGFP;取6只vGAT-cre转基因小鼠(实验2组)及6只野生型C57BL/6小鼠(对照2组),于脑内双侧上丘注射腺相关病毒rAAV-EF1α-DIO-EGFP-EGFP。注射病毒后42 d时,取6只实验1组、6只对照1组及3只实验2组、3只对照2组小鼠的视网膜、视神经、脑组织,行冰冻切片的免疫荧光双标染色以检测绿色荧光蛋白(GFP)和GABA的表达;对3只实验2组、3只对照2组小鼠的全视网膜铺片行免疫荧光双标染色以检测GFP和转录因子Brn3蛋白(BRN3A)的表达并统计阳性细胞数、细胞胞体大小。结果:实验1组小鼠的视网膜内核层、内网状层、神经节细胞层均可见到表达GFP的绿色荧光信号和表达GABA的红色荧光信号共标,视神经中可见表达GFP的绿色荧光信号沿轴突纤维呈线样排列,外侧膝状体和上丘区域的脑组织中也可见到表达GFP的绿色荧光信号;而对照1组小鼠视网膜上无绿色荧光信号。实验2组小鼠的视网膜上表达GFP的绿色荧光信号与表达GABA的红色荧光信号存在共标,投射至上丘的GABA能视网膜神经节细胞以中小型细胞(直径12~16 μm)为主,其数量占细胞总数的(37.70±5.33)%,占所有神经节细胞(BRN3A阳性)的(7.27±0.81)%。结论:GABA能视网膜神经节细胞向脑内外侧膝状体及上丘区域投射,在视网膜上呈均匀分布且以中小型细胞为主。
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编辑人员丨5天前
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血小板源性生长因子受体α调控小鼠锌指蛋白阳性间充质干细胞双向分化的研究
编辑人员丨5天前
目的:探讨血小板源性生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor alpha,PDGFRα)对小鼠锌指蛋白阳性间充质干细胞(glioma-associated oncogene homolog 1-positive mesenchymal stem cells,Gli1 +-MSC)双向分化的调控作用。 方法:繁育双报告转基因小鼠ROSA mT/mG/Gli1-Cre ERt2/PDGFRα fl(实验组)和ROSA mT/mG/Gli1-Cre ERt2(对照组),选取两组4周龄小鼠各20只,从小鼠主动脉外膜中分离间充质干细胞,使用他莫昔芬诱导,通过绿色荧光蛋白标记和流式细胞仪分选,筛选两组Gli1 +-MSC,实验组Gli1 +-MSC中条件性敲除PDGFRα,对照组Gli1 +-MSC正常表达PDGFRα。对两组Gli1 +-MSC分别进行成脂肪诱导和成纤维诱导,蛋白质印迹法检测两组PDGFRα、脂肪细胞标志物[脂滴包被蛋白和CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein alpha,C/EBPα)]和成纤维细胞标志物[α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)、成纤维细胞特异蛋白1(fibroblast-specific protein 1,FSP-1)]的蛋白表达,并进行半定量分析。油红O染色观察两组Gli1 +-MSC双向诱导后的细胞脂肪分化程度,并进行半定量分析。 结果:他莫昔芬诱导后,可通过绿色荧光蛋白的表达标记准确地从流式细胞仪中分离出Gli1 +-MSC。成脂肪诱导后,实验组PDGFRα蛋白表达(0.017±0.002)显著小于对照组(0.184±0.012)( t=25.48, P=0.002),脂滴包被蛋白(3.138±0.414)和C/EBPα(3.565±0.289)蛋白表达均显著大于对照组(分别为2.312±0.218、2.179±0.103)( t=6.21, P=0.025; t=6.69, P=0.022),即PDGFRα的敲除增强了Gli1 +-MSC的成脂肪分化能力。成纤维诱导后,实验组PDGFRα、α-SMA和FSP-1的蛋白表达(分别为0.030±0.001、0.932±0.177和0.276±0.020)均显著小于对照组(分别为0.439±0.006、1.352±0.170和0.835±0.097)( t=149.40, P<0.001; t=66.38, P<0.001; t=11.41, P=0.008),即PDGFRα的敲除显著抑制Gli1 +-MSC向纤维细胞分化。双向诱导后,对照组可见脂肪细胞形成明显减少,实验组脂肪细胞形成较多;定量分析显示,双向诱导后实验组油红O染色量(0.461±0.042)显著多于对照组(0.017±0.007)( t=23.20, P<0.001)。 结论:PDGFRα在调控血管外膜Gli1 +-MSC的双向分化中发挥重要作用。
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编辑人员丨5天前
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小鼠原代巨核细胞骨髓腔移植模型的构建
编辑人员丨5天前
目的:利用小鼠原代巨核细胞骨髓腔移植构建血小板产生模型,为研究巨核细胞功能及血小板产生调控机制提供工具。方法:通过磁珠富集绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins, GFP)转基因供体小鼠骨髓原代巨核细胞,将其移植入经半致死剂量辐照的受体小鼠骨髓腔,建立原代巨核细胞骨髓腔内血小板生成模型。通过免疫荧光染色、流式细胞术等方法检测受体小鼠中供体来源巨核细胞和血小板形态、大小等指标。结果:磁珠富集可将巨核细胞在骨髓细胞悬液中的比例提高40~50倍。供体来源巨核细胞能够在受体小鼠骨髓腔成功定植并正常产生血小板,其产生的子代血小板具有与受体自身来源血小板相似的形态、大小及CD41、CD42d、CD61等表面标志分子表达水平。结论:通过磁珠富集与骨髓腔注射可成功构建小鼠原代巨核细胞移植模型,该模型能够客观反映巨核细胞在骨髓内产生血小板的能力。
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编辑人员丨5天前
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小鼠视神经损伤后视神经小胶质细胞数目和形态变化
编辑人员丨5天前
目的::研究小鼠视神经损伤后不同时间点视神经小胶质细胞的数目与形态变化。方法::实验研究。选取32只成年雄性健康CX3CR1 —/GFP转基因杂交小鼠,按照随机数字表法将小鼠随机分为正常对照组、视神经损伤1、7、14 d组,每组8只。视神经损伤组均在左眼建立视神经夹伤模型,右眼不处理,正常对照组不做任何处理。分别于上述时间点制备小鼠视神经冰冻切片,每根视神经取3张切片(30 μm),采用共聚焦显微镜在距离眼球端500 μm处拍摄图像,比较小胶质细胞的数量和形态变化。4组小胶质细胞数目比较采用单因素方差分析。 结果::正常对照组、视神经损伤1、7和14 d组的视神经小胶质细胞数目分别为(438±16)个/mm 2、(323±15)个/mm 2、(1 252±107)个/mm 2、(1 474±113)个/mm 2。视神经损伤7、14 d组小胶质细胞数量明显多于正常对照组和视神经损伤1 d组,差异均有统计学意义(均 P<0.001)。正常对照组的视神经小胶质细胞均匀分布,细胞核较小,分枝细长并向四周伸展。视神经损伤1 d组,小胶质细胞分枝数量减少,细胞核形态变化不明显。损伤7 d组的视神经小胶质细胞大量激活,排列较紊乱,存在少量细胞聚集现象,分枝短而粗,且越靠近细胞核分枝越粗,细胞核体积明显增大。视神经损伤14 d组,视神经小胶质细胞形态与损伤7 d组类似。 结论::小鼠视神经夹持损伤后,视神经小胶质细胞初期数目减少,随着损伤时间延长,小胶质细胞数目大量增加,且形态由分枝状变为阿米巴样。
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编辑人员丨5天前
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调控内侧前额叶皮质向丘脑室旁核投射通路对小鼠痛信息传递的影响
编辑人员丨3周前
目的 探讨小鼠内侧前额叶皮质(mPFC)-丘脑室旁核(PVT)通路的投射神经元的性质及调控该通路对生理痛和急性痛的影响.方法 谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠3只,用于形态学追踪实验,C57小鼠27只,用于行为学观察实验.将霍乱毒素B亚基(CTB)注入GAD67-GFP转基因小鼠的PVT内,观察向PVT投射的mPFC神经元的性质,使用化学遗传学方法调控mPFC-PVT通路,观察其对小鼠机械痛、热痛、冷痛以及辣椒素诱导的急性炎性痛的影响.结果 mPFC内CTB标记神经元主要分布于Ⅴ层和Ⅵ层,且与GAD67-GFP不共标;化学遗传学方法激活mPFC-PVT通路可显著降低小鼠的机械痛阈值(P<0.0001),缩小热痛潜伏期(P<0.001),对冷痛无明显的影响;抑制此通路则可显著提高动物的机械性痛阈(P<0.05);辣椒素诱导急性炎性痛模型下激活此通路引起小鼠舔爪时间增加(P<0.05).结论 mPFC-PVT通路为非γ-氨基丁酸(GABA)能的神经通路,激活该通路可促进小鼠的机械痛、热痛和急性炎性痛反应.
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编辑人员丨3周前
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日常饮食中添加摄食甜菜碱对APP/PS1转基因小鼠的影响
编辑人员丨2024/3/16
目的 研究日常饮食中添加摄食甜菜碱对APP/PS1 转基因小鼠的影响.方法 C57BL/6J小鼠作为空白对照组,APP/PS1 小鼠分为正常饮食组和甜菜碱补充饮食组(含 5g/kg甜菜碱),每组 15 只,饮食持续 3 个月.水迷宫实验评估小鼠的记忆行为;免疫荧光法观察海马和皮质中β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉积情况;巢蛋白(Nestin)和双皮质素(DCX)标记法以及神经元核抗原(NeuN)和EdU双标法观察海马神经再生情况;GFP-AAV脑立体注射并用荧光显微镜观察CA1 区神经元的棘突情况;电生理记录海马CA1 区长时程增强效应(LTP);Western blot法检测海马中突触后致密蛋白-95(PSD-95)、突触小泡蛋白(SYN)、微管相关蛋白(MAP-2)表达.结果 与正常饮食组比较,甜菜碱补充饮食组APP/PS1 小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.01),进入平台所在象限的次数增多且滞留时间延长(P<0.01),海马和皮质中Aβ沉积减少(P<0.01),海马齿状回和颗粒下区中Nestin、DCX阳性细胞以及增殖的神经元数均增多(P<0.01),海马CA1 区棘突密度增加(P<0.01),fEPSP斜率增高(P<0.01),海马中PSD-95、SYN、MAP-2蛋白表达升高(P<0.01).结论 甜菜碱可改善APP/PS1 小鼠记忆障碍,减少海马和皮层中淀粉样斑块沉积并提高神经发生和突触可塑性.
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编辑人员丨2024/3/16
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杜仲提取物增强骨髓基质细胞移植对创伤性脑损伤治疗效能相关性研究
编辑人员丨2024/3/2
目的 探讨杜仲(EU)提取物对骨髓基质细胞(BMSCs)生物学特性及其移植治疗创伤性脑损伤(TBI)效能的影响.方法 体外实验:将C57BL/6 小鼠来源BMSCs分为EU组和Control组(每组各8 只),分别给予EU提取物(100 μg/ml)和等量溶剂.通过相差显微镜观察和CCK-8 试验检测细胞形态增殖情况.通过免疫荧光(IF)染色和定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞神经分化相关基因[Oct4、神经原纤维轻链(Nefl)、神经分化因子(Neurod1)、神经生长因子(Ngf)]表达情况.体内实验:将32 只3 月龄雄性C57BL/6 小鼠随机分为Sham surgery组、TBI组、TBI +BMSCs组和TBI +EU_BMSCs组(每组各8 只).对TBI组、TBI +BMSCs组和TBI +EU_BMSCs组进行TBI手术,术后 7 d,TBI组给予 100 μl PBS,TBI + BM-SCs组经眶内静脉注射无特殊处理的GFP转基因小鼠来源BMSCs,TBI +EU_BMSCs组经眶内静脉注射等量EU提取物预处理14d的GFP转基因小鼠来源BMSCs.Sham surgery组接受除TBI手术及细胞注射移植以外的其他操作.通过转棒式疲劳仪和平衡木行走试验检测运动功能.通过IF染色进行组织病理学检测.结果 体外实验:EU提取物处理14d后,相差显微镜图像分析和CCK-8 试验结果显示,EU组增殖活性高于Control组(P<0.001);qRT-PCR检测显示,EU组Neurod1 和Ngf mRNA表达量高于Control组(P<0.001).EU提取物处理70d后,EU组细胞呈神经元样形态;IF染色显示,EU组较高比例细胞表达Nefl和MAP2,而Control组未检出(P<0.001);qRT-PCR分析显示,EU组Oct4 mRNA表达量低于Control组,而Ne-fl、Neurod1 和Ngf转录水平高于Control组(P<0.001).体内实验:转棒式疲劳仪和平衡木行走试验显示,TBI + BMSCs组小鼠运动功能恢复明显优于TBI组(P<0.001),TBI +EU_BMSCs组小鼠运动功能改善程度较TBI +BMSCs组进一步提高(P<0.001).脑组织IF染色显示,TBI +BMSCs组小鼠损伤灶内MAP2 表达水平高于TBI组(P<0.001),TBI + EU_BMSCs组小鼠MAP2 表达量进一步恢复(P<0.001).TBI +EU_BMSCs组小鼠损伤灶内GFP +移植细胞含量及分化为MAP2 +细胞的GFP +移植细胞比例均显著高于TBI +BMSCs组(P<0.001).结论 EU提取物处理可促进BMSCs向神经元分化,并显著提高BMSCs移植治疗TBI的效能.
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编辑人员丨2024/3/2
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scAAV9-IGF-1对SOD1-G93A小鼠抗凋亡通路的作用
编辑人员丨2024/3/2
目的 探索以自我互补双链腺相关病毒9为载体介导的人胰岛素样生长因子-1(scAAV9-IGF-1)对SOD1-G93A转基因小鼠抗凋亡通路的作用.方法 采用肌萎缩侧索硬化(ALS)的动物模型即转基因SOD1-G93A突变型及野生型(wild type-SOD1,WT-SOD1)小鼠,在其出生后60 d龄时,雌性同窝阳性SOD1-G93A转基因小鼠采用随机的方法分配到治疗组及溶剂对照组,治疗组全身多点肌肉注射scAAV9-IGF-1,溶剂对照组多点肌肉注射AAV9-GFP,同年龄WT-SOD1作为阴性对照组.在肌肉注射40~50 d后,利用PCR技术检测腰髓中IGF-1含量的变化,同时检测抗凋亡通路因子Bcl-xl、Bcl-2的mRNA含量变化,通过免疫组化染色观察抗凋亡通路因子Bcl-xl、Bcl-2在小鼠腰髓前角神经元中的表达.结果 PCR技术检测显示scAAV9-IGF-l处理后,腰髓中IGF-1的mRNA含量显著高于GFP对照组,抗凋亡通路因子Bcl-xl、Bcl-2的mRNA含量均高于溶剂对照组(均P<0.05),而与WT组差异无统计学意义.免疫组化染色结果显示,治疗组中抗凋亡通路蛋白Bcl-xl,Bcl-2在小鼠腰髓前角神经元中的表达多于溶剂对照组,并且与WT阴性对照组相当.结论 scAAV9-IGF-1可以激活SOD1-G93A转基因小鼠模型中的抗凋亡通路,其通过上调Bcl-xl,Bcl-2的mRNA水平,进而增加Bcl-xl、Bcl-2的蛋白表达,从而产生抗凋亡的作用.
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编辑人员丨2024/3/2
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高脂饮食介导Tau选择性剪接失衡并加重认知功能损伤
编辑人员丨2024/3/2
目的 探讨高脂饮食(High-fat diet,HFD)对认知功能的影响及HFD促进阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)发生的可能机制.方法 将8~10周龄的表达人Tau的转基因(Human Tau,hTau)AD小鼠(性别不限)随机分成2组,给予12周的HFD或正常饮食,通过水迷宫实验及情景恐惧实验评估其学习记忆能力,之后对脑组织进行逆转录-聚合酶链反应以评估Tau病变情况;将8~10周龄的hTau AD小鼠(性别不限)随机分成2组,立体定位注射丝氨酸精氨酸蛋白激酶2 N342A的慢病毒(Lentiviral-green fluorescent pro tein-serine/arginine-rich protein-specific kinase 2 N342A,LV-GFP-SRPK2 N342A)[不被剪切的SRPK2,可下调4个微管结合重复Tau(Four-repeat tauopathies,4R-Tau)]或LV-GFP病毒后连续12周给予HFD,通过水迷宫实验及情景恐惧实验评估其学习记忆能力,后对脑组织进行RT-PCR、免疫荧光染色以评估Tau病变情况.结果 HFD可干扰Tau的选择性剪切,使4R-Tau/3个微管结合重复Tau(Three-repeat tauopathies,3R-Tau)比例升高,从而加重Tau病变、促进认知功能障碍的发生;通过抑制SRPK2的剪切来调节4R-Tau与3R-Tau的比例,可使HFD的hTau AD小鼠认知功能得到改善,Tau病变减轻.结论 HFD可以介导的Tau的选择性剪接失调明显促进认知功能障碍的发生、加重Tau病变.
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编辑人员丨2024/3/2
