目的:探讨Toll样受体9（TLR9）信号通路激活对肾小管细胞转录组的影响。方法:提取并培养小鼠原代肾小管上皮细胞，在细胞融合度达80%时分为两组，分别加入10 μL磷酸盐缓冲液（PBS，PBS对照组）和终浓度为5 μmol/L的TLR9激活剂胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG-ODN，CpG-ODN处理组）。提取细胞RNA后在Illumina平台进行测序，使用差异基因分析软件DEGseq分析两组细胞中基因的差异表达情况，通过Goatools和KOBAS在线软件分析差异基因所参与的信号通路，应用Homer软件预测转录因子。结果:与PBS对照组相比，CpG-ODN处理后有584个显著的差异表达基因，其中102个基因表达上调，482个表达下调。差异表达基因富集最显著的基因本体（GO）为β-干扰素响应、病毒响应或防御等炎症反应相关条目；京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）信号通路富集结果显示，富集系数最显著的信号通路包括2'-5'-寡腺苷酸合成酶活性、核糖核酸酶活性的调节、病毒生命周期的负调控、β-干扰素响应和对原生动物的防御反应等。转录因子预测结果显示，干扰素调节因子3（IRF3）是差异基因启动子序列上富集最显著的转录因子；IRF3是TLR9下游表达差异最显著的转录因子，转录因子21（TCF21）、锌指蛋白135（ZNF135）和阳性调节域4（PRDM4）等转录因子可能是TLR9信号通路的新候选靶标。结论:CpG-ODN激活TLR9信号通路，原代肾小管上皮细胞能直接响应CpG-ODN的刺激并发生转录组学变化，为进一步探究TLR9信号通路在脓毒症相关性急性肾损伤中的分子机制研究提供了基础。

目的:探讨糖尿病状态下肾周脂肪组织(PRAT)脂肪细胞来源小细胞外囊泡(sEVs)对肾小管上皮细胞的生物行为影响以及其分子机制。方法:提取原代db/m、db/db小鼠PRAT脂肪细胞进行体外培养，收集培养上清并通过超速离心法提取sEVs(NDM-sEVs PRAT-Adipo, DM-sEVs PRAT-Adipo)。将sEVs与人肾小管上皮细胞株(HK-2)细胞孵育，观察其增殖、凋亡、自噬以及上皮-间质转化(EMT)水平。通过质谱技术分析sEVs蛋白成分，探讨其作用的分子机制。 结果:CCK8结果表明DM-sEVs PRAT-Adipo干预后HK-2细胞的增殖水平与2个对照组(Ctrl组和NDM-sEVs PRAT-Adipo干预组)相比无明显改变。Western印迹法结果表明，对比2个对照组，DM-sEVs PRAT-Adipo干预组的凋亡(Bcl-2、Cleaved-caspase 3、Caspase 3)和自噬(p62、LC3BⅠ、LC3BⅡ)水平无明显改变。Western印迹法和免疫荧光结果表明，与2个对照组比较，DM-sEVs PRAT-Adipo干预可上调HK-2的间质细胞标志蛋白(Vimentin、α-SMA、Snail2)表达水平，下调上皮细胞标志蛋白ZO-1表达水平。sEVs质谱分析结果表明，DM-sEVs PRAT-Adipo与NDM-sEVs PRAT-Adipo的差异蛋白富集于EMT相关通路。其中，DM-sEVs PRAT-Adipo富集血小板反应蛋白(THBS1)，该蛋白与EMT密切相关。 结论:糖尿病状态下，PRAT来源脂肪细胞分泌sEVs促进肾小管上皮细胞EMT上调，此过程可能由sEVs中所富集的THBS1介导。

目的:探究核受体亚家族4 A组成员1（nuclear receptor subfamily 4 group A member 1， NR4A1）在缓解顺铂对近端肾小管上皮细胞毒性的作用及其分子机制。 方法:通过“Tabula-muris”单细胞转录组测序数据库分析肾脏组织各细胞亚群 NR4A1基因的表达。在近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系及原代细胞中，通过慢病毒感染以过表达 NR4A1基因。采用细胞增殖与毒性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测顺铂的细胞毒性。细胞用碘化丙啶（propidium iodide，PI）单染后通过流式细胞仪检测细胞的死亡比例。通过实时荧光定量PCR和Western印迹法检测细胞中 NR4A1和核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， NRF2）基因的表达。通过检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）以及脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量分析细胞铁死亡程度。 结果:单细胞转录组数据分析的结果表明 NR4A1基因表达在肾脏组织的近端肾小管上皮细胞亚群中最低。50 μmol/L和100 μmol/L顺铂能够显著诱导近端肾小管上皮细胞MDA、GSSG和脂质ROS含量的上升（均 P<0.01），且顺铂浓度越高诱导MDA、GSSG和脂质ROS增加越多。相比对照HK-2细胞，过表达 NR4A1的HK-2细胞脂质ROS含量及铁离子含量显著较低（均 P<0.01），过表达 NR4A1抑制了顺铂对近端肾小管上皮细胞的毒性及其诱导的铁死亡。分子机制研究发现，在近端肾小管上皮细胞中，过表达 NR4A1上调了抗铁死亡基因 NRF2的表达（ P<0.01）。进一步单细胞转录组数据分析的结果表明，与 NR4A1在肾脏组织细胞亚群的表达状态相似， NRF2表达在近端肾小管上皮细胞中也最低。 结论:顺铂能够诱导近端肾小管上皮细胞发生铁死亡，且浓度越高越明显。 NR4A1通过上调近端肾小管上皮细胞 NRF2的表达抑制顺铂诱导的细胞铁死亡，从而缓解顺铂对细胞的毒性。

目的:分离和培养小鼠鲍曼囊壁层上皮细胞，为进一步深入研究其生理作用提供基础。方法:通过细胞筛联合磁性分离的方法分离小鼠肾小体，原代培养后获取壁层上皮细胞，诱导壁层上皮细胞分化为足细胞。使用免疫荧光染色、实时定量PCR和Western印迹法检测壁层上皮细胞和足细胞特异性标志物。结果:原代培养的壁层上皮细胞呈现铺路石样，表达壁层上皮细胞特异性标志物Claudin-1和干细胞标志物CD133和CD24，不表达肾小管上皮细胞蛋白、系膜细胞和足细胞标志蛋白。体外培养传代至6代的壁层上皮细胞仍表达Claudin-1、CD133和CD24。经过诱导分化后，壁层上皮细胞可表达足细胞特异蛋白WT-1和Synaptopodin。结论:细胞筛联合磁性分离法提取肾小体，体外培养获得的小鼠壁层上皮细胞可以在体外诱导表达足细胞标志蛋白。

目的 探讨糖尿病肾病(DN)大鼠原代肾小管上皮细胞(RTECs)的提取及体外培养方法.方法 取SD雄性大鼠25只,随机分为正常组(n=5)和模型组(n=20).对模型组大鼠构建DN大鼠模型,不给予正常组任何处理.获取两组大鼠双肾组织,一部分组织用于HE染色及Masson染色以观察肾组织结构,另一部分用于RTECs的提取及培养.RTECs的提取、培养方法:将肾皮质组织在80目筛网上研磨,经100目筛网过滤、Ⅰ型胶原酶消化25 min后,使用含10％胎牛血清、1％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂和1％青链霉素双抗溶液的DMEM/F-12完全培养基培养细胞.用免疫荧光染色法检测细胞角蛋白18的表达情况以鉴定所获得的细胞.结果 (1)建模后模型组大鼠出现多饮、多食、多尿、体重下降、血糖升高等特征,尿蛋白定性呈阳性,肾组织病理检测提示肾小球结构不完整且出现明显缺损,RTECs明显肿胀、变性,肾小管管腔萎缩,肾小管间质纤维化严重.(2)培养72h后,两组RTECs均已经贴壁并呈岛屿状聚集生长,培养5～8d后细胞呈多边鹅卵石样.模型组RTECs高表达细胞角蛋白18,阳性率＞95％.结论 采用在80目筛网上研磨、100目筛网过滤、Ⅰ型胶原酶消化25 min的方法可以得到数量较多、活性良好、纯度较高的DN大鼠模型RTECs,且在形态与贴壁情况方面与正常大鼠RTECs无明显差异.

目的:探讨肾小管上皮细胞中脂滴包被蛋白2(PLIN2)的表达变化能否预测糖尿病肾脏病(DKD)肾功能的减退,以及PLIN2促进DKD肾小管上皮细胞损伤的机制.方法:采用回顾性队列研究,选择12例非糖尿病患者(作为对照)和51例DKD患者为研究对象,收集人口学及实验室检查等资料.采用简化线性混合效应模型获得估算的肾小球滤过率(eGFR)斜率,Spearsman相关分析和广义线性模型预测PLIN2与DKD患者肾功能减退的关系.体内实验采用BKS-db/db小鼠和链脲佐菌素构建的糖尿病小鼠模型.体外实验采用葡萄糖处理原代肾小管上皮细胞,转染PLIN2 siRNA或过表达质粒.蛋白免疫印迹和免疫荧光染色检测PLIN2表达,油红染色检测脂滴蓄积,细胞实时能量代谢分析仪检测线粒体氧消耗率(OCR).结果:DKD患者肾小管中的PLIN2表达水平较对照显著升高.随访24(12,39)个月,DKD患者的eGFR斜率为-7.42(-19.77,-2.09)mL/(min·1.73 m2·year).基线时肾小管PLIN2阳性面积百分比的增大与随访期内eGFR斜率的变化显著相关[风险比(HR)=1.90,95%置信区间(CI):1.00～3.58],提示肾小管PLIN2预测DKD肾功能减退的价值.糖尿病小鼠模型肾小管中的脂滴和PLIN2表达均较对照组显著增多,葡萄糖处理造成肾小管上皮细胞中脂滴蓄积和PLIN2表达增多.干扰PLIN2显著缓解葡萄糖引起的脂滴蓄积;反之,过表达PLIN2加重葡萄糖引起的脂滴蓄积.葡萄糖处理造成肾小管上皮细胞线粒体OCR的下降在干扰PLIN2后得到缓解;然而,过表达PLIN2直接造成线粒体OCR降低.结论:肾小管PLIN2能预测DKD患者肾功能的减退.PLIN2抑制线粒体有氧呼吸,参与肾小管上皮细胞的脂滴蓄积和DKD的进展.

目的:探讨来源于肾小管的尿液外泌体中的代谢物在评估糖尿病肾脏病(DKD)中的应用价值.方法:采用横断面研究,选择健康人群(13例)、单纯2型糖尿病(T2D)患者(12例)及T2D合并DKD患者(12例)作为研究对象,收集人口学和实验室检查等资料.培养原代肾小管上皮细胞.超速离心提取尿液及细胞培养上清液中的外泌体,免疫磁珠富集表达分化簇13(CD13)的外泌体,透射电镜及纳米颗粒跟踪分析外泌体的形态,Western blot和免疫组化染色检测蛋白质的表达和分布,ELISA检测肾损伤因子1和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,超高效液相色谱-串联质谱方法靶向定量检测外泌体中的代谢物.采用偏最小二乘判别分析进行多维建模.代谢物的两组间比较采用Wilcox检验,多组间比较采用Kruskal-Wallis检验,Spearman相关分析法分析代谢物与临床指标的相关性,受试者工作特征(ROC)曲线评价诊断效能.结果:尿液外泌体中检测到CD13的表达.肾组织中CD13分布在肾小管的顶端侧.原代肾小管上皮细胞及其外泌体中均检测到CD13.在表达CD13的尿液外泌体中定量检测到144种代谢物.在单纯T2D和T2D合并DKD两组间筛选出差异具有统计学意义的15种代谢物(P<0.05),包括赖氨酸、N-乙酰丙氨酸、N-乙酰丝氨酸、正亮氨酸、N-苯乙酰苯丙氨酸、缬氨酸、鹅去氧胆酸、葡萄糖、肉豆蔻脑酸、油酸、辛二酸、十一烷酸、延胡索酸、酮亮氨酸和异戊酸,其中,N-乙酰丙氨酸、十一烷酸、酮亮氨酸、赖氨酸和鹅去氧胆酸均与尿蛋白和血尿酸显著相关(P<0.05或P<0.01).肉豆蔻脑酸、N-乙酰丙氨酸、缬氨酸和正亮氨酸的ROC曲线下面积分别为0.854(95%CI:0.705～1.000)、0.840(95%CI:0.677～1.000)、0.812(95%CI:0.640～0.985)和0.806(95%CI:0.630～0.982).结论:单纯T2D与T2D合并DKD的肾小管外泌体中的代谢物存在显著差异,从中筛选出的15种代谢物可作为临床诊断DKD的新途径.

目的 观察B细胞活化因子(BAFF)及其受体在原代小鼠肾小管上皮细胞(RTECs)的表达及对其生长特性的影响.方法 酶消化法分离培养原代小鼠RTECs;以500 U/ml干扰素(IFN)-γ刺激原代小鼠RTECs,48 h后流式细胞术(FCM)检测RTECs细胞膜上BAFF及BAFF受体(BAFF-R)的表达;以重组BAFF蛋白和/或阻断性B细胞活化因子受体-Fc融合蛋白(BAFF-R-Fc)刺激RTECs,48 h后以荧光素钠转运实验检测RTECs离子转运功能、细胞免疫荧光法检测角蛋白-18(CK-18)的表达、四唑氮化合物(MTS)法检测RTECs增殖、FCM法检测细胞凋亡.结果 小鼠RTECs经IFN-γ作用后,BAFF-R表达水平较未受IFN-γ刺激组显著上调(4 166.250±913.914比3 602.750±875.584,t=4.124,P=0.026);荧光素钠转运实验结果显示,BAFF刺激组的平均吸光度(A)值为0.011±0.003,显著低于BAFF-R-Fc± BAFF组(0.020 ±0.007)和对照组(0.016±0.006),差异均有统计学意义(t=-3.437,P=0.041;t=-3.572,P=0.038);免疫荧光结果显示,BAFF刺激组平均A值为0.032±0.005,显著低于BAFF-R-Fc+BAFF组(0.043±0.007)和对照组(0.041±0.008),差异均有统计学意义(t=-8.006,P =0.015;t=-4.603,P=0.044);5、20 ng/ml BAFF刺激组细胞增殖A值分别为(1.532±0.058)、(1.509±0.056)显著高于对照组(1.473±0.045),差异均有统计学意义(t=5.636,P=0.030;t=5.765,P=0.029)且5 ng/ml BAFF刺激组显著高于BAFF-R-Fc+ BAFF组(1.477±0.050),差异有统计学意义(t=5.085,P=0.037);BAFF刺激组细胞凋亡率为(39.850±8.544)％,显著低于BAFF-R-Fc+ BAFF组[(42.950±8.330)％]和对照组[(44.467±7.642)％],差异均有统计学意义(t=-3.399,P=0.019;t=-3.020,P=0.029).结论 BAFF/BAFF-R信号增强能促进RTECs增殖,但使其上皮细胞特性和离子转运功能显著下降.

本文旨在建立更有效的小鼠肾小管上皮细胞体外培养及鉴定方法.将小鼠肾脏皮髓质分离, 取肾皮质将其充分剪碎, 用II型胶原酶消化结合筛网过滤的方法获得小鼠近端肾小管上皮细胞, 细胞培养在DMEM中.用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况, 用流式细胞仪检测细胞增殖能力, 用CCK-8检测方法测定活力, 用免疫荧光方法鉴定肾小管上皮细胞的纯度.结果显示, 免疫荧光鉴定显示95％以上的细胞表达上皮细胞标志蛋白CK18, 90％以上的细胞表达近端肾小管上皮细胞标志蛋白Villin、AQP1和SGLT2.细胞可传至第五代, 随着传代次数增加, 细胞增殖能力逐渐降低.以上结果提示, 本研究成功建立了培养高纯度小鼠肾小管上皮细胞的方法, 用这一改良方法获得的肾小管上皮细胞可用于后续的离体实验研究.

目的:观察"益气养阴通络法"在糖尿病肾脏病(DKD)中作用并探讨其可能机制.方法:回顾性筛选整理DKDⅢ或Ⅳ期,病程半年以上患者56例,其中接受基础治疗29例,基础治疗联合"益气养阴通络法"治疗7例;同时选择肾活检诊断为肾脏轻微病变的患者21例作为非DKD对照组,检测患者血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量以及血清 α-klotho,尿液KIM-1、NGAL水平;冻干粉干预糖基化终末产物刺激的原代肾小管上皮细胞,观察上述疗效学指标.结果:"益气养阴通络法"联合基础治疗可有效降低24 h蛋白尿水平(P<0.05).而且与基础治疗组相比,"益气养阴通络法"联合基础治疗组血肌酐、尿素氮水平亦有下降趋势.基础治疗组α-klotho蛋白水平明显低于对照组(P<0.01),益气养阴通络组 α-klotho水平相比DKD组明显上调(P<0.05).体外实验也发现,"益气养阴通络法"处方含药血清可改糖尿病肾病致病因素所致肾小管上皮细胞损伤.结论:"益气养阴通络法"可延缓DKD进展,很可能与其调控 α-klotho有密切关系.