目的 基于长链非编码RNA研究养精种玉汤调控卵巢储备功能下降(DOR)模型大鼠原始卵泡启动的作用机制.方法 3日龄雌性大鼠分离卵巢后进行体外培养,设置空白组、模型组、脱氢表雄酮组和中药高、中、低剂量组,采用雷公藤甲素诱导DOR模型,分别予相应含药血清培养.HE染色观察生殖细胞并对卵泡计数,Western blot检测卵巢组织抗米勒管激素(AMH)、骨形态发生蛋白15(BMP15)、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、MST、转化生长因子(TGF)-β1、p-Smad1蛋白表达,RT-PCR检测卵巢组织AMH、BMP15、PTEN、MST、LTCONS-00011173、TGF-β1、Smad1 mRNA表达.结果 与空白组比较,模型组原始卵泡及生长卵泡数量均减少(P<0.05),卵巢组织AMH、BMP15、TGF-β1、p-Smad1蛋白表达降低(P<0.05),PTEN、MST蛋白表达升高(P<0.05),AMH、BMP15、TGF-β1、Smad1 mRNA表达降低(P<0.05),PTEN、MST、LTCONS-00011173 mRNA表达升高(P<0.05);与模型组比较,DHEA组和中药高、中剂量组原始卵泡和生长卵泡数量增加(P<0.05),卵巢组织AMH、BMP15、TGF-β1、p-Smad1蛋白表达升高(P<0.05),PTEN、MST蛋白表达降低(P<0.05),AMH、BMP15、TGF-β1、Smad1 mRNA表达升高(P<0.05),PTEN、MST、LTCONS-00011173 mRNA表达降低(P<0.05).结论 养精种玉汤可能通过LTCONS-00011173介导TGF-β1/Smad1信号通路调控DOR模型大鼠原始卵泡启动.

目的 通过检测肝细胞生长因子(HGF)及其受体(c-Met)在早期小鼠卵巢组织的表达情况,探讨HGF/c-Met信号通路在小鼠早期卵泡发育的相关性,并通过生物信息学分析HGF/c-Met通路的生物学过程及涉及的细胞内信号通路,为后续研究HGF/c-Met通路调节早期卵泡发育的分子机制打下基础.方法 选用昆明小鼠以雌∶雄(2∶1)合笼,收集生后3、7、14、21 d卵巢,采用免疫组学、蛋白免疫印迹分别检测卵巢HGF和c-Met蛋白表达及表达水平;实时荧光定量PCR检测卵巢HGF、c-Met 的mRNA表达水平.结果 HGF及c-Met蛋白在3、7、14、21 d卵巢中均有表达,且表达量随着小鼠日龄增长而增加(P<0.05),HGF、c-Met的mRNA水平也呈现相同的趋势(P<0.05);生物信息学分析发现HGF/c-Met通路涉及了多种生物学过程及PI3K/AKT等信号通路.结论 HGF/c-Met通路参与小鼠早期卵泡发育,并可能通过细胞内信号通路PI3K/AKT调控原始卵泡启动及卵泡发育的过程.

目的 探讨敲除小鼠Wdr1基因对其卵巢功能的影响.方法 用条件性基因敲除小鼠Wdr1 fl/fl和生殖细胞特异性启动子驱动的Cre重组酶转基因小鼠构建卵母细胞特异性基因敲除小鼠模型.取出生14天、28天和4个月3个时间点的Wdr1 fl/-;Ddx4-Cre小鼠与对照鼠(每个时间点每种1只),处死.取卵巢,拍照、石蜡连续切片及苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)处理,观察卵巢体积变化及各级卵泡的数量.结果 14天Wdr1 fl/-;Ddx4-Cre小鼠卵巢体积比对照小鼠略小;HE切片镜下可见原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡等,较对照鼠略少.28天及4个月Wdr1 fl/-;Ddx4-Cre小鼠卵巢体积明显小于对照小鼠;HE切片镜下可见各级卵泡明显少于对照小鼠.结论 敲除小鼠生殖细胞Wdr1基因对其早期卵巢功能略有影响,随着时间的推移,可导致卵巢早衰.

目的 探讨鸦胆子苦醇对雌性生殖细胞减数分裂启动及早期卵子发生的影响.方法 6～8周小鼠雌雄合笼,以雌性小鼠见阴栓记为胚胎0.5 d(E0.5).收集E11.5、E12.5、E13.5、E14.5的雌性胎鼠生殖嵴,分别通过qRT-PCR及Western blotting检测核因子E2(NF-E2)相关因子2(Nrf2)mRNA及蛋白水平.分离E12.5雌性胎鼠的生殖嵴,分别用二甲基亚砜(对照组)、10 nmol/L、20 nmol/L的Nrf2抑制剂——鸦胆子苦醇、1 μmol/L视黄酸或20 nmol/L鸦胆子苦醇+1 μmol/L视黄酸处理48 h后,检测Nrf2通路、减数分裂启动、视黄酸信号通路相关基因的mRNA水平.药物处理48 h后继续培养10d,对体外培养的生殖嵴行石蜡切片和HE染色进行原始卵泡计数.结果 与对照组相比,10 nmol/L、20 nmol/L的鸦胆子苦醇显著下调减数分裂启动关键基因Stra8、Sycp3及Daz1的mRNA水平(P＜0.05).与对照组的单位面积卵泡数量(151.1±6.8)相比,10 nmol/L、20 nmol/L组的单位面积原始卵泡数量显著减少(109.5±12.2,49.1±8.0)(P＜0.01).与对照组相比,20 nmol/L鸦胆子苦醇显著抑制视黄酸合成酶(P=0.001)及其受体(P=0.049)的表达.添加视黄酸能部分挽救鸦胆子苦醇对基因Raldh、RARa(P＜0.01)及基因Stra8、Sycp3及Dazl的表达抑制作用(P＜0.01).结论 鸦胆子苦醇通过抑制Nrf2通路调控减数分裂启动及早期卵子发生.

目的 探讨PTEN对大鼠原始卵泡激活和生长的调控作用和机制.方法 2日龄大鼠卵巢在Waymouth培养系统中培养0、4和8 d,用HE染色检测慢病毒PTEN siRNA的沉默效率及其对原始卵泡生长启动情况.同步用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色检测PTEN mRNA和蛋白在卵泡生长中的表达和动态变化;用慢病毒PTEN-shRNA沉默卵巢中PTEN表达后,观察对原始卵泡启动生长及雌二醇和孕酮分泌的影响;此外,利用PI3K抑制剂LY294002探讨了PTEN在原始卵泡形成过程中的可能信号通路.结果 PTEN mRNA和蛋白在原始卵泡中均有表达,随着原始卵泡的发育,其表达水平降低(P<0.01);经PTEN-shRNA慢病毒转染后,荧光成像显示慢病毒在体外已成功转染到卵巢组织,HE染色显示原始卵泡数量减少(P<0.01),表明PTEN参与了原始卵泡的起始.结论 PTEN可通过PI3K信号通路和调节雌、孕激素分泌调控原始卵泡发育.它在原始卵泡的发育启动中起着重要的作用.

目的 NOBOX是在原始卵泡激活过程中起关键作用的转录因子,可直接调控Gdf9转录,并参与GDF9/SMAD通路影响颗粒细胞增殖分化,但其在初级卵泡及之后的具体调控机制并不清楚.Kit作为影响卵泡发育的重要基因,其启动子存在多个NOBOX结合位点.本研究拟探索在初级卵泡发育阶段,转录因子NOBOX对Kit的转录调控作用,以及通过GDF9/SMAD通路对卵泡发育的影响.方法 体外培养初级卵泡统计发育时间;qRT-PCR检测显微注射Nobox-siRNA的初级卵泡中Nobox、Kit、Kitl、Gdf9的mRNA表达变化;Western blot检测显微注射Nobox-siRNA的初级卵泡中NOBOX、KIT、P-SMAD的蛋白表达变化;ChIP实验验证转录因子NOBOX在Kit基因启动子上的结合位点.结果 初级卵泡在体外培养第5天可发育为次级卵泡,注射Nobox-siRNA的初级卵泡延缓2 d发育至次级;初级卵泡中注射Nobox-siRNA后,卵泡中Nobox、Kit、Kitl、Gdf9 mRNA表达显著下调,NOBOX、KIT、P-SMAD2/3蛋白表达量降低;转录因子NOBOX可以结合于Kit基因启动子.结论 NOBOX是小鼠初级卵泡发育至次级卵泡的关键基因,NOBOX可直接结合Kit基因启动子,且影响初级卵泡中KITL/KIT和GDF9/SMAD通路.

多囊卵巢综合征(PCOS)患者存在卵泡发育和成熟障碍.卵巢颗粒细胞在原始卵泡的启动和生长发育过程中发挥着重要的调控作用,其中颗粒细胞的线粒体参与了细胞周期、代谢及信号转导等方面的调节,并通过能量代谢途径为卵母细胞减数分裂、受精直至早期胚胎发育提供能量支持.研究颗粒细胞的线粒体功能是探索PCOS的病理机制、评价卵母细胞质量和胚胎发育潜力的最佳无创性方法之一.大量证据显示,PCOS与卵巢颗粒细胞线粒体功能障碍相关,其机制包括线粒体DNA(mtDNA)拷贝数改变和mtDNA基因突变等.有研究从改善PCOS颗粒细胞的线粒体功能入手,对改善PCOS卵泡发育和成熟障碍进行了探索.该文对近年来PCOS颗粒细胞线粒体功能障碍的相关研究进展进行综述,以探讨PCOS颗粒细胞线粒体功能障碍的发生机制及其改善途径和方法.

雄激素与青春期女性生殖发育的生理病理密切相关,对卵巢卵泡发育具有重要影响.雄激素可以直接通过雄激素受体发挥作用,刺激原始卵泡发育启动;也可作为雌激素底物,转化为雌激素后间接发挥作用.由于性腺轴不稳定,青春期女性与多囊卵巢综合征(PCOS)临床表现具有一定重合.适量雄激素可促进卵巢发育,雄激素缺乏不利于卵巢正常发育,雄激素过多则会导致PCOS,肾上腺网状带合成的雄激素也会对卵巢发育产生影响.对雄激素与卵巢卵泡发育关系的进一步研究,有助于诊断青春期PCOS,也可为具有窦前卵泡的不孕患者提供新的治疗方向.

DNA损伤是影响配子发生和胚胎发育的关键因素之一.卵母细胞容易被各种内外源因素(如活性氧、辐射、化疗药物等)诱发DNA损伤.目前研究发现,对于各类DNA损伤,各发育阶段的卵母细胞能够做出相应的 DNA 损伤反应,通过复杂的机制对 DNA 进行修复或者启动细胞凋亡.相比于进入生长阶段的卵母细胞,原始卵泡卵母细胞更容易被DNA损伤诱导凋亡.DNA损伤不易诱导卵母细胞减数分裂成熟进程停滞,然而携带DNA损伤的卵母细胞的发育能力明显下降.在临床上,衰老、放疗和化疗是导致女性卵母细胞DNA损伤、卵巢储备降低和不孕的常见原因.为此,人们尝试了能够减轻卵母细胞 DNA 损伤和增强 DNA 修复能力的多种方法,试图保护卵母细胞.本文对哺乳动物的各发育阶段卵母细胞的DNA损伤与修复的相关研究进行了梳理和总结,并讨论了其潜在的临床价值,以期为生育力保护提供新的策略.

卵泡发育是受多种基因、激素、细胞因子等相互协调,共同调控的动态过程,历经原始卵泡的启动募集、窦前卵泡的发育、优势卵泡的选择、排卵和黄体生成 4个阶段[1].这个生物学过程复杂且漫长,以卵泡直径增大伴随颗粒细胞增殖和功能分化为特征.