目的:探索葡萄糖对滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞Akt2基因甲基化和mRNA水平的影响及早孕期外周血Akt2 mRNA水平与孕前体质指数（BMI）和妊娠期糖尿病（GDM）的关系。方法:（1）构建GDM孕妇子宫内高血糖环境细胞模型，按培养液的葡萄糖浓度分为2.5、5.0、10.0、25.0、40.0 mmol/L 5组；使用实时荧光定量PCR技术检测Akt2 mRNA水平，质谱检测Akt2基因启动子区域的甲基化水平。（2）收集2014年12月至2016年7月在北京大学第一医院分娩的60例孕妇的早孕期外周血，根据其孕前BMI及有无GDM分为4组：超重非GDM组、超重GDM组、肥胖非GDM组和肥胖GDM组。实时荧光定量PCR技术检测4组孕妇早孕期外周血中Akt2 mRNA水平。结果:（1）随培养液中葡萄糖浓度的升高，Akt2 mRNA水平显著升高，呈浓度依赖性（ P均<0.05）。与25.0 mmol/L组相比，5.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域的甲基化位点胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸（CpG）10、CpG23、CpG24.5，2.5 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG23、CpG24.5位点，10.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG10位点，均出现显著的甲基化水平的改变（ P均<0.05）；与5.0 mmol/L组相比，40.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG10位点出现显著的甲基化水平的改变（ P<0.05）。（2）与超重非GDM组［1.04（0.90~1.26）］比较，超重GDM组［2.10（1.85~2.28）］和肥胖GDM组［1.68（0.82~2.43）］Akt2 mRNA水平均升高，差异均有统计学意义（ P均<0.05）。与肥胖GDM组［1.68（0.82~2.43）］比较，超重GDM组［2.10（1.85~2.28）］Akt2 mRNA水平较高，肥胖非GDM组［1.00（0.71~2.17）］Akt2 mRNA水平较低，但差异均无统计学意义（ P均>0.05）。 结论:葡萄糖可能通过改变Akt2基因启动子区域的甲基化状态，从而影响Akt2 mRNA水平，且这种变化可能在GDM孕妇的早孕期已经出现，特别是在孕前BMI较低的孕妇中。

目的:评价黄芪甲苷对帕金森病小鼠黑质磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法:SPF级健康雄性C57BL/6小鼠45只，8周龄，体重19~25 g，采用随机数字表法分为3组( n＝15)：对照组(C组)、帕金森病组(PD组)和黄芪甲苷组(A组)。采用连续7 d每天腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)30 mg/kg的方法制备小鼠帕金森病模型，A组连续7 d于注射MPTP前30 min每天腹腔注射黄芪甲苷20 mg/kg，C组腹腔注射等量生理盐水。给药完成后间隔1 d时测定行为学。随后处死小鼠取脑组织黑质，采用Western blot法检测酪氨酸羟化酶(TH)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。 结果:与C组比较，PD组和A组运动总距离和下落潜伏期缩短，悬挂评分降低，步宽增加，黑质TH、p-PI3K、p-Akt和BDNF表达下调，GFAP表达上调( P<0.05)；与PD组比较，A组运动总距离和下落潜伏期延长，悬挂评分升高，步宽减少，黑质TH、p-PI3K、p-Akt和BDNF表达上调，GFAP表达下调( P<0.05)。 结论:黄芪甲苷改善帕金森小鼠运动功能障碍的机制与激活PI3K/Akt信号通路，上调BDNF表达，抑制星形胶质细胞活化有关。

目的:评价分泌磷蛋白1(SPP1)在脊髓损伤小鼠神经病理性痛内源性保护机制中的作用及其与血管内皮生长因子(VEGF)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的关系。方法:清洁级健康雌性昆明小鼠72只，7~8周龄，体重30~35 g，采用随机数字表法分为4组( n＝18)：假手术组(Sham组)、脊髓损伤致神经病理性痛组(NP组)、脊髓损伤致神经病理性痛+SPP1-siRNA组(NS-siRNA组)和脊髓损伤致神经病理性痛+空载病毒组(NP-EV组)。采用半横断脊髓的方法制备小鼠神经病理性痛模型。NS-siRNA组和NP-EV组鞘内注射7 μl AAV-SPP1-siRNA-GFP腺病毒或空载腺病毒AAV-vector-GFP后5 d制备模型。于术后1、2和3周时每组随机取6只小鼠测定机械缩足反应阈(PWMT)和热刺激甩尾潜伏期(TFL)，随后处死取同侧损伤部位脊髓组织，采用RT-PCR法检测SPP1 mRNA表达，Western blot法检测SPP1、VEGF、Akt和p-Akt的表达。 结果:与Sham组比较，NP组、NS-siRNA组和NP-EV组术后1、2和3周时PWMT降低，TFL缩短，脊髓SPP1 mRNA、SPP1、VEGF和p-Akt表达上调( P<0.05)；与NP组比较，NS-siRNA组术后1、2和3周时PWMT降低，TFL缩短，脊髓SPP1 mRNA、SPP1、VEGF和p-Akt表达下调( P<0.05)；与NS-siRNA组比较，NP-EV组术后1、2和3周时PWMT升高，TFL延长，脊髓SPP1 mRNA、SPP1、VEGF和p-Akt表达上调( P<0.05)。 结论:SPP1参与了脊髓损伤小鼠神经病理性痛的内源性保护机制，可能与激活脊髓VEGF/Akt信号通路有关。

目的:探讨法舒地尔对主动脉平滑肌细胞（VSMC）自噬及凋亡的影响以及与磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的关系。方法:用10%胎牛血清+DMEM培养液培养SD大鼠VSMC，并利用免疫细胞化学染色法检测传代细胞α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的表达情况鉴定VSMC。采用血小板源性生长因子（PDGF）诱导VSMC，并将PDGF诱导的VSMC分为空白组、对照组、法舒地尔组（30 μmol/L法舒地尔）、法舒地尔+LY294002组（30 μmol/L法舒地尔+25 μmol/L LY294002）。采用MTT法检测各组细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡率和凋亡周期，GFP-mRFP-LC3双荧光检测细胞自噬水平。采用蛋白免疫印迹法（WB）检测各组细胞Bax、Bcl-2、LC3、Beclin-1及PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表达情况并比较分析。结果:镜下观察培养细胞呈长梭形、放射性生长，出现典型的"峰-谷"样结构，a-SMA阳性表达率为99%，确认所培养细胞为高纯度主动脉VSMC。法舒地尔组细胞增殖能力低于对照组（ P<0.05），法舒地尔+LY294002组高于法舒地尔组（ P<0.05）。与对照组比较，法舒地尔组凋亡率及G 0-G 1期细胞比例升高（均 P<0.05）；与法舒地尔组相比，法舒地尔+LY294002组凋亡率及G 0-G 1期细胞比例回降（均 P<0.05）。与对照组比较，法舒地尔组自噬增强（ P<0.05），而法舒地尔+LY294002组的自噬则较法舒地尔组有所减弱（ P<0.05）。与对照组比较，Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1水平以及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平升高（均 P<0.05）；法舒地尔+LY294002组Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin 1水平以及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平较法舒地尔组有所回降（均 P<0.05）。 结论:法舒地尔通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制VSMC增殖，促进自噬及凋亡，改善血管功能。

目的:探讨miR-26a介导磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)信号通路对脑缺血大鼠血管生成的影响。方法:将100只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、miR-NC组和miR-26a组。miR-NC组和miR-26a组分别侧脑室注射5 μl miR-26a模拟物阴性质控品和miR-26a模拟物，假手术组和模型组注射等量生理盐水。采用改良线栓法制作大脑中动脉闭塞模型，假手术组只插线不结扎。各组大鼠各取5只腹腔注射5-溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)，1次/d，连续7 d。将体外培养并转染的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)分为对照组、氧葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)组、miR-NC组和miR-26a组。双荧光素酶实验验证miR-26a对第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10, PTEN)的调控作用。应用Longa评分检测大鼠神经功能损伤。氯化三苯四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法测定脑梗死体积。分别使用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)染色法、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法和小管形成实验测定BMECs增殖、凋亡和血管生成。应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测缺血脑组织及BMECs miR-26a表达。免疫荧光双标记法[BrdU/von Willebrand因子(von Willebrand factor, vWF)]检测大鼠血管内皮细胞增殖。蛋白质印迹分析检测缺血脑组织血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管生成素-2(angiopoietin-2, Ang-2)、PTEN、PI3K、AKT表达。结果:生物信息学及双荧光素酶实验验证了miR-26a对PTEN的靶向调控。与假手术组比较，模型组和miR-NC组缺血脑组织miR-26a、VEGF、bFGF、Ang-2、PI3K、AKT表达和BrdU +/vWF +细胞数量增加，而PTEN表达降低( P均<0.05)；与模型组比较，miR-26a组各项指标效果更加显著( P均<0.05)。与对照组比较，OGD组和miR-NC组BMECs增殖和血管生成能力显著增强，细胞凋亡显著减少( P均<0.05)；与OGD组比较，miR-26a组各项指标效果更加显著( P均<0.05)。 结论:miR-26a能靶向抑制PTEN表达，通过激活PI3K/AKT信号通路上调血管生成相关因子(VEGF、bFGF和Ang-2)，促进脑梗死大鼠血管内皮细胞增殖和血管生成。

目的:探究磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路在胰高血糖素样肽链-1(GLP-1)拮抗晚期氧化蛋白产物(AOPP)诱导妊娠滋养细胞凋亡的保护作用机制。方法:体外培养妊娠滋养细胞HTR-8/SVneo，将细胞分为对照组、AOPP组、GLP-1组、AOPP+GLP-1组、AOPP+GLP-1+LY294002组。对照组采用1640培养基培养；AOPP组采用200 μg/ml AOPP刺激；GLP-1组采用50~100 nmol/L GLP-1刺激1 h后进行实验；AOPP+GLP-1组采用200 μg/ml AOPP刺激48 h后再加入GLP-1(50~100 nmol/L)1 h后进行实验；AOPP+GLP-1+LY294002组在AOPP+GLP-1组干预基础上再加入PI3K抑制剂LY294002。蛋白免疫印迹(Western blot)法检测PI3K/Akt通路相关蛋白磷酸化蛋白激素B(p-Akt)的表达。CCK-8比色法检测细胞活力。酶联免疫吸附法(ELISA)检测凋亡启动蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)，caspase-3的含量，及凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyto-C)的含量。结果:AOPP刺激后，AOPP组的p-AKT表达低于对照组( P<0.05)；经50、100 nmol/L两个浓度GLP-1干预后，AOPP+GLP-1组p-AKT表达显著高于AOPP组(均 P<0.05)。经100 nmol/L GLP-1干预24、48 h后，AOPP+GLP-1组p-AKT表达显著高于AOPP组(均 P<0.05)。AOPP刺激后，AOPP组的细胞活力低于对照组( P<0.05)；经GLP-1干预后，AOPP+GLP-1组细胞活力显著高于AOPP组( P<0.05)，加入PI3K抑制剂LY294002处理后，AOPP+GLP-1+LY294002组的细胞活力显著低于AOPP+GLP-1组( P<0.05)。ELISA结果发现，AOPP刺激后，AOPP组的凋亡启动蛋白caspase-3、caspase-9，凋亡蛋白Bax及Cyto-c含量高于对照组(均 P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2含量低于对照组(均 P<0.05)；经GLP-1干预后，AOPP+GLP-1组caspase-3、caspase-9、Bax及Cyto-c含量显著低于AOPP组(均 P<0.05)，Bcl-2含量高于AOPP组( P<0.05)，加入PI3K抑制剂LY294002处理后，AOPP+GLP-1+LY294002组的Bcl-2含量低于AOPP+GLP-1组，Bax及Cyto-c含量高于AOPP+GLP-1组(均 P<0.05)。 结论:GLP-1可能介导PI3K/Akt通路拮抗AOPP诱导妊娠滋养细胞HTR-8/SVneo的凋亡。

目的 研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)信号激活对乳腺癌BT549细胞增殖的影响.方法 将细胞分为对照组和实验组.实验组用0.1、1.0和10.0 μmol·L-1 S1P受体激动药SEW2871处理乳腺癌细胞72 h;对照组用含0.1％胎牛血清培养基培养.用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况.建立乳腺癌BT549细胞过表达S1P受体的细胞模型,将转染的细胞分为空白质粒组(LUC)、野生型S1P受体组(WT)、S1P受体磷酸化位点突变组(MUT).用MTT法检测细胞增殖情况,并计算细胞增殖率;用克隆集落形成实验检测细胞克隆形成能力.用S1P受体拮抗药W146(10 μmol·L-1)及蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制药MK2206(90 nmol·L-1)检测S1P信号在乳腺癌BT549细胞增殖中的作用,用蛋白质印迹法检测磷酸化信号传导与转录激活因子-3(p-STAT3)蛋白、原癌基因c-Myc蛋白的表达情况.结果 对照组和0.1、1.0和10.0μmol·L-1实验组的细胞增殖率分别为 1.00±0.03、1.13±0.06、1.06±0.10 和 1.07±0.03,SEW2871在0.1 μmol·L-1时可促进细胞增殖(P＜0.05).过表达S1P受体后,WT组、MUT组与LUC组相比,细胞增殖率和克隆集落形成数量均明显增加(均P＜0.05).用W146处理后,LUC组、MUT组、WT组的细胞相对增殖率分别为1.25±0.12、1.31±0.03 和 1.43±0.14;用 MK2206 处理后 LUC 组、MUT 组、WT组的细胞相对增殖率分别为0.87±0.15、0.77±0.03和0.88±0.02;WT组、MUT组与相应DSMO组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.01).用W146处理后,LUC组、MUT组、WT组的细胞克隆形成数量分别为(65.65±5.12),(141.48±5.63)和(93.64±5.14)个,WT 组、MUT 组与相应DSMO组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).MK2206处理后,LUC组、MUT组、WT组的p-STAT3蛋白相对表达水平分别为0.67±0.04、0.69±0.08和0.81±0.06,原癌基因c-Myc蛋白相对表达水平分别为1.69±0.03、0.70±0.10和 0.67±0.07,WT 组、MUT 组的上述指标与 DMSO 组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 S1P信号激活可促进乳腺癌BT549细胞增殖,其机制可能与AKT及STAT3信号通路有关.

目的 基于网络药理学及分子对接技术探讨连理汤治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制.方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台检索连理汤6味中药的活性化学成分及其作用靶点;通过OMIM?、DrugBank、TTD、DISEASES、GeneCards?等数据库获取UC的相关靶点;对连理汤活性化学成分的作用靶点和UC的相关靶点取交集;使用Cytoscape3.8.2软件构建连理汤治疗UC的"中药-活性成分-靶点"网络以筛选主要活性化学成分.通过STRING数据库及Cytoscape 3.8.2软件构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,筛选核心靶点.应用DAVID数据库对交集靶点进行基因本体论(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.使用AutoDock软件对主要活性化学成分和核心靶点进行分子对接.结果 共获得连理汤活性化学成分110个,作用靶点229个,UC相关靶点1 538个,取交集后获得134个连理汤治疗UC的相关靶点.通过构建"中药-活性成分-靶点"获得槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、芒柄花黄素等11个主要活性化学成分,通过构建PPI网络筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤抑癌蛋白p53(TP53)、IL-1B、原癌基因C-Jun(JUN)等10个核心靶点.GO功能富集分析结果显示,交集靶点涉及的生物过程主要与凋亡过程、炎症反应、信号转导等有关,涉及的细胞组分与细胞核、胞质溶胶、蛋白质复合物、核质等有关;涉及的分子功能与酶结合、转录因子结合、蛋白质结合、细胞因子活性等有关.KEGG通路富集分析结果显示,交集靶点主要富集在TNF信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/AKT信号通路、缺氧信号因子1信号通路、Toll样受体信号通路等.分子对接结果表明,槲皮素、山柰酚、异鼠李素、芒柄花黄素、β-谷甾醇等与核心靶点AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1B、JUN等表现出较强的亲和力.结论 连理汤治疗UC具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点,连理汤的多个主要活性化学成分可能通过AKT1、TNF、IL-6、TP53、IL-1B、JUN等多个靶点作用于多个信号通路来发挥抗炎、免疫调节、维持肠黏膜免疫屏障、调节肠道菌群等作用,从而达到治疗UC的目的.

目的 观察蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化模型中的表达及其对核心结合因子α1(Cbfα1)表达的调节.方法 体外培养的大鼠VSMC,分为正常磷组(1.3 mmol/L)和高磷组(2.6 mmol/L),培养7d后,观察细胞形态及茜素红染色细胞钙盐沉积,实时定量PCR检测Cbfα1、骨桥蛋白(OPN) mRNA水平,Western印迹检测磷酸化Akt(p-Akt)(ser473)、磷酸化mTOR(p-mTOR)(S2448)、Cbfα1和OPN蛋白的表达.检测到Akt、mTOR活化表达后,给予不同浓度的渥曼青霉素(5、10、30、50和100 nmol/L)和雷帕霉素(1、10和100 ng/ml)干预24、48 h后,检测Cbfα1、OPN、p-Akt和p-mTOR基因和蛋白表达,7d后观察VSMC钙盐沉积变化.结果 VSMC高磷干预7d后,与正常磷组相比,高磷组钙盐沉积明显,Cbfα1、OPN mRNA表达增高(均P＜0.05),p-Akt、p-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达增高(均P＜0.05).渥曼青霉素、雷帕霉素干预24 h后,相对于高磷组,高磷+渥曼青霉素30、50、100 nmol/L组Cbfα1、OPNmRNA表达明显下调(均P＜0.05);高磷+雷帕霉素1、10和100 ng/ml组Cbfα1、OPN mRNA表达下调(均P＜0.05).渥曼青霉素、雷帕霉素干预48 h后,与高磷组比较,高磷+渥曼青霉素30、50、100 nmol/L)组p-Akt、Cbfα1和OPN蛋白表达明显下调(均P＜0.05);高磷+雷帕霉素1、10、100 ng/ml组,p-mTOR、Cbfα1和OPN蛋白表达呈剂量依赖性下调(均P＜0.05).VSMC培养7d后,与高磷组相比,高磷+渥曼青霉素和高磷+雷帕霉素组钙盐沉积明显减轻.结论 高磷可体外诱导大鼠VSMC钙化,Akt、mTOR参与了高磷诱导的大鼠VSMC钙化,并可能通过调控Cbfα1因子而起作用.

目的 通过检测肢体远隔缺血后适应(limb ischemic postconditioning, LIP )后p-Akt蛋白及胱天蛋白酶-9和Bcl-2 mRNA表达,探讨磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K )/Akt通路在LIP保护大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用.方法 42只Wistar大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组和LIP组.缺血再灌注组和LIP组均采用线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型. LIP组在脑缺血2 h后再灌注前实施3个循环健侧股动脉LIP(5 min缺血/5 min再灌注).采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积,免疫组化染色法检测p-Akt蛋白表达,原位杂交法检测胱天蛋白酶-9和Bcl-2 mRNA表达.结果 与脑缺血再灌注组比较,LIP组脑梗死体积显著缩小(P<0.05),p-Akt蛋白和Bcl-2 mRNA表达水平显著增高(P均<0.05),胱天蛋白酶-9 mRNA表达水平显著降低(P<0.05).结论 LIP可缩小局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积,其机制可能与上调p-Akt蛋白和Bcl-2 mRNA表达以及下调胱天蛋白酶-9 mRNA表达有关,提示LIP可通过PI3K/Akt通路减轻脑缺血再灌注损伤.