目的:构建同时表达神经纤毛蛋白质1(NRP-1)和存活素(Survivin)双基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒，通过体内外实验，观察其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响。方法:构建同时表达NRP-1和Survivin双基因的质粒(Plasmid-1)，并构建单独表达NRP-1和Survivin基因质粒(分别为Plasmid-2、Plasmid-3)。转染入鼻咽癌CNE-2Z细胞株，于荧光显微镜观察质粒转染及表达情况；以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力；定量聚合酶链反应(PCR)及免疫印迹法(Western blot)在mRNA水平和蛋白水平上检测目的基因抑制作用。建立稳定转染裸鼠移植瘤模型，体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果。原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测移植瘤细胞凋亡率。多组间比较采用单因素方差分析。结果:通过测序证实重组shRNA真核表达载体构建成功。各重组质粒表达载体成功转染CNE-2Z细胞，可见大量的癌细胞表达绿色荧光。MTT显示细胞增殖受到抑制，且双基因干扰质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因干扰质粒，差异有统计学意义(0.209±0.021比0.392±0.013、0.384±0.014， F＝354.121， P<0.05)。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实双基因联合沉默组和单基因沉默组均能有效抑制目的基因mRNA表达，双基因组NRP-1 mRNA(0.20±0.06)表达明显低于NRP-1单基因组(0.27±0.05)，差异有统计学意义( F＝198.437， P<0.05)；双基因组Survivin mRNA表达(0.13±0.02)明显低于Survivin单基因组(0.17±0.01)，差异有统计学意义( F＝245.647， P<0.05)。Western blot检测结果双基因组对NRP-1和Survivin蛋白的表达抑制率分别为67.41%和79.24%，与单基因组比较均有统计学意义( F＝129.354、216.411， P<0.05)。体内抑瘤实验证实，与NRP-1单基因干扰组[(0.628±0.013) cm 3]、Survivin单基因干扰组[(0.601±0.301) cm 3]比较，双基因干扰组[(0.205±0.002) cm 3]瘤体积生长明显受到抑制，差异有统计学意义( F＝49.214， P<0.05)，抑瘤率为81.71%。TUNEL实验表明双基因干扰组凋亡指数[(49.84±1.98)%]，显著高于NRP-1单基因组[(21.53±2.01)%， P<0.05]和Survivin单基因组[(19.91±2.11)%]，差异有统计学意义( F＝254.130， P<0.05)。 结论:同时表达两个不同基因的shRNA质粒载体转染鼻咽癌细胞后，可同时敲降NRP-1和survivin基因表达，与单个基因沉默比较，可以更好的促进细胞凋亡，抑制细胞生长增殖。

目的:观察双基因重组载体预防兔乙醇性股骨头坏死(ONFH)的组织病理学变化。方法:自2018年1月至2019年6月将购自河南省实验动物中心的80只兔采用完全随机化原则分为5组：正常组(N，正常动物，空白对照)、致敏组(H，仅马血清致敏，不给予白酒)、模型组[M，马血清致敏，烈性白酒10 ml/(kg·d)灌胃]、无关序列组[Con，马血清致敏，白酒灌胃，一侧股骨头注入无关序列pGFP-V-RS转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)]、双基因组(S，马血清致敏，白酒灌胃，一侧股骨头内注入双基因重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP转染的BMSCs)。实验第4、8周末分批处死动物，观察兔股骨头病理学改变。两样本两组间比较采用 t检验；分类变量数据资料分析采用 χ2检验；数值变量资料统计采用方差分析、组间比较采用最小显著性差异法(LSD)。 结果:实验第8周，S、H组中骨小梁面积分数分别为(40.80±3.16)、(41.20±3.65)%，与正常组[(41.80±3.63)%]比较差异无统计学意义( t＝0.588、0.661， P>0.05)，明显高于M组[(28.10±2.55)%]、Con组[(28.30±2.65)%]，差异均有统计学意义( t＝8.846、8.496、8.322、8.089， P<0.01)。S、H、N组中空骨陷窝计数分别为(13.30±1.66)、(13.10±1.63)、(12.30±1.46)%，组间比较差异均无统计学意义( t＝0.243、1.279、1.273， P>0.05)，明显低于M组[(39.30±3.86)%]、Con组[(39.10±3.65)%]，差异均有统计学意义( t＝17.502、18.397、17.686、18.397、18.505、19.282， P<0.01)。S、H组中最大脂肪细胞平均直径分别为(42.55±4.16)、(42.53±4.15) μm，与正常组[(41.36±3.85) μm]比较，差异均无统计学意义( t＝0.594、0.577， P>0.05)，明显低于M组[(52.31±5.26) μm]、Con组[(52.19±5.13) μm]，差异均有统计学意义( t＝4.116、4.128、4.129、4.141, P<0.01)。M、Con组中出现明显的早期ONFH病理学变化，股骨头软骨下骨区的造血组织显著减少，骨小梁变细稀疏、中断、结构紊乱，骨髓坏死，骨小梁面积分数降低、空骨陷窝显著增多，脂肪细胞增殖肥大，脂肪组织堆积。N组中无这些ONFH病理学改变。S、H组中病理学改变很少，骨组织结构接近于N组。8周时，M、Con组中病理学变化比4周时加重，ONFH发生率为87.5%、87.5%，而S、H、N组中为12.5%、12.5%、0%( χ2＝9.833、9.833、12.444、9.833、9.833、12.444, P<0.01)，差异有统计学意义。 结论:双基因重组载体能够高效阻止乙醇导致兔ONFH的组织病理学改变，预防乙醇性ONFH的发生，显著优于单一基因的作用。

目的 观察双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞对其成脂与成骨基因表达的影响.方法 取第3代兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),随机分为6组:(1)正常组:正常BMSCs,无特殊处理.以下5组均给予终质量浓度0.09 mol/L乙醇.(2)模型组:无基因转染BMSCs;(3)无关序列组:10μl无关序列载体转染BMSCs;(4)干扰过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达组(siPPARγ组):10μl siPPARγ基因载体转染BMSCs;(5)exCGRP组:10μl降钙素基因相关肽(CGRP)基因载体转染BMSCs;(6)双基因组:10μl双基因重组载体转染BMSCs.实验第7、14天检测各组细胞中PPARγ、CGRP、Runt相关基因2(Runx2)、骨钙素mRNA与其蛋白表达.结果 实验第7天,双基因组、siPPARγ组、正常组中PPARγ mRNA与蛋白均呈低表达(0.329±0.037与0.162 ±0.013、0.413 ±0.045与0.174±0.023、0.376±0.042与0.169±0.021),明显低于模型组(0.672±0.079与0.871±0.096)、无关序列组(0.674±0.083与0.823±0.089)、exCGRP组(0.683±0.079与0.839±0.091),差异均有统计学意义(均P=0.000).双基因组、exCGRP组中均明显表达CGRP mRNA与蛋白,显著高于模型组、无关序列组、siPPARγ组、正常组,差异均有统计学意义(均P =0.000).双基因组、exCGRP组、siPPARγ组、正常组中Runx2mRNA、骨钙素mRNA与蛋白均呈高表达,双基因组显著高于模型组、无关序列组,且明显高于exCGRP组、siPPARγ组、正常组,差异均有统计学意义(均P =0.000).实验第14天,各组表达量与第7天一致.结论 双基因重组载体转染乙醇诱导的兔干细胞,能够同时高效阻止细胞中成脂基因表达并上调成骨基因表达,显著优于单一基因的作用.

目的 观察双基因重组载体对乙醇作用下兔干细胞增殖与成骨活性的影响.方法 取第3代兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),随机分为6组:(1)正常组:正常培养BMSCs,无基因转染;(2)模型组:无基因转染BMSCs;(3)无关序列组:10μl无关序列载体转染BMSCs;(4)沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ (siPPARγ)组:10μl siPPARγ基因载体转染BMSCs;(5)表达降钙素基因相关肽(exCGRP)组:10μl CGRP基因载体转染BMSCs;(6)双基因组:10μl双基因重组载体转染BMSCs.除正常组外,其余各组细胞给予终质量浓度0.09 mol/L乙醇.采用噻唑蓝(MTT)法检测BMSCs增殖,第14天检测各组细胞内碱性磷酸酶活性、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、培养基中骨钙素含量,并作碱性磷酸酶(ALP)染色.结果 双基因组细胞增殖明显,增殖曲线接近于正常组.细胞中ALP活性、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原、培养基中骨钙素含量:双基因组数值最高,分别为(18.593±2.350) U/L、(24.422 ±3.110) ng/ml、(5.951 ±0.650) μg/L、(5.836 ±0.630) ng/ml,显著高于模型组[(6.528 ±0.830) U/L、(9.422±1.250) ng/ml、(1.733±0.230) μg/L、(2.016 ±0.240) ng/ml]、无关序列组[(7.011±0.850) U/L、(9.693±1.260) ng/ml、(1.663 ±0.220) μg/L、(1.913±0.230) ng/ml],明显高于siPPARγ组[(13.536 ±1.710) U/L、(17.103±2.230) ng/ml、(3.486±0.410) μg/L、(3.686±0.420) ng/ml]、exCGRP组[(13.692 ±1.760) U/L、(17.185 ±2.240) ng/ml、(3.525±0.420) μg/L、(3.833±0.430) ng/ml]、正常组[(15.056±1.910) U/L、(18.528±2.430) ng/ml、(4.035±0.460)μg/L、(4.012±0.460) ng/ml],差异均有统计学意义(均P=0.000).模型组、无关序列组数值显著低于正常组,差异均有统计学意义(均P=0.000).siPPARγ组、exCGRP组数值略低于正常组,差异均无统计学意义:ALP活性(P=0.222、0.274),层粘连蛋白(P =0.362、0.390),Ⅰ型胶原(P=0.082、0.105),骨钙素(P =0.276、0.543).双基因组数值显著高于正常组,差异有统计学意义:ALP活性(P=0.031),层粘连蛋白(P=0.010),Ⅰ型胶原、骨钙素(均P =0.001);且明显高于siPPARγ组、exCGRP组,差异均有统计学意义:ALP活性(P =0.005、0.006),层粘连蛋白(P=0.003、0.003),Ⅰ型胶原、骨钙素(均P=0.000).ALP染色显示:双基因组中大量细胞胞质染色为深蓝色,且较正常组多.结论 双基因重组载体可以保持乙醇作用下兔干细胞正常增殖,显著促进成骨活性,优于单一基因作用.

目的 构建Ⅱ型猪链球菌05ZYH33菌株双组分系统Ihk/Irr的双基因缺失突变株.方法 首先对双组分系统 Ihk/Irr基因进行序列分析;选取Ihk/Irr基因的相关片段克隆至pET30a表达载体,进行可溶表达并注射家兔制备抗体;分别将ihk基因上游irr基因下游各1 kb的片段扩增,将两个片段连接起来;克隆至温敏型pJRS233的穿梭质粒中;利用两步同源重组法获得突变体;分别提取突变株的基因组DNA,RNA及菌体总蛋白,利用PCR, RT-PCR,Western-blot方法验证突变体.结果 成功制备了双组分系统Ihk/Irr可溶性表达的蛋白,成功构建了重组的温敏型ikr-pJRS233重组质粒,成功将重组质粒转入猪链球菌05ZYH33中并获得突变株,基因组PCR,RT-PCR及Western-blot分别证实了双组分系统Ihk/Irr双基因被成功敲除.结论 成功构建重组温敏型的穿梭质粒,导入到猪链球菌05ZYH33菌株中经两步同源重组获得突变株,在基因组DNA,RNA及蛋白水平上验证了双组分系统Ihk/Irr双基因缺失株的成功构建.

目的 构建携带骨形成蛋白-2(BMP-2)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)双基因过表达的慢病毒载体,观察其对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响.方法 体外培养兔BMSCs,构建携带bFGF和BMP-2双基因的重组慢病毒载体,转染至BMSCs诱导两种基因过表达;流式细胞仪检测转染效率;Western blot方法验证双基因转染模型构建成功;MTT方法检测细胞增殖水平.结果 慢病毒以最佳感染复数(MOI) 100转染BMSCs时转染效率最佳,Western blot检测到转染后细胞bFGF和BMP-2蛋白表达量明显比对照增加(P＜0.05);MTT结果发现,过表达bFGF和BMP-2的BMSCs细胞的增殖水平增加(P＜0.05).结论 bFGF和BMP-2双基因共表达重组腺病毒载体促进BMSCs细胞增殖.

目的 用RNA干扰(RNAi)技术同时下调血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R),观察其对自发性高血压大鼠(SHR)血压及主动脉重构的影响.方法 30只SHR随机分为5组,每组6只:空白对照组 (注射生理盐水);病毒对照组(注射对照腺病毒);重组腺病毒载体(Ad5)-ACE-短发夹环RNA (shRNA)治疗组;Ad5-AT1R-shRNA治疗组;Ad5-ACE-AT1R-shRNA治疗组(分别注射表达ACE基因、AT1R基因、ACE和AT1R基因特异shRNA的重组腺病毒载体);同时设WKY正常血压对照组(注射生理盐水).以上各组大鼠均于实验的第1、17天各注射1次,干预前后检测血压、心率的变化.于首次注射后第3天,用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测主动脉ACE和AT1R mRNA的表达;用Western blot检测主动脉ACE和AT1R蛋白的表达.实验结束时做主动脉组织光镜病理检查观察主动脉结构.结果 首次注射后第3天,Ad5-ACE-shRNA、Ad5-AT1R-shRNA、Ad5-ACE-AT1 R-shRNA治疗组尾动脉压分别下降(25.2±5.3)、(23.5±4.8)、(27.1±6.4)mm Hg,3个治疗组降压效应可持续15 d,SHR空白对照组和病毒对照组尾动脉压持续升高,正常血压对照组尾动脉压无明显变化,治疗组较空白对照组和病毒对照组下降(均P＜0.05).Ad5-ACE-shRNA、Ad5-AT1 R-shRNA、Ad5-ACE-AT1R-shRNA治疗组主动脉组织中的ACE、AT1R mRNA和蛋白表达明显低于空白对照组、病毒对照组(均P＜0.05).光镜观察显示3个治疗组主动脉结构明显改善,Ad5-ACE-AT1 R-shRNA治疗组最显著.结论 ACE和AT1R双基因沉默,产生较单基因位点的阻断更明显的降压及逆转主动脉重构效应.

背景:P75神经生长因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)在不同细胞中可以介导截然不同的信号通路,但是在骨髓间充质干细胞中所传导的调节作用还尚未研究;脂质体和慢病毒介导单基因转染细胞技术已趋向成熟,但是其介导双基因转染的差异比较还未见报道.目的:构建大鼠P75NTR、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的过表达质粒及慢病毒载体,比较脂质体和慢病毒介导2种基因转染骨髓间充质干细胞的效果和实用性,以便于今后根据不同实验要求选择实验最优方案.方法:设计大鼠P75NTR及NGF的基因引物,提取基因组DNA进行PCR扩增、与质粒载体重组构建表达增强绿色荧光的GV358-P75NTR、表达增强红色荧光的GV492-NGF过表达质粒,转染293T细胞,加入慢病毒载体超速离心,收集目的基因过表达慢病毒,测定病毒样品滴度;选取体外培养的大鼠原代骨髓间充质干细胞,一组用脂质体Lipo3000共转染质粒GV358-P75NTR、GV492-NGF,另一组用慢病毒共感染,同时设置阴性对照组和空白对照组,对转染后的骨髓间充质干细胞常规培养,第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达,Western blot检测P75NTR及NGF蛋白表达,对转染后培养至7 d的骨髓间充质干细胞进行消化传代培养,培养第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达以及Western blot检测P75NTR、NGF蛋白的表达.结果与结论:①构建的GV358-P75NTR、GV492-NGF过表达质粒及慢病毒符合实验设计;②显微镜视野中红绿色荧光的丰度:脂质体共转染组先增加后降低,慢病毒共感染组持续增多;各时间点慢病毒组均多于脂质体组;脂质体转染组传代培养细胞的荧光表达相比于未传代前降低,而慢病毒转染组未见明显变化;③各时间点慢病毒感染组的P75NTR及NGF蛋白表达量明显高于脂质体组,目的基因转染组的P75NTR及NGF蛋白表达量均高于阴性对照组及空白对照组,差异有显著性意义(P<0.05);④P75NTR、NGF双基因均能通过脂质体和慢病毒共转染方法在大鼠骨髓间充质干细胞中过表达;脂质体双基因转染操作相对简便,实验设备依赖性低,费用相对低廉,但感染效率明显低于慢病毒,而慢病毒双基因共感染后目的基因存在着持续表达,传代后基因丢失现象不明显.

目的 观察双基因重组载体在兔乙醇性股骨头坏死模型中抑制成脂与促进成骨基因表达的作用.方法 健康新西兰大耳白兔80只,随机平均分为5组:(1)双基因组:马血清致敏后烈性白酒10mL/(kg·d)灌胃,一侧股骨头内注入转染双基因重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP的骨髓间充质干细胞(BMSCs).(2)无关序列组:马血清致敏后烈性白酒10 ml/(kg·d)灌胃,一侧股骨头内注射转染无关序列pGFP-V-RS的BMSCs.(3)模型组:马血清致敏后烈性白酒10 ml/(kg·d)灌胃.(4)致敏组:仅马血清致敏.(5)正常组:空白对照.实验第4、8周提取各组兔股骨头组织中总RNA及总蛋白,应用TaqMan实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)与蛋白质印迹法(Westernblot)检测过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)、降钙素基因相关肽(CGRP)、核心结合蛋白因子2(Runx2)、骨钙素(Osteocalcin) mRNA与蛋白表达.应用SPSS 17.0统计软件分析,两样本两组间比较采用t检验;数值变量资料统计采用方差分析,组间比较采用LSD法.结果 实验第4周,双基因组股骨头细胞内PPARγ mRNA与蛋白表达量(0.502±0.054与0.302±0.035)与正常组(0.486±0.054与0.315 ±0.041)接近,差异均无统计学意义(P＞0.05);明显低于模型组(0.821±0.092与0.703±0.081)、无关序列组(0.875±0.103与0.664±0.077),差异均有统计学意义(P＜0.05).双基因组CGRP mRNA与蛋白呈高表达(0.772±0.109与0.608±0.059),显著高于正常组(0.467±0.062与0.296±0.027)、模型组(0.118±0.015与0.113±0.010)、无关序列组(0.123±0.016与0.122±0.013),差异均有统计学意义(P＜0.05).双基因组Runx2、Osteocalcin mRNA与蛋白呈高表达(0.733±0.092与0.613±0.069)、(0.628±0.073与0.673±0.081),显著高于正常组(0.436±0.057与0.325±0.036)、(0.367±0.041与0.374±0.046)、模型组(0.133±0.014与0.096 ±0.012)、(0.096±0.010与0.126±0.015)、无关序列组(0.113±0.016与0.104 0.011)、(0.087 ±0.011与0.132±0.015),差异均有统计学意义(P＜0.05).实验第8周各组表达量与第4周一致.结论 双基因重组载体能够有效靶向阻断活体兔乙醇性ONFH模型股骨头细胞内成脂基因表达,同时促进细胞内成骨基因表达,显著优于单一基因的作用.

目的 构建单纯痕疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)UL27和UL29双基因shRNA慢病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达.方法 针对HSV-2 UL27、UL29基因,各筛选干扰效率最佳的shRNA片段相连接,构建双基因共表达慢病毒载体,并转染HEK293细胞作为干扰组,另设空白对照组(不做任何处理)和阴性对照组(转染不针对任何基因的慢病毒载体).转染48或24 h后接种HSV-2,RT-PCR和Western blot法检测各组细胞中目的基因mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测各组细胞的存活率.结果 干扰组UL27和UL29基因mRNA的表达抑制率可达(78.61±2.14)％和(84.86±1.52)％,同时gB和ICP8蛋白的相对表达量明显下降(P均＜0.05),细胞的存活明显率提高(P均＜0.05).结论 构建的HSV-2 UL27、UL29双基因shRNA重组慢病毒表达载体能在HEK293细胞中表达,为后续HSV-2的基因治疗奠定了实验基础.