单纯疱疹病毒1 型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)是一种能够在各类人群中携带和传播并能引起包括口唇疱疹、荚膜炎、角膜炎和病毒性脑炎等疾病的重要病原体.虽然已有多种类型的HSV-1 疫苗处于研发的不同阶段,但仍没有商业化的疫苗上市销售.临床上使用的特异性抗HSV-1 药物如阿昔洛韦、伐昔洛韦和喷昔洛韦等也面临严重的抗药性威胁,开发新的特异性抗HSV-1 药物是当前所面临的主要任务之一.siRNA是一种长度为 20～25 核苷酸的双链RNA,通过在转录后水平上沉默基因表达发挥干扰作用.siRNA作为一种新的、有潜力的抗病毒药物备受关注,发展也较为迅速.综述近年来siRNA在抗HSV-1 方面的研究进展,包括靶向HSV-1 关键基因和HSV-1 互作的宿主细胞基因的siRNA设计、递送和靶向策略.

目的:构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法:首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3)，在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo，shRNA慢病毒重组质粒构建成功后，将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞，从而获得病毒液。实验Ⅰ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组( n＝6)：空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组，各组分别转染MOI为10的相应病毒液，转染48 h时，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率，以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组( n＝36)：空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组，各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体)，于转染24、48和72 h时，采用CCK-8法测定细胞存活率，荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率。 结果:实验Ⅰ　成功构建了2种shRNA-A2aR慢病毒载体(shRNA-A2aR 1、3)。shRNA-A2aR 3病毒液滴度为3.5×10 8 TU/ml。与V组和shRNA-A2aR 1组比较，shRNA-A2aR 3组心肌细胞A2aR表达下调( P<0.01)，shRNA-A2aR 3慢病毒载体干扰效率73%。实验Ⅱ　选择shRNA-A2aR 3慢病毒载体转染24 h时，各组细胞存活率均>85%；转染48 h时，MOI5组和MOI10组细胞存活率>80%；转染72 h各组细胞存活率<70%。倒置荧光显微镜下可见，MOI5组荧光密度稍低，MOI10组转染48 h及MOI20组转染24 h时，荧光密度较高且细胞状态较好；转染72 h时各组心肌细胞活力明显下降、死亡细胞增加。Western blot显示：MOI10组转染48 h、MOI15组转染48 h、MOI20组转染24和48 h时干扰效率均>70%。 结论:成功构建了大鼠shRNA-A2aR慢病毒载体，且MOI为10、转染48 h或MOI为20、转染24 h为最佳转染方案。

第二大类成簇规律间隔短回文重复序列与相关蛋白（CRISPR-Cas）包括靶向编辑双链DNA的Cas9、Cas12系统和靶向编辑单链RNA的Cas13系统。与传统的锌指核酸酶和转录激活样因子效应物核酸酶相比，第二大类CRISPR-Cas系统具有操作简单，特异性好，效率高等优点。近年来，第二大类CRISPR-Cas系统在妇科恶性肿瘤领域被广泛应用。因此，本文就其在妇科恶性肿瘤研究模型建立、肿瘤发病及耐药机制、功能基因筛选和靶向治疗等领域的研究进展进行综述。

目的:通过生物信息数据库的挖掘，探究转移性黑色素瘤和乳腺癌脑转移的关键调控基因、生物学特征和通路。方法:使用基因表达综合(GEO)数据库中转移性黑色素瘤和乳腺癌脑转移的样本数据集GSE8401、GSE46517和GSE12237进行差异基因筛选，设定 P<0.05及logFC>2具有统计学意义，找出差异基因(DEGs)。进一步对DEGs进行基因本体论(Gene Ontology)分析和DAVID数据库通路分析，使用String数据库制作DEGs的蛋白质相互作用(PPI)网络并利用Cytoscape可视化，使用分子复合物检测(MCODE)插件用于筛选Cytoscape中PPI网络的显著交互模块，使用cytoHubba插件对网络进一步分析，采用六种算法来选择枢纽基因，最后使用GeneMARIA数据库构建了枢纽基因和具有共同生物学功能的基因的共表达网络。 结果:最终得到158个DEGs( P<0.05，logFC>2)，其中45个基因显著下调，113个显著上调。筛选所得的DEGs主要GO富集为：(1)生物过程(BP)：DEGs主要富集在RNA剪接的调控，通过剪接体调控mRNA的剪接，DNA重组的正调控，双链断裂修复的正调控。(2)细胞成分(CC)：DEGs主要集中在核小体，焦点黏附，细胞-基质结合点，核染色体，原始溶酶体，嗜酸性颗粒体。(3)分子功能(MF)：DEGs主要集中在DNA转录因子结合和RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合上。通过string数据库，获得初步的DEGs的PPI网络(度截止＝2，节点分数截止＝0.2，k核心＝2，最大深度＝100)，得到158个蛋白质节点和196条连线。通过Cytoscape筛选获得显著的交互模块，模块1的MCODE得分为4.8，而其seed基因为UBE2V1。筛选出核心DEGs 5个，分别为UBE2N、UBE2V2、RBX1、UBE2B和RXRA。 结论:泛素化途径和核调控的细胞死亡和代谢在转移性黑色素瘤和乳腺癌脑转移中发挥重要作用。

蝙蝠能携带多种病毒，并且是唯一会飞的哺乳动物，能进行远距离飞行，非常容易将病毒传播给人和其他动物。蝙蝠作为多种人兽共患病病毒的自然宿主，近10年来研究发现，许多新发传染病病原都与蝙蝠有关。蝙蝠携带的呼肠孤病毒具有独特的分节段双链RNA，易发生病毒间重组，引起致病力改变，是具有潜在危害的蝙蝠源病毒。以往认为人感染该病毒呈现无症状或症状轻微，但近年发现呼肠孤病毒能导致一些严重的人类疾病。本文就蝙蝠携带的呼肠孤病毒的病毒特点、演化发展及其致病性进行概述。

目的:了解采用干扰素治疗的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者干扰素受体(interferon-α receptor，IFNAR)、干扰素刺激基因因子3( interferon-stimulated gene factor 3，ISGF3)、双链RNA依赖蛋白激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase，PKR)、核糖核酸酶L(ribonuclease L，RNase L)的表达水平。方法:纳入2014年7月至2017年6月南昌大学第一附属医院感染科收治的41例CHB初治患者，18例给予聚乙二醇干扰素α-2b治疗，23例患者给予普通干扰素治疗。采用反转录荧光聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测治疗前，治疗4、8、12、24周时患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase L的mRNA和蛋白质表达水平。比较治疗有效组和无效组患者上述指标的表达水平。统计学分析采用 t检验。 结果:治疗24周时，25例患者治疗有效，16例治疗无效。治疗4周时，有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2和PKR的mRNA表达水平分别为0.748±0.129、1.169±0.125和1.047±0.091，分别高于无效组患者的0.591±0.021、0.689±0.059和0.791±0.033，差异均有统计学意义( t＝-4.304、16.482、-5.346，均 P<0.01)；有效组患者PBMC中ISGF3和RNase L的mRNA表达水平分别为0.739±0.159和0.780±0.140，无效组患者分别为0.690±0.035和0.733±0.122，差异均无统计学意义( t＝-0.160、-1.443，均 P>0.05)。基线，治疗8、12和24周时，有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的mRNA表达水平均高于无效组，差异均有统计学意义(均 P<0.01)。基线，治疗4、8、12和24周时，有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的蛋白质表达水平均高于无效组，差异均有统计学意义(均 P<0.01)。 结论:采用干扰素治疗后，CHB患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的mRNA和蛋白质表达水平均可升高，其中IFNAR2和PKR在治疗早期(4周)即明显升高。

目的:探讨GNG4与卵巢癌顺铂耐药A2780/DDP细胞DNA损伤修复及化疗敏感性的关系。方法:将A2780/DDP细胞分为500 ng/ml顺铂作用组（cDDP组）、短发夹RNA（shRNA）-GNG4沉默GNG4表达组（shRNA组）、500 ng/ml顺铂和shRNA-GNG4干预组（shRNA+cDDP组）、未经顺铂和shRNA-GNG4干预组（空白对照组）。采用蛋白质印迹法检测各组细胞GNG4和γH2AX蛋白的表达，单细胞凝胶电泳法检测各组细胞DNA损伤情况，免疫荧光法检测γH2AX基因在损伤位点的焦点形成情况，平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果:与其他3组相比，shRNA+cDDP组GNG4蛋白表达水平最低，γH2AX蛋白表达水平最高，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。单细胞凝胶电泳法检测显示，空白对照组、cDDP组、shRNA组、shRNA+cDDP组细胞彗星尾DNA百分含量分别为（7.7±2.5）%、（12.3±3.6）%、（20.1±2.1）%、（38.6±2.8）%，Olive尾距分别为5.12±1.89、8.23±2.97、14.99±3.65、22.43±3.17，shRNA+cDDP组细胞彗星尾DNA含量和Olive尾距均高于其他3组，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。免疫荧光法检测显示，空白对照组、cDDP组、shRNA组、shRNA+cDDP组每个细胞中γH2AX的焦点数分别为（4.2±0.7）个、（5.1±0.5）个、（26.8±3.3）个、（71.3±6.2）个，shRNA+cDDP组均高于其他3组，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。空白对照组、cDDP组、shRNA组、shRNA+cDDP组克隆形成率分别为（78.27±5.01）%、（45.67±3.29）%、（26.20±5.76）%、（1.56±0.21）%，shRNA+cDDP组均低于其他3组，差异均有统计学意义（均 P<0.001）。 结论:下调GNG4的表达可增加卵巢癌A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性，其可能是通过抑制顺铂诱导的DNA损伤修复功能实现的。

目的:构建DEK基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体，并探讨其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法:采用RNAi技术，根据DEK基因的干扰序列，合成Oligo DNA,退火形成双链DNA，将其克隆到酶切后的小干扰RNA表达载体pLKO.1上，构建重组慢病毒载体pLKO.1-sh hDEK，经293T细胞包装，收集病毒上清液，感染细胞。采用实时逆转录PCR（RT-PCR）和免疫蛋白印迹法（Western blot）检测人肝癌细胞Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721和HepG2中DEK的表达及感染慢病毒的各组细胞中DEK的敲低效率。分别通过细胞计数试剂盒-8（CCK8）增殖实验、流式细胞术、划痕实验检测细胞增殖能力、克隆形成能力、凋亡及迁移能力。两组间均数比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。 结果:酶切鉴定和DNA测序结果证实，重组慢病毒载体pLKO.1-sh hDEK1及pLKO.1-sh hDEK3构建成功。RT-PCR和Western blot结果显示，肝癌细胞Bel-7402和Huh7中DEK的表达较高，pLKO.1-sh hDEK3能更有效地抑制DEK基因的表达（ P < 0.05），因此选择pLKO.1-sh hDEK3重组慢病毒感染肝癌细胞Bel-7402和Huh7进行后续的功能实验。CCK8细胞增殖实验结果显示肝癌细胞Bel-7402和Huh7感染重组慢病毒后，细胞增殖能力与空白对照及阴性对照相比减弱（ P < 0.05）；细胞凋亡结果显示敲低组细胞凋亡率高于空白对照及阴性对照组（ P < 0.05）；细胞划痕实验结果显示敲低组划痕愈合率低于空白对照及阴性对照组（ P < 0.05），差异均有统计学意义；而空白对照及阴性对照组比较，差异无统计学意义。 结论:靶向沉默肝癌细胞中DEK的表达，能够抑制细胞增殖及迁移能力，并诱导凋亡，为进一步研究DEK基因在肝癌中的作用奠定基础。

蝙蝠是尼帕病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒等人畜共患病毒的重要宿主。然而，蝙蝠体表的吸血节肢动物是否也携带这些病毒，以及吸血节肢动物携带的病毒与蝙蝠携带的病毒之间的关系尚未报道。本研究于2012—2015年在中国云南省收集了蝙蝠体表686只吸血节肢动物，其中包括蝠蝇、蛛蝇、蜱、螨和跳蚤。采用宏转录组学方法对这些节肢动物携带的病毒进行分析，发现了144种高度多样性的单股正链RNA、单股负链RNA和双链RNA病毒，其中138种是潜在的新病毒。这些病毒分属14个不同的病毒科或目，包括布尼亚病毒目、单分子负链RNA病毒目、呼肠孤病毒科和小核糖核酸病毒目。进一步分析发现，布尼亚病毒目是蜱中最丰富的病毒群(占总病毒RNA的84%)，而裸露核糖核酸病毒在蛛蝇和蝠蝇的文库中最丰富(52%~92%)，其次是solemoviruses(南方菜豆花叶病毒)(1%~29%)和呼肠孤病毒(0%~43%)。这些病毒基于节肢动物类型高度聚类。值得注意的是，在蝙蝠携带的节肢动物的病毒组中没有发现蝙蝠传播的人畜共患病毒，这似乎并不支持蝙蝠体表的节肢动物是蝙蝠携带的人畜共患病毒的传播媒介。

目的:观察双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）抑制剂2-氨基嘌呤（2-AP）对盲肠结扎穿刺（CLP）的脓毒症模型小鼠器官损伤血浆炎症因子表达及死亡率的影响。方法:无特异病原体（SPF）级C57BL/6小鼠40只，随机分为假手术（Sham）组、CLP组、2-AP组和CLP+2-AP组（ n=10）。术后24 h收集外周血血清，进行丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）及炎症因子（IL-1β、IL-10和TNF-α）的检测；取肺组织进行病理检测；取外周血和腹腔灌洗液进行细菌清除率检测。另外取60只C57BL/6小鼠，按照上述分组（ n=15）进行7 d生存率观察。组间计量资料比较采用独立样本 t检验。 结果:CLP组和CLP+2-AP组小鼠肝损伤指标（ALT和AST水平）和肾损伤指标（Cr和BUN）均较Sham组显著升高（均 P<0.001）。CLP+2-AP组ALT和AST水平均显著低于CLP组（ t=27.88、11.33，均 P<0.001）；肾功能损伤指标方面，CLP+2-AP组Cr和BUN水平均较CLP组显著下降（ t=11.02、7.15，均 P<0.001）。与Sham组相比，CLP组血浆中促炎（IL-1β和TNF-α）及抑炎（IL-10）细胞因子水平均显著升高（均 P<0.001）；CLP+2-AP组小鼠血浆IL-1β和IL-10水平均显著降低（均 P<0.001），而血浆TNF-α水平下降不明显（ P=0.33）。Sham组小鼠7 d生存率为100%，CLP+2-AP组为13.3%，2-AP组为86.7%，CLP+2-AP组为20.0%。抑制PKR活化可轻微改善CLP模型小鼠7 d生存率趋势（Mantel-Cox检验分析，χ 2=0.0012， P=0.97）。 结论:在脓毒症小鼠模型中，抑制PKR活性可对降低血浆中炎症因子表达，减少血液和腹腔中细菌负荷，对器官损伤具有保护作用，提示抑制PKR活性在脓毒症治疗中具有应用潜力。