蝙蝠能携带多种病毒，并且是唯一会飞的哺乳动物，能进行远距离飞行，非常容易将病毒传播给人和其他动物。蝙蝠作为多种人兽共患病病毒的自然宿主，近10年来研究发现，许多新发传染病病原都与蝙蝠有关。蝙蝠携带的呼肠孤病毒具有独特的分节段双链RNA，易发生病毒间重组，引起致病力改变，是具有潜在危害的蝙蝠源病毒。以往认为人感染该病毒呈现无症状或症状轻微，但近年发现呼肠孤病毒能导致一些严重的人类疾病。本文就蝙蝠携带的呼肠孤病毒的病毒特点、演化发展及其致病性进行概述。

蝙蝠是尼帕病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒等人畜共患病毒的重要宿主。然而，蝙蝠体表的吸血节肢动物是否也携带这些病毒，以及吸血节肢动物携带的病毒与蝙蝠携带的病毒之间的关系尚未报道。本研究于2012—2015年在中国云南省收集了蝙蝠体表686只吸血节肢动物，其中包括蝠蝇、蛛蝇、蜱、螨和跳蚤。采用宏转录组学方法对这些节肢动物携带的病毒进行分析，发现了144种高度多样性的单股正链RNA、单股负链RNA和双链RNA病毒，其中138种是潜在的新病毒。这些病毒分属14个不同的病毒科或目，包括布尼亚病毒目、单分子负链RNA病毒目、呼肠孤病毒科和小核糖核酸病毒目。进一步分析发现，布尼亚病毒目是蜱中最丰富的病毒群(占总病毒RNA的84%)，而裸露核糖核酸病毒在蛛蝇和蝠蝇的文库中最丰富(52%~92%)，其次是solemoviruses(南方菜豆花叶病毒)(1%~29%)和呼肠孤病毒(0%~43%)。这些病毒基于节肢动物类型高度聚类。值得注意的是，在蝙蝠携带的节肢动物的病毒组中没有发现蝙蝠传播的人畜共患病毒，这似乎并不支持蝙蝠体表的节肢动物是蝙蝠携带的人畜共患病毒的传播媒介。

实验动物微生物质量对科学研究数据的有效性和重复性以及人类健康和动物福利至关重要.目前,独立通风笼具(individual ventilation cage,IVC)已成为主流的啮齿类实验动物饲养系统.针对这种饲养方式的病原体监测方法最常用的是脏垫料哨兵动物法(soiled bedding sentinels,SBS),该方法是以间接接触和延迟反馈的方式监测鼠群的微生物携带状况,能有效监测通过粪-口途径传播的病原体如小鼠肝炎病毒、呼肠孤病毒等.但这种方法难以监测到主要通过气溶胶、直接接触等途径传播的病原体,例如仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌等.排风粉尘(exhaust air dust,EAD)-PCR监测方法分为在IVC笼架排风管道中拭子采样,用以监测管道相对应的笼架;主机初效过滤前拭子采样,用以监测整个IVC笼架;EAD收集装置采样,用以监测同一个主机连接的所有笼架.不同IVC厂商针对各自的IVC系统开发了相应的EAD收集装置,使操作便捷,容易实现标准化.目前,与SBS方法相比,EAD-PCR方法的检出率和时效性都有显著提升,最快暴露一周就可检出,可作为SBS方法的补充或替代,有利于维护实验动物福利.本文对上述两种病原体监测方法的应用进展进行综述,同时结合本实验室和送检单位EAD-PCR监测的实施情况,对该方法存在的局限性进行分析并提出解决方案.EAD-PCR方法有助于减少活体哨兵动物的使用量,可以更好地维护实验动物福利的"3Rs"原则.

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUMSCs)运载3型呼肠孤病毒(Reo3)对人慢性髓系白血病K562细胞的溶瘤效应.方法:流式细胞术检测hUMSCs和K562细胞表面Reo3易感受体——连接黏附分子A(JAM-A)表达情况,电镜观察Reo3感染hUMSCs 72 h后胞内病毒包涵体分布.将不同(0、1、2和3)感染复数(MOI)的Reo3感染hUMSCs 24、48、72、96和120 h后利用CCK-8法筛选最适MOI.选择最适滴度的Reo3感染hUMSCs 24、48、72、96和120 h后收集上清液,利用小鼠成纤维细胞系L929结合半数组织培养感染剂量(TCID50)法测定各组上清液中Reo3病毒滴度以确定最适感染时间.将K562细胞分为对照组、hUMSCs组、Reo3组和hUMSCs-Reo3组,hUMSCs组和hUMSCs-Reo3组设置hUMSCs与K562细胞作用的低、中、高比例(5∶1、10∶1和20∶1).CCK-8法分析hUMSCs-Reo3与K562细胞共培养24、48、72 h后K562细胞活力的变化.流式细胞术评估细胞凋亡.利用L929细胞确定抗Reo3单克隆抗体的半数效应浓度(EC50);验证在体外抗体存在条件下hUMSCs-Reo3对K562细胞溶瘤作用的变化.Western blot检测运载体作用于K562细胞后胞内Bcl-2、Bax、survivin和cleaved caspase-3蛋白水平.构建K562细胞的BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型(每组6只),分析hUMSCs-Reo3在体内对K562细胞的抑瘤效果.结果:hUMSCs和K562细胞表面JAM-A分子表达量分别为11.0%和99.0%.电镜显示Reo3感染hUMSCs 72 h后胞内出现大量病毒包涵体.在120 h范围内,与未感染组相比,MOI=1的Reo3对hUMSCs活力无显著影响,故最佳MOI为1;TCID50结果显示,MOI=1的Reo3感染hUMSCs 48 h后细胞裂解液中病毒滴度最高,故最适感染时间为48 h.hUMSCs-Reo3作用24、48和72 h后K562细胞活力呈现剂量与时间依赖性抑制.抗Reo3单克隆抗体的EC50为1∶34;在体外不同浓度(1∶34、1∶300和1∶600)抗体存在条件下,hUMSCs仍能运载Reo3抑制K562细胞活力并诱导凋亡发生.与对照组相比,hUMSCs-Reo3作用48 h后K562细胞中Bcl-2和survivin表达水平显著下调(P<0.05),Bax和cleaved caspase-3表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01).在BALB/c裸鼠荷瘤模型中,荷瘤体积测定、肿瘤组织和主要脏器病理学分析及小动物活体成像仪检测组织蛋白酶B/L活性结果表明,运载体在体内对K562细胞具有溶瘤效应而对正常组织无不良影响.结论:hUMSCs可有效运载Reo3,该运载体系在体内、外实验中能够释放足量Reo3抑制K562细胞恶性增殖并促进细胞凋亡,从而发挥溶瘤效应.

目的 构建表达禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白的重组腺病毒载体pAd-σC,并检测其对肝癌细胞增殖的影响,为新型抗肿瘤疫苗的研发奠定基础.方法 采用PCR法扩增ARVσC基因,构建重组穿梭载体pShuttle-σC,随后转化含有腺病毒载体pAdessy-1的BJ5183感受态细胞,通过同源重组获得重组腺病毒载体pAd-σC,在HEK293细胞内包装病毒,TCID50法检测病毒滴度,Western blot和ELISA法检测σC蛋白的表达,CCK-8法检测病毒对人肝癌细胞SMMC7721增殖的影响.结果 重组穿梭载体pShuttle-σC经双酶切及测序鉴定证明构建正确,重组腺病毒载体pAd-σC经菌落PCR鉴定证明构建正确;σC蛋白在肝癌细胞SMMC7721中可成功表达;重组腺病毒Ad-σC效价为107.5/0.1 mL,可抑制肝癌细胞SMMC7721增殖.结论 成功构建了含有ARV σC基因的重组腺病毒载体pAd-σC,初步分析其对肿瘤细胞增殖具有抑制作用,为揭示ARV溶瘤效应的分子机制及进一步研发新型抗肿瘤生物制剂奠定了基础.

[背景]由鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus-2,CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血坏死病在鲫和金鱼中的暴发给水产养殖业造成了巨大的经济损失.[目的]开发一种快速、现场检测鲫是否感染过CyHV-2 和监测鲫CyHV-2 IgM抗体水平的胶体金检测试纸条.[方法]将CyHV-2 与胶体金结合作为金标抗原、Protein A作为检测线、兔源rORF66 多克隆抗体进行划线作为质控线,分析胶体金试纸条最佳制备及组装条件,确定胶体金标记最适pH、金标抗原最适浓度,以及检测线(test line,T线)、质控线(control line,C线)最适划线浓度等.[结果]本研究制备的CyHV-2 抗体胶体金试纸条可以使用全血测试,与常见的其他鱼类抗体血清无交叉反应,如草鱼呼肠孤病毒抗体阳性血清、鳜虹彩病毒抗体阳性血清等.试纸条最低限度可以检测到 1:100 稀释的阳性血清抗体,由试纸条检测线的深浅可以初步判断鱼体中抗体水平.试纸条通过对 10 条鲫鱼血清样品检测并和金鱼造血器官坏死病毒检测方法(GB/T 36194-2018)进行Kappa分析,Kappa值为 0.80,表明二者有较高的符合率.[结论]本研究制备的试纸条具有较高的灵敏度和特异性,具有操作简单和成本较低的特点,对鱼类检疫、鱼体抗体水平评价等具有实际应用价值.

目的 筛选出宿主细胞中与纳尔逊湾呼肠孤病毒(NBV)非结构蛋白σNS互作的RNA结合蛋白并分析其生物信息学功能.方法 本研究通过构建NBV σNS真核表达载体pEF-HA-MB-S3,验证正确后转染HEK293T细胞,所得的细胞蛋白裂解液经RNase A处理后,利用免疫沉淀富集σNS结合蛋白,经LC-MS/MS质谱分析技术鉴定分析互作蛋白,并且借助相关生信工具挖掘蛋白性质和具体功能.结果 本实验成功筛选出32个与NBV σNS蛋白存在互作的候选RNA结合蛋白;生物分析结果显示,这些蛋白主要定位于细胞质与细胞核中,并且主要参与细胞代谢、生物调控、病毒翻译与转录等生物学过程.结论 本研究初步分析与NBVσNS互作的RNA结合蛋白功能,为深入研究σNS蛋白在NBV生命周期中的作用机制奠定基础.

目的 旨在建立基于实时荧光多酶恒温扩增(exo-MIRA)技术的小鼠细小病毒(MVM)核酸检测新方法.方法 收集2021年1月至2022年1月南京大学医学院附属金陵医院实验动物室共75份小鼠肠道内容物标本.针对MVM VP2基因的保守区域设计4对引物,琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物以筛选最优引物对,并设计特异性荧光探针,构建exo-MIRA 检测法.通过检测梯度稀释模拟样本,进行检出限评价.检测其他小鼠病毒,包括仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠鼠痘病毒(Ect)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼肠孤病毒(Reo),分析exo-MIRA法的交叉反应性.采用qPCR法和exo-MIRA法同时检测收集的75份标本,统计分析两种方法的一致性.以qPCR法为参比方法,评估该法的敏感度和特异度,进行诊断效能评价.结果 采用exo-MIRA技术建立MVM核酸检测方法,该方法检测MVM的检出限为10 copies/μL,且与其他五种小鼠病毒无交叉反应,可特异性检出MVM.75份标本检出结果显示,exo-MIRA法和qPCR法高度一致,Kappa值为0.921(P＜0.05),exo-MIRA法的敏感度为100.0％,特异度为96.7％.结论 建立了一种基于实时荧光MIRA恒温扩增技术的MVM核酸检测方法,具有简单快速、实验要求低、敏感特异等优点.该方法可应用于现场复杂环境的即时检测,在实验动物质量检测应用上有一定前景.

溶瘤病毒通过感染癌细胞,引起病毒性细胞病变并诱发宿主抗肿瘤免疫反应,从而选择性感染和杀死癌细胞.美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药物管理局(EMA)最近批准了世界上第一个用于治疗恶性黑色素瘤的溶瘤病毒制剂,命名为Imlygic.Imlygic为表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的单纯疱疹病毒I型(HSV-1)活病毒颗粒,经直接注射入肿瘤组织引起肿瘤细胞裂解和机体抗肿瘤免疫双重效应.除了HSV-1外,尚有许多不同类型的病毒已经进入临床试验,评估其生物安全性和抗肿瘤疗效.这些正在临床试验的溶瘤病毒包括腺病毒、痘病毒、麻疹病毒和呼肠孤病毒等.治疗的肿瘤包括卵巢癌、腹膜癌、肝癌、胶质瘤和黑色素瘤等.目前,溶瘤病毒治疗肿瘤的临床试验约有67项,一些临床试验已经取得了有希望的结果,从而进展到第三期临床试验.该文重点讨论目前正在临床试验中用于治疗各类癌症的溶瘤病毒,并讨论这些溶瘤病毒作为一类新的癌症治疗药物的机遇和挑战.

目的 比较树鼩粪便中病毒的三种浓缩方法,评价各方法的浓缩效果,为病毒浓缩方法的最佳选择提供依据.方法 将指示病毒(树鼩呼肠孤病毒,tree shrew's reovirus,TRV)加入经离心过滤处理后的野生树鼩粪便上清中,采用PEG(聚乙二醇,polyehhylene glycol)沉淀结合超声分离法、铁离子絮凝的化学方法和GBviroFast病毒浓缩试剂盒对树鼩粪便上清分别进行浓缩,经实时荧光定量PCR技术对指示病毒进行绝对定量,比较各方法的浓缩效果.结果 TRV病毒悬液的载量为1.34E+ 05;铁离子絮凝的化学方法浓缩的TRV载量为1.86E+ 04,浓缩效率为49.57％;GBviroFast病毒浓缩试剂盒浓缩的TRV载量为0.98E+ 04,浓缩效率为26.12％;PEG沉淀结合超声分离法浓缩的TRV载量为2.30E+ 03,浓缩效率为6.13％.结论 三种方法均能浓缩粪便上清中低浓度的肠道病毒,铁离子絮凝方法最佳,GBviroFast病毒浓缩试剂盒其次,PEG结合超声分离效果最差.