目的 探究雪松醇对体外培养胎鼠真皮成纤维细胞二氢睾酮(DHT)诱导雄激素受体(AR)活化的抑制作用.方法 分离第18.5天(E18.5)C57BU6J胎鼠真皮,建立原代胎鼠真皮成纤维细胞培养;用倒置显微镜观察胎鼠成纤维细胞凝集生长;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒和荧光染色技术检测胎鼠成纤维细胞的ALP活性和CD133表达.将指数生长期胎鼠真皮成纤维细胞分为4组,即空白对照组、DHT组、雪松醇组和雪松醇+DHT联合处理组.不同浓度(0～300 mol/L)雪松醇和DHT处理细胞48 h后,用细胞计算试剂盒(CCK8)测定细胞存活率;用免疫荧光法、蛋白质印迹法(Western blotting)和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测各组AR及其共激活因子四个半LIM结构域2(FHL2)的表达水平和AR核定位;用ALP染色法检测各组细胞ALP活性变化.结果 30 μmol/L DHT处理胎鼠真皮成纤维细胞,48 h后观察到AR主要分布在细胞核,胞核/胞质荧光强度比值为(3.39±0.04)/高倍镜视野(HPF).然而,雪松醇+DHT联合处理组胎鼠真皮成纤维细胞AR着色分布在胞浆和胞核,胞核/胞浆荧光强度比值为(1.24±0.02)/HPF,二者比较差异有统计学意义(P＜0.05),提示雪松醇可抑制DHT诱导的AR核转位;此外,笔者还观察到,DHT可以下调ALP表达并上调AR共激活因子FHL2的表达,而雪松醇可以逆转DHT对成纤维细胞的作用.结论 雪松醇除阻止DHT诱导AR核转位以外,还能抑制共激活因子FHL2的表达,双靶点下调DHT-AR信号活性.外用雪松醇治疗雄激素源性脱发(AGA)值得进一步研究.

目的 探讨四个半LIM结构域蛋白 2(FHL2)对高糖引起内皮细胞功能障碍的影响及其作用机制.方法 采用MTT检测含不同浓度葡萄糖培养基培养下的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞活力.将HUVECs分为对照组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、siNC组(30 mmol/L葡萄糖+siNC)和siFHL2 组(30 mmol/L葡萄糖+siFHL2).利用Western blot检测对照组和高糖组的HUVECs中FHL2 蛋白表达水平.采用实时定量PCR法检测转染siFHL2 后FHL2 的表达水平.运用Annexin V-FITC/PI双染检测各组细胞凋亡情况.利用Western blot检测凋亡相关蛋白FHL2、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2 相关X蛋白(Bax)、cleaved caspase 3表达水平.采用成管实验检测各组HUVECs的成管能力.利用Western blot检测各组SK-1/1-磷酸鞘氨醇(SK-1/S1P)通路中的蛋白表达水平,酶联免疫吸附(ELISA)检测S1P表达水平变化.结果 与对照组相比,高糖组HUVECs内FHL2 表达上调(t=4.407,P<0.05).与对照组相比,高糖组HUVECs凋亡水平升高,Bax和cleaved caspase 3的表达也较对照组显著上调,而下调FHL2表达后,细胞凋亡减少,凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase 3的表达下调(P<0.05).此外,FHL2表达下调改善了HUVECs的成管能力.分子机制分析显示,与对照组比较,高糖组p-SK-1表达显著下调(P<0.05),而下调FHL2后p-SK-1水平显著上调(P<0.05),S1P水平也显著上调(P<0.05).结论 FHL2 可改善高糖引起的内皮细胞功能障碍,其作用机制可能与SK-1/S1P信号通路有关.

目的 通过SGC-823胃癌细胞上皮细胞间质转化(EMT)模型,研究四个半结构域蛋白2(FHL2)的改变和相关分子生物学特性的改变.方法 (1)体外培养人胃癌细胞株SCCT-823细胞(对照组),采用奥沙利铂持续刺激法诱导SGC-823细胞成为耐奥沙利铂胃癌细胞,制作EMT模型(实验组);(2)采用倒置相差显微镜观察实验组和对照组形态学差异;(3)采用Transwell侵袭实验检测两组细胞侵袭能力;(4)采用Westernblot实验检测两组细胞波形蛋白、E-钙黏蛋白和FHL2蛋白表达.结果 (1)与对照组相比,实验组表型由上皮样细胞向间质样细胞表型转变;(2)对照组穿过膜的细胞数为65.7±11.65,实验组穿过膜的细胞数为123.4±28.13,实验组细胞的侵袭能力增强,差异具有统计学意义(t=12.434,P＜0.01);(3)与对照组相比,实验组胃癌细胞E-钙黏蛋白表达水平下调(1.47±0.13vs0.76±0.1),波形蛋白(0.65±0.21vs1.01±0.25)和FHL2蛋白(0.34±0.09vs0.71±0.11)表达水平上调(P均＜0.05).结论 经奥沙利铂刺激后,SGC-823胃癌细胞发生EMT,细胞表型由上皮样细胞向间质细胞表型变化,且将具有更强的侵袭能力,E-钙黏蛋白表达水平下调,波形蛋白和FHL2蛋白表达水平上调.

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人肝癌细胞HepG2中的四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)基因,构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株.方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别FHL1基因第三外显子相关序列的上下游小向导RNA,构建真核重组表达质粒,测序鉴定后,将重组质粒包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素抗性筛选稳定敲除FHL1基因的细胞株,用免疫印迹法鉴定HepG2细胞中FHL1基因的敲除效果,利用生长曲线实验和划痕实验检测基因敲除对细胞生长和迁移的影响.结果:筛选出敲除FHL1基因的HepG2细胞株,且FHL1基因敲除显著促进细胞的增殖和迁移.结论:利用CRISPR/Cas9技术获得了内源FHL1基因敲除细胞株,初步实验提示敲除FHL1基因可以促进肝癌细胞增殖和迁移,为后续研究FHL1在肝癌中的功能奠定了基础.

FHL2是一种参与信号转导和基因转录的支架蛋白,具有FHL蛋白典型的结构特征.FHL2含有四个半LIM结构域,不同的LIM结构域可以与不同的蛋白质结合,从而激活或者抑制转录因子如P53、血清应答因子等的活性,进而影响肿瘤的发生发展.既往研究发现,FHL2在肿瘤发生发展中具有复杂的生物学作用,在不同类型肿瘤中发挥促癌或抑癌的作用.本文就FHL2在消化系统恶性肿瘤中的研究进展作一概述.

目的 探讨四个半LIM结构域蛋白2(FHL2)FHL2与前B细胞白血病同源盒基因3(PBX3)在宫颈癌组织中的表达与临床特征及预后的相关性.方法 选取该院2013年12月至2015年12月收治的55例宫颈癌患者作为研究对象,回顾性分析患者的临床资料,将收集到的患者标本分组,55例癌组织标本作分为研究组.将55例癌旁组织标本(距肿瘤边缘4 cm处)作为对照组.并采用免疫组化法检测所有患者的FHL2与PBX3蛋白的表达,分析FHL2与PBX3蛋白表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系,并采用Cox比例风险分析影响宫颈癌患者预后的相关因素.结果 研究组FHL2、PBX3蛋白阳性表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001);FHL2、PBX3蛋白表达与宫颈癌患者的年龄、病理类型等临床特征不相关(P>0.05),但与宫颈癌患者的肿瘤分化程度、淋巴结转移、浸润深度以及病理分级相关(P<0.05),当肿瘤分化程度越低、有淋巴转移、浸润深度越深以及病理程度越高时,FHL2、PBX3蛋白阳性表达率越高(P<0.05);宫颈癌患者平均中位生存期20个月,其中FHL2阳性表达和阴性表达患者的中位生存期分别为18、30个月,PBX3阳性表达和阴性表达患者的中位生存期分别为17、32个月中位生存期;经单因素分析得出:肿瘤低分化、淋巴结转移、浸润深度>1/2、病理分级G3、FHL2、PBX3阳性表达的患者生存时间均显著缩短,差异有统计学意义(P<0.05);经多因素Cox比例风险回归模型分析得出:肿瘤低分化、淋巴结转移、浸润深度>1/2、病理分级G3、FHL2、PBX3阳性表达均为影响宫颈癌患者预后的独立影响因素(P<0.05).结论 FHL2与PBX3蛋白在宫颈癌组织中的表达水平升高,且表达水平与宫颈癌患者的临床特征显著相关,对于宫颈癌的发生、发展以及预后均有着重要的临床意义.

目的 探讨G蛋白信号调节因子2(RGS2)对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭的影响及调控机制.方法 基于TCGA数据库,评估RGS2在头颈鳞状细胞癌及配对癌旁组织中表达情况,并分析其临床病理相关性;口腔鳞状细胞癌细胞系(SCC-9、Cal-27、Fadu)分别稳定过表达RGS2和空载对照基因,通过Transwell侵袭实验、平板克隆实验、细胞计数试剂盒(CCK)-8生长曲线实验,比较过RGS2表达组、对照组细胞的侵袭、增殖能力;通过酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术检测RGS2与四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)、DNA损伤结合蛋白(DDB1)的相关性.结果 RGS2在头颈鳞状细胞癌组织中表达显著低于癌旁组织(P=0.023),且高表达患者肿瘤淋巴血管侵犯显著减少(P<0.001);过表达RGS2能显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭能力;抑癌基因FHL1可竞争性与RGS2结合,降低泛素化相关蛋白DDB1与RGS2的结合,抑制RGS2的泛素化过程,从而维持RGS2稳定.结论 RGS2可抑制口腔鳞状细胞癌细胞的侵袭、增殖能力,RGS2蛋白在细胞中稳定的受FHL1和DDB1竞争性调控.

目的:探讨干扰四个半LIM结构域蛋白2(FHL2)的表达对胶质母细胞瘤U87细胞中O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)表达的影响,以及对U87细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响.方法:利用慢病毒感染技术分别将携带不同FHL2干扰序列的慢病毒(shFHL2-1#、shFHL2-4#)及其阴性对照(shN)感染U87细胞,分别命名为shFHL2-1#、shFHL2-4#和shN组;采用siRNA转染技术将siMGMT-1#、siMGMT-4#和siN转染至U87细胞,为siMGMT-1#、siMGMT-4#和siN组,qPCR和WB法验证FHL2或MGMT的敲低效果.用TMZ处理上述各组细胞(以DMSO处理组为对照),随后以CCK-8法和细胞克隆形成实验检测TMZ处理前后FHL2或MGMT敲低组细胞的增殖情况,FCM检测TMZ处理前后FHL2敲低组细胞的凋亡情况,WB法和免疫荧光法检测敲低FHL2对U87细胞中MGMT表达的影响,WB法检测TMZ处理对各组细胞中FHL2和MGMT表达水平的影响.结果:成功构建敲低FHL2或MGMT表达的U87细胞.与shN组相比,shFHL2-1#、shFHL2-4#组U87细胞的增殖能力减弱、凋亡水平升高(均P<0.01),MGMT表达水平明显降低(均P<0.01).经TMZ处理后,与相应的DMSO处理组相比,shN组细胞中FHL2和MGMT的表达水平显著升高(均P<0.05),而细胞的增殖和凋亡均无显著变化(均P>0.05);shFHL2-1#、shFHL2-4#组细胞中FHL2和MGMT的表达水平无显著改变(均P>0.05),但细胞增殖能力进一步显著降低、凋亡水平进一步显著升高(均P<0.01).敲低MGMT使U87细胞增殖减慢(P<0.01),而siMGMT-1#、siMGMT-4#组细胞经TMZ处理后增殖能力进一步降低(均P<0.01).结论:干扰FHL2表达使得U87细胞增殖减慢而凋亡加剧、MGMT表达下调,提示FHL2可能通过影响MGMT的表达调控U87细胞对TMZ的耐药性.

四个半LIM结构域基因1(FHL1)蛋白含有四个半LIM结构域,LIM结构域通过调节蛋白相互作用来参与肌动蛋白细胞骨架重构和转录等过程.FHL1在大多数前列腺癌和膀胱癌组织中低表达,与前列腺癌的发生、转移和耐药相关,与膀胱癌的迁移和侵袭相关,参与肿瘤进展.在肾细胞癌中,不同病理类型的肾细胞癌组织中FHL1表达水平不同,不同肾乳头状细胞癌亚型的FHL1表达水平不同.希佩尔-林道综合征患者肾透明细胞癌病灶的FHL1表达水平与病灶大小相关,FHL1及其剪接变体可能通过抑制Notch信号通路参与低Fuhrman分级(≤2级)肾乳头状细胞癌的产生.本文对FHL1在泌尿系肿瘤中的研究进展作一综述.