目的:对临床分离的致关节感染的两株皮疽诺卡菌（ Nocardia farcinica）进行全基因组测序并分析其耐药性。 方法:2020年1月收集两株导致老年患者膝关节感染的皮疽诺卡菌菌株，采用全基因组测序对细菌进行鉴定，根据CLSI M24推荐的微量肉汤稀释法和E-test法进行药物敏感性分析，通过ABRicate工具比对获得性耐药和毒力基因，Snippy等生物信息学工具进行同源性等基因特征分析。结果:本研究的临床分离株均为皮疽诺卡菌，对头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑（TMP/SMX）耐药，对亚胺培南、利奈唑胺和含有酶抑制剂类抗生素阿莫西林/克拉维酸敏感。携带A类β内酰胺酶基因 far-1、RNA聚合酶结合蛋白基因 RbpA、多耐药外排泵转录激活因子基因 MtrA和调节转录因子基因 vanR-O，分别介导对β内酰胺抗生素、利福平、大环内酯类药物和万古霉素的耐药性。不含有获得性TMP/SMX耐药基因，二氢叶酸还原酶家族基因存在多个错义突变，均携带与结核分枝杆菌同源的 icl、 mbtH、 phoP、 relA毒力基因，SNP同源分析表明两株皮疽诺卡菌具有很近的亲缘关系，两株菌仅存在10个SNP位点、6个复合基因和1段基因缺失变异。 结论:全基因测序技术有助于研究诺卡菌的分子特征和耐药机制；皮疽诺卡菌对TMP/SMX耐药现象需要重视，参与二氢叶酸代谢途径的酶基因突变有可能是TMP/SMX耐药的原因之一。

细菌对抗菌药物的耐药性已发展成为一场全球性医疗危机，最终出现了无法用任何普通抗菌药物治疗的多药耐药细菌。因此，迫切需要新型抗菌增效剂，使细菌重新恢复对抗菌药物的敏感性。本文旨在对新颖的抗菌增效方法及其背后的机制、临床实验数据及疗效、药物研发管线的进展进行综述，以期提高对抗菌药物增效剂的认识。

目的:检测四种常见外排泵抑制剂对克拉霉素（CLA）抗脓肿分枝杆菌体外最低抑菌浓度的影响，探讨药物外排泵在脓肿分枝杆菌对CLA耐药中所起的作用。方法:本研究自2008年1月至2012年12月，纳入脓肿分枝杆菌标准菌株和60株脓肿分枝杆菌临床分离株。选择四种常见外排泵抑制剂：氰化羰基-3-氯苯腙（CCCP）、二环己基碳二亚胺（DCC）、维拉帕米（VP）和利血平（RSP），采用Alamar Blue法检测CLA对上述菌株的体外最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），比较有无外排泵抑制剂作用时，CLA抗菌的MIC改变情况；对脓肿分枝杆菌的CLA耐药相关基因 erm（ 41）和 rrl基因进行序列分析，分析外排泵抑制剂对MIC的影响与耐药相关基因突变与否及突变类型之间的相关性。 结果:CCCP、DCC、VP和RSP均能降低CLA抗脓肿分枝杆菌的MIC，但RSP作用效果弱于其他三种外排泵抑制剂。60株脓肿分枝杆菌临床分离株中，包含10株CLA耐药菌株，其中7株发生 rrl基因突变。光滑表型分离株的CLA耐药率（21.2%和66.7%）高于粗糙表型分离株的CLA耐药率（11.1%和51.9%）。当CLA药敏孵育时间为3 d时，外排泵抑制剂对CLA耐药菌株的MIC影响较大，均可使约50%菌株的MIC降低2倍以上，且相较于发生 rrl基因突变的菌株，外排泵抑制剂对未发生 rrl基因突变菌株的MIC影响更大；当CLA药敏孵育时间为14 d时，有24株携带 erm（ 41）基因T28序列型的脓肿亚种分枝杆菌发生诱导耐药，随着诱导耐药的发生，外排泵抑制剂对CLAMIC影响减小。外排泵抑制剂对不同表型分离株的CLAMIC水平影响差异无统计学意义。 结论:外排泵参与脓肿分枝杆菌对CLA耐药过程，外排泵抑制剂可不同程度降低脓肿分枝杆菌对CLA的耐药水平。外排泵抑制剂的使用为脓肿分枝杆菌病的临床治疗提供了新的思路和方法。

细菌的抗菌素耐药已成为威胁人类健康的重大问题，亟需新策略阻控细菌耐药。群体感应是微生物细胞间交流的一种机制，当环境中群体密度达到阈值后群体感应即被激活，调控下游基因转录。群体感应已被证实可调控生物膜、外排泵、细菌分泌系统等抗菌素耐药机制，有望成为耐药调控靶点。目前已有多种群体感应抑制剂通过降解信号分子、干扰信号分子与受体蛋白的识别和结合、阻断群体感应信号的合成等方式干扰群体感应。群体感应抑制剂有望成为阻控微生物耐药的新方法。

目的 探讨阿莫西林(AMX)不稳定耐药的幽门螺杆菌(Hp)演化成AMX稳定高水平耐药的表型及其突变基因的检测.方法 以冻存后的Hp菌株H390作为出发菌株,在不断增加AMX浓度的培养基上连续传代,筛选对AMX耐药的克隆,检测耐药克隆的最小抑菌浓度(MIC),置于-80℃冻存3个月后再复苏,根据冻存后MIC下降情况判断其耐药性是否稳定.对获得的AMX最高MIC值的克隆H390r和出发菌株H390进行基因组测序分析和外排泵抑制试验,检测并鉴定与H390r获得的AMX高水平耐药性相关的基因突变.结果 通过AMX筛选获得4个AMX高水平耐药克隆,MIC分别为12、32、64和≥256 mg/L,经-80℃冻存后,MIC均未发生改变.相比于亲本菌株H390,AMX稳定耐药克隆H390r存在多个基因的突变,包括与AMX耐药性相关的编码RND外排系统的 hefC、编码孔蛋白的 hopB与 hopC和编码青霉素结合蛋白的ftsI.H390r在有外排泵抑制剂存在时对AMX 的MIC 大幅降低. 结论 AMX 能够在不稳定耐药的Hp中筛选出稳定耐药的克隆;H390r存在与AMX耐药相关的hefC、hopB、hopC和ftsI基因突变.这些突变可能是H390r获得AMX稳定高水平耐药的主要原因.

目的 研究碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)对新型四环素类药物奥马环素的耐药规律及机制,为CRKP感染的临床用药提供理论参考.方法 收集2019年1月-2021年12月期间阳江市人民医院临床分离的非重复CRKP菌株306株,利用微量肉汤稀释法检测奥马环素对CRKP临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)和检测奥马环素耐药菌株对其他临床常用药物的MIC,通过PCR扩增结合测序方法确定耐药菌株的多位点序列分型(MLST)和碳青霉烯酶型,使用琼脂平板稀释法检测外排泵抑制剂对耐药菌株奥马环素MIC的影响,运用qRT-PCR比较奥马环素敏感与耐药菌株中耐药结节分化细胞(RND)型外排泵基因和调控基因的表达水平差异.结果 CRKP菌株对奥马环素耐药率为9.5％(29/306),29株奥马环素耐药菌株主要来源于痰液(51.7％)、血液(24.1％)和尿液(17.2％).耐药菌株的MLST型主要为ST11[65.5％(19/29)]和ST15[24.1％(7/29)],携带的碳青霉烯酶主要为KPC-2[62.1％(18/29)]和KPC-3[13.8％(4/29)].奥马环素在CRKP中与米诺环素、多西环素及四环素存在交叉耐药现象.加入外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺(PaβN)后,58.6％(17/29)耐药菌株的奥马环素MIC值降低4倍以上.奥马环素耐药菌株中外排泵编码基因acrA和调控基因ramA、rarA的表达水平显著高于奥马环素敏感菌株,差异均有统计学意义(t=1.613、1.257、1.290,P均＜0.05).结论 奥马环素在CRKP中耐药率高于替加环素,其耐药机制的形成可能与外排泵AcrAB和调控蛋白RamA、RarA的高表达有关.

目的 探讨AcrAB-TolC外排泵系统在多重耐药肺炎克雷伯杆菌中的表达情况及对其耐药性的影响.方法 采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统对临床分离菌进行鉴定及药敏分析,收集多重耐药菌株;采用微量肉汤稀释法测定药物最低抑菌浓度(minimal inhibitant concentration,MIC)及其逆转实验对多重耐药肺炎克雷伯杆菌进行外排泵表型检测;利用荧光定量PCR测定外排泵acrB基因的表达情况.结果 30株多重耐药肺炎克雷伯菌在应用外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)后,9株(30.00％)对庆大霉素的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下;3株(10.00％)对阿莫西林/棒酸的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下;14株(46.67％)对头孢吡肟的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下;12株对左氧氟沙星(40.00％)的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下;5株(16.67％)对环丙沙星的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下.23株(76.67％)外排泵表型阳性,荧光定量PCR结果显示28株(93.33％)高表达acrB基因.结论 外排泵AcrAB-TolC的表达增强可能是肺炎克雷伯杆菌多重耐药的重要机制之一.

目的 了解浙江省绍兴地区洋葱伯克霍尔德菌耐药结节化细胞分化家族(RND)型外排泵基因的分布情况.方法 收集分离自绍兴地区三级医院血流感染患者的洋葱伯克霍尔德菌52株,其中32株菌对头孢他啶和左氧氟沙星均耐药,20株对左氧氟沙星敏感.微量肉汤稀释法检测菌株的耐药性;检测经外排泵抑制剂处理前后菌株对头孢他啶和左氧氟沙星最低抑菌浓度(MIC)的变化以判定是否为外排泵阳性菌株;左氧氟沙星耐药株和敏感株各20株以PCR检测外排泵基因llpE、ceoA、ceoB、opcM和调控基因ceoR在2种菌株中的携带情况.结果 32株菌株中有10株对头孢他啶产生外排现象,11株对左氧氟沙星产生外排现象.菌株外排泵基因检测显示,菌株ceoA、ceoB、llpE、opcM的阳性率分别为37.5％(15/40)、50.0％ (20/40)、20.0％ (8/40)、25.0％(10/40),外排泵调控基因ceoR的阳性率为55.0％(22/40).左氧氟沙星耐药菌株ceoA、ceoB、opcM、ceoR基因的阳性率显著高于敏感菌株(x2=5.23、10.02、4.83和25.86,P＜0.05或0.01).结论 RND型外排泵在绍兴地区洋葱伯克霍尔德菌对抗菌药物的耐药中发挥一定的作用,菌株对左氧氟沙星耐药机制可能与外排泵基因ceoA、ceoB、opcM和调控基因ceoR有关,不排除其他耐药机制的存在.

目的 建立秀丽隐杆线虫-泛耐药鲍曼不动杆菌感染模型,用于外排泵抑制剂(EPIs)逆转泛耐药鲍曼不动杆菌(XDR-AB)对于环丙沙星耐药的研究.方法 建立秀丽隐杆线虫-泛耐药鲍曼不动杆菌感染模型,选用6种EPIs(CCCP、PAβN、NMP、奥美拉唑、利血平和维拉帕米)与氟喹诺酮类药物环丙沙星联合使用,记录秀丽隐杆线虫生存率以评价体内药效,同时进行毒性试验及体外药敏试验.结果 不同浓度XDR-AB对秀丽隐杆线虫的致死情况不同,选择5×106CFU/mL作为XDR-AB感染秀丽隐杆线虫浓度.秀丽隐杆线虫生存实验显示,XDR-AB感染线虫3h后线虫组与加入多粘菌素B的对照组生存曲线比较,差异无统计学意义(x2 =3.154,P＞0.05),感染线虫6、9h,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.001),但感染6h与9h组的生存曲线比较,差异无统计学意义(x2=0.669,P＞0.05),最终选择6h作为感染时长,36 h为合适的抗菌药物治疗时长.环丙沙星联合EPIs应用于感染模型实验中,低浓度的PAβN、NMP、奥美拉唑、利血平可将线虫存活率分别提高30％～40％、15％～20％、20％～30％、20％,高浓度的维拉帕米可将感染线虫的存活率提高30％左右.体外药敏试验和毒性试验结果显示,环丙沙星分别与CCCP、奥美拉唑和维拉帕米联合可降低MIC至原来的1/4,分别联合PAβN,NMP和利血平可降低MIC至原来的1/2,其中CCCP体外联合抑菌效果最佳,但毒性较大不适于体内药效研究.结论 首次成功构建了秀丽隐杆线虫-泛耐药鲍曼不动杆菌感染模型,得到6种EPIs逆转环丙沙星耐药性的初步研究.

目的 探讨2014年该院收集的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药机制.方法 采用纸片扩散法或者Vitek 2 Compact 全自动药敏分析系统初筛亚胺培南非敏感菌株,琼脂稀释法确证亚胺培南非敏感肺炎克雷伯菌;通过Carba N P确证试验检测碳青霉烯酶表型;通过PCR扩增及测序检测碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因、质粒携带的AmpC基因在菌株中携带情况;外膜蛋白SDS-PAGE分析菌株外膜蛋白的改变;外排泵抑制剂羰酰氰氯苯腙(CCCP)抑制试验检测不产碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌中是否存在针对碳青霉烯类抗菌药物的外排泵.结果 琼脂稀释法验证30株为碳青霉烯非敏感菌株,其中19株为Carba NP表型试验阳性,其中18株产KPC-2,1株产NDM-1.11株Carba NP表型试验阴性的不产碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌的ESBLs、AmpC酶的携带率为blaCTX-M 72.7%,blaSHV 27.3%,blaTEM 72.7%, blaDHA 27.3%.SDS-PAGE结果显示编号2368、2875、3050的菌株OmpK36缺失,其余菌株未发现外膜蛋白缺失.CCCP存在时,11株不产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的最小抑菌浓度值均明显降低.结论 碳青霉烯酶产生,尤其是产KPC-2是该院CRKP的主要耐药机制,外排泵的高表达,外膜蛋白的缺失合并产AmpC酶也发挥了重要作用.