目的 探讨外源性一氧化碳释放分子-2(CORM-2)减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的Caco-2细胞屏障损伤的作用及机制.方法 用50μg/mL LPS刺激24 h,建立LPS诱导的Caco-2细胞单层损伤模型.将100μmol/L CORM-2置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中18h,其中的CO已全部释放,即为无活性的CORM-2(iCORM-2).实验设正常对照组、LPS损伤组、CORM-2预处理+LPS损伤组(用不同浓度CORM-2(10μmol、50μmol、100μmol)预处理1h,PBS水洗三遍,然后50μg/mL LPS刺激24h处理,再分为LC1(10 μmol/L CORM-2预处理)、LC2 (50μmol/L CORM-2预处理)、LC3(100 μmol/L CORM-2预处理)、LC4 (iCORM-2预处理)4个亚组.采用流式细胞术检测各组Caco-2单层细胞的凋亡率.免疫荧光法检测Caco-2单层细胞及紧密连接蛋白(tight junction proteins,TJ)的分布及结构变化.ELISA法检测各组Caco-2细胞炎症因子(TNF-α、IL-1 β与HMGB-1)的分泌水平.Western blotting法检测各组Caco-2细胞紧密连接蛋白(occludin、ZO-1、claudin-1与claudin-4)的表达变化.结果 LPS损伤后,与对照组相比,LPS损伤组Caco-2单层细胞的凋亡率明显升高(P＜0.05)、细胞炎症因子(TNF-α、IL-1 β与HMGB-1)分泌增加(P＜0.05)、相邻Caco-2细胞间TJ结构遭受破坏,TJ相关蛋白(occludin、ZO-1、claudin-1与claudin-4)的表达量降低(P＜0.05);经过CORM-2预处理后,Caco-2单层细胞的凋亡率显著降低(P＜0.05)、TNF-α、IL-1 β和HMGB-1的分泌明显减少(P＜0.05),LPS诱导引起的TJ结构损害减轻,TJ蛋白的表达量升高(P＜0.05),且与CORM-2的预处理浓度呈正相关.结论 CORM-2呈浓度依赖性减轻LPS诱导的Caco-2细胞屏障结构损伤.其作用机制可能是通过抑制炎症细胞因子TNF-α、IL-1β与HMGB-1的产生和释放、降低Caco-2单层细胞的凋亡率、改善Caco-2细胞间TJ结构的变化和相关蛋白的表达与分布而实现.

目的 探讨血红素氧合酶-1/一氧化碳(HO-1/CO)通路对脂多糖(LPS)诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)线粒体融合的影响.方法 体外培养大鼠AECⅡ细胞株RLE-6TN,待细胞融合度达到85%时传代培养,并随机分为7组(n=5):空白对照组细胞常规培养;LPS组加入10 mg/L的LPS制备内毒素攻击AECⅡ模型;外源性一氧化碳释放分子-2(CORM-2,体外CO释放剂)+LPS组(CL组)和氯高铁血红素(Hemin,HO-1诱导剂)+LPS组(HL组)分别加入100 μmol/L的CORM-2或20 μmol/L的Hemin预处理1 h,再加入10 mg/L LPS孵育;锌原卟啉-Ⅸ(ZnPP-Ⅸ,HO-1活性抑制剂)+ LPS组(ZL组)加入10 μmol/L的ZnPP-Ⅸ预处理0.5 h,然后加入10 mg/L的LPS孵育;CORM-2+ZnPP-Ⅸ+LPS组(CZL组)和Hemin+ZnPP-Ⅸ+LPS组(HZL组)先分别加入100 μmol/L的CORM-2或20 μmol/L的Hemin预处理1 h,其余处理同ZL组.LPS孵育24 h后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量;用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)测定HO-1、线粒体融合蛋白1和蛋白2(Mfn1、Mfn2)以及视神经萎缩蛋白1(OPA1)的蛋白表达.结果 与空白对照组比较,各处理组细胞上清液中IL-6和TNF-α含量升高,HO-1蛋白表达上调,线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2 和OPA1蛋白表达下调.与LPS组比较,给予CORM-2或Hemin预处理后,IL-6、TNF-α含量均明显降低〔IL-6(ng/L): 48.6±3.7、48.4±3.1比58.7±2.5, TNF-α(ng/L): 40.7±5.3、39.4±4.3比51.8±5.1〕,HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1蛋白表达均明显上调(HO-1蛋白:0.873±0.051、0.839±0.061比0.671±0.044,Mfn1蛋白:0.673±0.037、0.654±0.025比0.568±0.021,Mfn2蛋白:0.676±0.044、0.683±0.035比0.571±0.043,OPA1蛋白:0.648±0.031、0.632±0.031比0.554±0.032,均P<0.05);而给予ZnPP-Ⅸ预处理后,IL-6、TNF-α含量及HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1蛋白表达的变化趋势与CORM-2或Hemin预处理组相反,与LPS组比较差异均有统计学意义〔IL-6(ng/L):69.8±5.1比58.7±2.5, TNF-α(ng/L): 61.9±3.3比51.8±5.1,HO-1蛋白:0.545±0.023比0.671±0.044,Mfn1蛋白:0.406±0.051比0.568±0.021,Mfn2蛋白: 0.393±0.051比0.571±0.043,OPA1蛋白:0.372±0.050比0.554±0.032,均P<0.05〕.CL组与HL组间,LPS组、CZL组与HZL组间上述各指标比较差异均无统计学意义.结论 HO-1/CO通路可上调LPS诱导的大鼠AECⅡ细胞线粒体融合蛋白表达,促进线粒体融合,从而减轻细胞炎症反应.

目的 探讨外源性一氧化碳释放分子(Corm)Ⅱ对脓毒症时血小板α颗粒(PLT-α)释放的影响及作用机制.方法采集健康供血者空腹外周静脉血并分离血小板,通过脂多糖体外诱导建立脓毒症血小板异常活化模型.分为空白对照组、脂多糖组、无活性CormⅡ组、10 μmol/L和30 μmol/L CormⅡ组,另再设PKCδ抑制剂(LY317615)组(10 μmol/L脂多糖+100 nmol/L LY317615)、CormⅡ+LY317615组(10 μmol/L脂多糖+30 μmol/L CormⅡ+ 100 nmol/L LY317615).采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血小板衍生因子(PDGF)-bb、基质金属蛋白酶(MMP)-2含量,流式细胞术检测血小板P选择素表达;免疫荧光法检测PLT-α分布;Western印迹法检测血小板关键信号分子PKCδ、MUNC18a的表达.结果 脂多糖诱导后PLT-α释放的PDGF-bb、MMP-2及血小板P选择素表达水平均明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);无活性CormⅡ组PLT-α内容物释放及血小板P选择素表达水平与脂多糖组之间差异无统计学意义(P>0.05);CormⅡ诱导后,PLT-α释放的PDGF-bb、MMP-2明显减少,血小板P选择素表达水平明显降低且呈剂量依赖性.脂多糖诱导后中央区的PLT-α逐渐向血小板磷脂膜区转移,与磷脂膜融合后释放到血小板外;无活性CormⅡ组与脂多糖组PLT-α分布情况相似;CormⅡ诱导后血小板α颗向血小板膜汇聚明显减少.脂多糖诱导后血小板p-PKCδ、p-MUNC18a的相对表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);LY317615组、CormⅡ组、CormⅡ+LY317615组板p-PKCδ、p-MUNC18a的相对表达量与脂多糖组和无活性CormⅡ组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 CormⅡ可通过释放的CO活化PKCδ/MUNC18a信号通路,抑制脓毒症时PLT-α的异常释放,减弱脓毒症损伤.

目的:探讨一氧化碳释放分子2(CORM-2)在小鼠缺血再灌注损伤中发挥保护作用及其作用机制.方法:建立小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,给予CORM-2、重组高迁移率族蛋白1(rHMGB1)对小鼠肾脏缺血进行干预治疗,检测肾脏缺血再灌注后24 h血肌酐、血尿素氮,评价肾脏功能情况.并对小鼠血浆中高迁移率族蛋白1(H MGB1)水平进行检测分析.结果:小鼠肾脏经历热缺血再灌注后出现明显肾功能损害(IRI组vs sham组,P＜0.05),然而,给予CORM-2治疗能显著降低血浆肌酐和尿素氮升高水平,肾功能得到显著保护(CORM-2组vs IRI组、iCORM-2组,P＜0.05).并且,在肾脏缺血再灌注过程中,CORM-2可以明显减少血浆HMGB1水平,显著抑制了HMGB1的核浆迁移释放,减轻缺血再灌注损伤,发挥保护肾脏功能作用.然而,输注外源性rHMGB1能显著逆转了CORM-2的保护作用(rHMGB1组vs CORM-2组,P＜0.05).结论:在缺血再灌注损伤过程中,CORM-2通过抑制HMGB1核浆迁移释放下调炎症反应,从而减轻缺血再灌注损伤发挥保护效应.

目的 探讨外源性一氧化碳释放分子2对脓毒症大鼠T淋巴细胞的影响.方法 采用腹腔注射LPS方法制备脓毒症模型.采用数字表法将28只雄性SD大鼠随机分为阴性对照组(n=7)、LPS组(n=7)、外源性一氧化碳释放分子2(CORM-2)(10mg/L LPS+ 10μmol/L CORM-2干预)、无活性外源性一氧化碳释放分子2(iCORM-2)组(10mg/L LPS+10μmol/LiCORM-2干预).给予相应试剂预处理24h后处死大鼠,收集血液、脾脏、肠系膜淋巴结等标本,进行模型验证,应用流式细胞仪观察和计数CD4与CD8标记阳性T细胞数,计算CD4/CD8阳性细胞比值(CD4+/CD8+),苏木精-伊红(HE)染色观察脾脏组织病理变化,观察T淋巴细胞含量计数,用Western blot法检测Fas、caspase-9、caspase-3的蛋白表达.结果 观察大鼠小肠光镜下形态,与阴性对照组比较,大鼠脓毒症模型造模成功.流式细胞仪观察,与阴性对照组比较,LPS组24h后CD4+T细胞百分比显著降低(41.05％±5.26％ vs 53.06％±6.28％),CD8+T细胞百分比显著降低(33.98％±7.47％ vs 40.33％±7.23％),CD4+/CD8+比值显著降低(1.21±0.70 vs 1.31±0.87),差异有统计学意义(P＜0.05).与LPS组比较,LPS+ CORM-2组24h后CD4+T细胞百分比显著增加(50.02±5.58 vs 41.05±5.26),CD8+T细胞百分比显著增加(38.12±7.41 vs 33.98±7.47),CD4+/CD8+比值显著增加(1.31±0.75 vs 1.21±0.70),差异有统计学意义(P＜0.05).LPS+ iCORM-2组与LPS组上述各指标比较,差异无统计学意义.取脾脏病理学观察,与阴性对照组比较,LPS组T淋巴细胞含量计数在光镜下观察明显减少,与LPS组比较,LPS+ CORM-2组T淋巴细胞含量计数在光镜下观察明显增加.用Western blot法检测Fas、caspase-9、caspase-3的蛋白表达,与阴性对照组比较,LPS组处理24h后,Fas、caspase-9、caspase-3蛋白表达明显上调(P＜0.05),在同时间点,与LPS组比较,经过LPS+ CORM-2处理24h后,Fas、caspase-9、caspase-3蛋白表达显著降低(P＜0.05),LPS+ iCORM-2组与LPS组上述各指标比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 外源性一氧化碳释放分子2能够在脓毒症模型中通过抑制凋亡蛋白的表达减少T淋巴细胞凋亡.

一氧化碳(Carbon monoxide,CO)是一种生物信号调控分子,具有多种重要的生物学功能,并参与生物体内细胞间信息的传递与调节[1 ].CO是一把双刃剑,直接应用CO气体会产生很大的弊端,极大限制了CO气体作为一种药物应用于临床.一氧化碳释放分子(carbon monoxide releasing molecules, CORMs)作为一种新型且特殊的外源性CO供体逐渐被人们所认识,并被广泛应用于各种动物疾病模型[2].CORMs具有CO气体无法比拟的优势[3 ]:可不经机体代谢直接作用于靶组织或器官,能够稳定且持续释放CO而发挥生物学功效;在生理剂量范围内不提高机体血清COHb水平,不会导致机体CO中毒;作为筛选药物,其给药剂量及方式具有良好的可控性.CORMs逐渐成为近年来研究的热点,其在肝脏疾病领域的治疗亦表现出了良好的药理学作用,本文对国内外的相关研究进行总结.

目的 探讨外源性一氧化碳(CO)通过抑制星形胶质细胞过度自噬改善老龄大鼠围术期应激后焦虑样行为的作用.方法 清洁级健康雄性SD大鼠36只,分为3组(n=12):假手术组(S组)、腹腔探查组(P组)、腹腔探查+一氧化碳释放分子-3(carbon monoxide-releasing molecule 3,CORM-3)组(PC组).PC组大鼠在手术结束后即刻、24、48h经尾缘静脉注射外源性CORM-3(4mg/kg).术后第7天采用行为学评估大鼠焦虑样行为;采用免疫荧光法评估杏仁核区神经元数量及星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元内自噬相关蛋白B细胞淋巴瘤-2相互作用蛋白1(Bcl-2 interacting protein 1,Beclin1)和泛素(ubiquitin,Ub)的表达情况,采用Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达;采用透射电镜法检测杏仁核区自噬小体的数量.结果 旷场试验结果显示,与S组比较,P组和PC组大鼠中央区停留时间百分比明显下降,焦虑样行为增加(P＜0.05);高架十字迷宫试验表明,与S组比较,P组和PC组大鼠开放臂停留时间百分比及开放臂进入次数百分比显著下降,焦虑样行为增加(P＜0.05);组织病理学结果显示,与S组比较,P组和PC组大鼠杏仁核区NeuN阳性细胞数降低(P＜0.05),星形胶质细胞内Beclin1、Ub表达上调(P＜0.05);Western blot检测结果显示,与S组比较,P组和PC组大鼠LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值上调(P＜0.05);透射电镜下观察,S组大鼠星形胶质细胞内未见自噬小体,P组和PC组大鼠星形胶质细胞内可见自噬小体;与P组比较,PC组大鼠上述各项指标均明显改善(P＜0.05).结论 外源性CO能够改善老龄大鼠围术期应激后的焦虑样行为,其机制可能与抑制杏仁核区星形胶质细胞过度自噬相关.

目的 探讨一氧化碳释放分子2(CORM-2)对PC12细胞谷氨酸信号通路的影响及作用机理,揭示急性一氧化碳中毒迟发性脑病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)发生的可能机制,为 CO的中毒及其后遗症的防治提供实验依据.方法 以高分化的PC12细胞为研究对象,经不同浓度的CORM-2暴露后,用MTS法检测细胞活力,确定合适的染毒浓度及染毒时间,收集细胞后用蛋白免疫印迹法检测N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体主亚基(NR1)及NMDA受体2B亚基(NR2B)蛋白的表达,检测细胞内钙离子浓度及细胞释放的谷氨酸含量,用流式细胞术检测细胞的凋亡情况.结果 随着CORM-2浓度的增加,PC12细胞的活力呈剂量依赖性降低(P＜0.05);各剂量与对照组相比,NMDA受体的NR1亚基的表达未发生显著的变化(P＞0.05),250μmol/L和300 μmol/L剂量组NR2B蛋白的相对表达水平以及Ca2+浓度、谷氨酸水平均高于对照组和200 μmol/L剂量组(P＜0.05);随着CORM-2浓度的增加,PC12细胞的凋亡率也呈剂量依赖性增加(P＜0.05).结论 随着COMR-2浓度的增加,PC12细胞的活力呈剂量依赖性降低.CORM-2可使PC12细胞谷氨酸信号通路激活.CORM-2可能通过激活谷氨酸信号通路引起Ca2+内流,进而导致细胞凋亡.这些结果对认识CO中毒机制具有重要意义.

目的 通过观察芹菜素在一氧化碳(carbon monoxide,CO)中毒后对神经元凋亡的影响,探讨其干预作用与机制.方法 制作CO中毒的神经元模型,即用外源性一氧化碳释放分子2(carbon monoxide releasing molecules2,CORM-2)作用于PC12细胞,筛选出CORM-2作用的最佳时间和最佳浓度,通过流式细胞术观察对照组、CORM-2组、低浓度芹菜素干预组(5μM)和高浓度芹菜素干预组(20μM)的PC12细胞凋亡率,Western blot检测各组凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、BCL2-Associated X(BCL2-Associated X,Bax)和B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达.结果 给予芹菜素干预后PC12细胞凋亡率较CORM-2组下降(P<0.05).其中加入高、低浓度芹菜素后促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达明显低于CORM-2组(P<0.05),而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达明显高于CORM-2组(P<0.05).结论 芹菜素可以有效缓解CO中毒导致的PC12细胞的凋亡,具体机制与凋亡蛋白相互作用有关.