目的:通过观察高浓度丁酸钠(sodium butyrate，NaB)(5 mmol/L，8 mmol/L)对单层Caco-2细胞肠屏障模型的作用，及该过程中对NF-κB通路的影响，旨在探讨高浓度NaB破坏单层Caco-2细胞肠屏障模型的可能分子机制。方法:使用不同浓度的NaB及雷公藤甲素(triptolide，TP)(特异性抑制NF-κB)50 nmol/L作用体外培养的Caco-2细胞及单层Caco-2细胞肠屏障模型，按照作用的试剂和浓度分为0 mmol/L NaB(对照组)、50 nmol/L TP组(TP组)、2 mmol/L NaB组(NaB Ⅰ组)、5 mmol/L NaB(NaB Ⅱ组)、8 mmol/L NaB(NaB Ⅲ组)、5 mmol/L NaB＋50 nmol/L TP组(NaB＋TP组)。测定单层Caco-2细胞肠屏障模型的跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance，TER)及菊粉-FITC(inulin-FITC)的通透性；用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组IL-1β和TNF-α的mRNA及蛋白水平；用核质分离试验检测p65蛋白入核水平的变化。结果:①高浓度NaB(5 mmol/L、8 mmol/L)作用于单层Caco-2细胞肠模型72 h后，与对照组相比，TER显著下降，inulin-FITC通透性显著升高；如5 mmol/L NaB作用于单层Caco-2细胞肠屏障72 h，TER降低至(106.33±4.04)(Ω×cm 2)，inulin-FITC的通透性升高至(12.52±1.82)%，与对照组相比，差异均具有统计学意义( P<0.05)；而使用50 nmol/L TP特异性抑制NF-κB后，其TER升高至(398.33±3.06)(Ω×cm 2)，inulin-FITC的通透性降低至(7.24±0.25)%，差异具有统计学意义( P<0.05)，提示5 mmol/L NaB对肠屏障的破坏作用被显著抑制；②高浓度NaB(5 mmol/L、8 mmol/L)作用Caco-2细胞72 h，IL-1β和TNF-α mRNA及蛋白的表达水平较对照组显著提高，且p65蛋白入核水平也显著提高，差异具有统计学意义( P<0.05)；③在5 mmol/L NaB的基础上，使用TP抑制NF-κB后，可显著抑制高浓度NaB诱导IκB-α的磷酸化及p65蛋白入核，并显著降低IL-1β与TNF-α的表达水平。 结论:高浓度NaB可破坏肠屏障功能，其机制可能与活化NF-κB通路，促进炎症因子释放相关。

目的:探讨人乳提取物双唾液酸乳糖-N-四糖（disialyllacto-N-tetraose，DSLNT）对坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）肠道屏障的保护作用机制。方法:（1）取2013年2月至2020年12月南通大学附属常州儿童医院病理科保存的新生儿回肠病理组织石蜡块（NEC 12例，肠闭锁9例）切片后行免疫组化染色，比较其肠道紧密连接蛋白——闭锁小带蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）表达情况。（2）取1日龄SD大鼠28只随机分为对照组（8只）、NEC组（10只）和DSLNT+NEC组（10只），NEC组和DSLNT+NEC组以3次/d的频率、连续3 d进行缺氧（95%N 2，10 min）/冷刺激（4 ℃，10 min）诱导新生大鼠NEC模型，DSLNT+NEC组在造模同时于配方奶中添加DSLNT（300 μmol/L）。72 h后处死所有大鼠，取末端回肠组织处理，比较不同组肠组织损伤及ZO-1表达情况。（3）用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）构建人肠上皮细胞株Caco-2炎性细胞模型并给予DSLNT，分为对照组、LPS组、DSLNT+LPS组，以噻唑蓝法检测细胞活力并以免疫荧光法检测ZO-1表达，验证DSLNT对Caco-2细胞生长和紧密连接的影响。 结果:（1）患儿结果：NEC组病变肠段黏膜层绒毛完整度缺失，肠上皮细胞连接处ZO-1表达明显少于肠闭锁组和NEC组非病变肠段。（2）动物实验结果：NEC组大鼠肠组织病变部位肠上皮层松脱甚至坏死和脱失，ZO-1表达低于对照组和DSLNT+NEC组（ P<0.05）。DSLNT+NEC组大鼠存活率高于NEC组（8/10比6/10），回肠炎症损伤病理评分低于NEC组［2.0（1.0，2.8）比3.5（3.0，4.0）］（ P<0.05）。（3）细胞实验结果：LPS组肠上皮Caco-2细胞出现细胞生长限制和ZO-1免疫荧光暗淡；DSLNT+LPS组Caco-2细胞生长优于LPS组，与对照组相当，同时ZO-1表达强度显著增加。 结论:肠上皮紧密连接损伤是NEC的重要特征之一，ZO-1是NEC药学防治的潜在靶标分子；人乳寡糖单体DSLNT通过调节肠上皮ZO-1表达和紧密连接完整性发挥对新生肠道的保护作用，是天然的肠道屏障调节物质。

目的:探讨高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的Caco-2细胞肠上皮屏障损伤中的作用及机制。方法:用Transwell小室培养Caco-2细胞，检测跨上皮电阻值（TEER值），当TEER值达到500 Ω·cm 2时，单层上皮屏障模型建立成功，将其分为对照组，LPS组，LPS+丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）组，LPS和EP的处理浓度分别为100 μg/mL、50 μg/mL，分别于处理后12、24、48、72 h用电阻仪测量各组TEER值；24 h时用酶标仪检测FITC-右旋糖酐通透率。将细胞接种于6孔板，融合达到80%时给予以上分组及处理，24 h后用蛋白印迹法（Western Blot）检测各组细胞Occludin蛋白、HMGB1、核转录因子（NF-κB）蛋白表达水平；实时聚合酶链式反应技术检测各组细胞Occludin、HMGB1、NF-κB mRNA表达情况。应用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 t检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。 结果:与对照组相比，LPS组12、24、48、72 h TEER值（Ω·cm 2）明显减少[(514.22±12.59) vs (304.96±9.69), (521.65±13.35) vs (276.21±7.82), (523.99±8.18) vs (206.64±15.85), (491.21±6.72) vs (156.33±10.83),均 P<0.05]，24 h时FITC-右旋糖酐通透率明显增加[(2.58±0.07) vs (1.04±0.06)， P<0.05]，Occludin蛋白及mRNA表达减少(均 P<0.05)，HMGB1、NF-κB蛋白及mRNA表达明显增加(均 P<0.05)；与LPS组比较，LPS+ EP组12、24、48、72 h TEER值（Ω·cm 2）增加[(519.00±5.66) vs (304.96±9.69), (504.69±8.57) vs (276.21±7.82), (453.65±10.74) vs (206.64±15.85), (385.28±7.57) vs (156.33±10.83),均 P<0.05]，24 h时FITC-右旋糖酐通透率明显减少[(1.23±0.11) vs (2.58±0.07), P<0.05]，Occludin蛋白及mRNA表达明显增加(均 P<0.05)，HMGB1、NF-κB蛋白及mRNA表达减少(均 P<0.05)。 结论:LPS引起肠上皮通透性升高，减少细胞间紧密连接蛋白的表达，其机制可能与HMGB1及下游NF-κB蛋白表达增加有关。

目的 制备利格列汀(LGP)壳聚糖-磷脂自组装纳米粒(LGP-CS/LC-NPs),并考察其在大鼠体内的药动学以及对糖尿病模型大鼠的血糖控制效果.方法 采用溶剂滴入法制备LGP-CS/LC-NPs,通过单因素实验筛选LGP-CS/LC-NPs处方中LGP与磷脂(LC)的质量比,CS与LC的质量比,以及醋酸溶液pH值;考察LGP-CS/LC-NPs的粒径分布、Zeta电位、微观形态,以及体外药物溶出速率;采用Caco-2细胞单层模型评价LGP-CS/LC-NPs的细胞跨膜转运;考察LGP原料药混悬液和LGP-CS/LC-NPs经大鼠ig给药后的体内药动学以及对糖尿病大鼠的血糖控制效果.结果 优化得到LGP-CS/LC-NPs的最优处方:LGP与LC的质量比为1:3,CS与LC的质量比为1:20,醋酸溶液pH值为4～5;制备的LGP-CS/LC-NPs的粒径为(195.5+7.8)nm,Zeta电位为(35.6±0.8)mV,在透射电镜下可观察到LGP-CS/LC-NPs为球形"核-壳"结构;LGP-CS/LC-NPs的体外溶出速率显著高于LGP混悬液;LGP-CS/LC-NPs能有效提高LGP的跨膜转运能力;与LGP混悬液相比,大鼠igLGP-CS/LC-NPs后可显著提高LGP生物利用度,且可较好地控制糖尿病模型大鼠的血糖水平.结论 以CS和LC作为载体材料,将LGP制备成LGP-CS/LC-NPs,能够显著提高LGP 口服生物利用度,达到良好的控糖效果.

目的 研究甘草酸对蛇床子素溶解度和生物利用度的影响,并探讨甘草酸影响蛇床子素溶解度、改善其药代动力学的作用机制.方法 雄性SD大鼠单独口服蛇床子素(20 mg·kg-1)和配伍甘草酸(45 mg·kg-1)给药前后,在特定时间点采集血液和肝脏样本并用LC-MS/MS方法测定蛇床子素浓度配伍前后的变化.通过X射线衍射(XRD)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)等物理表征,研究甘草酸对蛇床子素溶解度的影响,揭示甘草酸的增溶机理.采用Caco-2细胞单层模型,研究蛇床子素在体外的吸收转运过程,以及甘草酸及其活性代谢物甘草次酸(GC)对蛇床子素在Caco-2 细胞吸收的影响.采用大鼠肠上皮细胞S9 和肝细胞S9 孵育系统,探讨甘草酸和甘草次酸对蛇床子素体外代谢的影响.结果 大鼠体内药代动力学结果表明甘草酸配伍蛇床子素可显著提高蛇床子素大鼠体内生物利用度.大鼠肝组织样本实验结果表明,甘草酸增加蛇床子素在肝组织中的分布.体外溶解度实验研究发现,甘草酸能显著提高蛇床子素在水中的溶解度,推测可能的原因为蛇床子素结晶度的降低以及蛇床子素与甘草酸之间形成氢键所致.Caco-2细胞单层模型结果显示甘草酸和甘草次酸均不能促进蛇床子素的吸收,体外孵育研究表明,甘草酸与甘草次酸对蛇床子素的体外I相代谢的影响较小.结论 通过甘草酸和蛇床子素二者配伍机制的探讨,配伍后蛇床子素生物利用度的提高和肝脏浓度的增加可能是由于甘草酸提高了蛇床子素的溶解度.对进一步研究以溶解度作为胃肠道吸收限速步骤的难溶性药物与天然增溶剂甘草酸配伍使用的合理性具有重要意义.

目的 探讨丁酸对TNFα所致肠上皮屏障损伤的保护作用.方法 用CCK-8 细胞活力检测探索TNFα对Caco2 发挥损伤作用的最佳浓度和时间,并以此为基础探索在TNFα发挥损伤作用最佳作用时间附近丁酸对Caco2 细胞的保护情况,随后探索TNFα和丁酸共同作用于Caco2 细胞时的最佳时间和浓度,并检测Caco2 细胞单层上皮屏障的FITC-dextran渗透率,紧密连接ZO-1 和Occludin的mRNA表达情况及免疫荧光观察TNFα和丁酸共同作用后细胞的生长情况及ZO-1 和Occludin在Caco2 中的表达和分布.结果 100 ng/mL的TNFα刺激 48 h能明显降低Caco2 的细胞存活率(P<0.0001);丁酸作用于Caco2 细胞 48 h,0.2 mM/L的丁酸能明显提高Caco2 的细胞存活率(P<0.0001).当TNFα和丁酸共同作用时,与TNFα干预组相比,丁酸可以明显降低 TNFα所致的肠上皮单层屏障的 FITC-dextran渗透率(P<0.0001),提高 ZO-1(P<0.01)和Occludin(P<0.01)的表达及稳定其在Caco2 细胞中的分布.结论 丁酸可以减轻TNFα所致的肠上皮屏障损伤,为进一步明确丁酸在溃疡性结肠炎治疗中作用机制提供实验基础.

目的 本研究建立Caco-2单层细胞模型研究野鸦椿酸摄取和转运特性.方法 采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-TQ-MS)测定野鸦椿酸的含量,考察不同时间、温度对其摄取的影响,在此基础上考察不同浓度、P-gp抑制剂、螯合剂和pH对其双向转运的影响.结果 在 37℃条件下,野鸦椿酸在Caco-2 细胞模型上 180 min时的摄取量为(8.38±0.87)μg/mg.野鸦椿酸低、中、高浓度的表观渗透系数(Papp 值)与浓度呈正相关,分别为(61.41±2.92)×10-4、(146.90±14.91)×10-4、(167.18±6.72)×10-4 cm/s,P-gp抑制剂和螯合剂对其Papp值无影响,弱酸性环境(pH=6.00)可明显提高其Papp 值,其外排率(ER)介于 0.8～1.4 之间.结论 在Caco-2细胞模型中野鸦椿酸跨膜渗透性良好,其主要吸收方式为被动扩散,不是P-gp的底物,且不存在细胞旁路转运.本研究可为含有野鸦椿酸的药物的体内肠道吸收提供实验依据.

目的 制备精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸肽(RGD)修饰的载阿霉素固体脂质纳米粒(RGD-DOX-SLNs),观察其在肠道M细胞模型中的转运能力.方法 采用不同乳化剂配方,以乳化溶剂挥发法制备固体脂质纳米粒(SLNs),通过检测SLNs的稳定性,选取较优乳化剂配方进行阿霉素包载;制备载阿霉素的SLNs(DOX-SLNs),测定粒径、表面电位及包封率,选择最优乳化剂配方,对DOX-SLNs表面进行RGD修饰,制备RGD-DOX-SLNs;以空白SLNs作为对照.使用透射电镜观察RGD-DOX-SLNs和DOX-SLNs的形态,采用CCK-8法测算与载药SLNs共培养的Caco-2细胞及293T细胞存活率以评价载体安全性.建立滤泡相关上皮单层细胞模型,分别加入含有阿霉素单药、DOX-SLNs或RGD-DOX-SLNs的HBSS液,采用荧光分光光度法测定转运小室下侧的阿霉素浓度,共聚焦显微镜观察荧光,评价RGD-DOX-SLNs和DOX-SLNs的药物转运能力.结果 选择最优乳化剂配方为1%吐温与1%泊洛沙姆188体积比2∶1,DOX-SLNs粒径、表面电位及包封率分别为(147.4±11.2)nm、(-20.0±2.3)mV、80.9%±2.8%,RGD-DOX-SLNs分别为(153.1±6.2)nm、(-22.0±1.3)mV、81.3%±0.8%.透射电镜下RGD-DOX-SLNs和DOX-SLNs形态圆整,RGD-DOX-SLNs表面略粗糙.RGD-DOX-SLNs和DOX-SLNs在0～1000 μg/mL浓度范围内安全性较好.阿霉素单药组、DOX-SLNs组及RGD-DOX-SLNs组的转运量依次增高(P均<0.05);阿霉素单药组红色荧光微弱,DOX-SLNs组X-Y、Y-Z、X-Z三个切面均可见红色荧光,RGD-DOX-SLNs组红色荧光强度较DOX-SLNs增强.结论 成功制备RGD-DOX-SLNs,较DOX-SLNs对阿霉素的体外转运能力更高.

目的 研究芹菜素在Caco-2细胞的摄取特性.方法 采用Caco-2单层细胞模型,研究芹菜素在不同时间、浓度、温度、pH值、P-糖蛋白抑制剂条件下对细胞摄取的影响,采用HPLC测定芹菜素在细胞中的含量.结果 芹菜素在0.33～80μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9994).芹菜素在Caco-2细胞的摄取呈现一定的时间、浓度和pH值依赖性,且P-糖蛋白抑制剂不能增加其摄取量.结论 该方法操作简单、灵敏,P-糖蛋白未参与芹菜素的转运过程,芹菜素在Caco-2细胞的摄取主要是被动转运.

目的:阐明黄连解毒汤有效活性成分对炎症级联反应信号传导通路TLR4/NF-κB的阻断作用.方法:利用脂质体转染试剂Li-pofectin 2000⑧将含有hTLR4(human toll-like receptor4)基因和NF-κB-Luc报告基因的质粒转染入人胚肾细胞(HEK293细胞),加入不同浓度和配伍组成的药物刺激后再检测细胞荧光素酶表达水平,筛选出能够有效阻断TLR4/NF-κB信号传导通路的黄连解毒汤有效组分;进一步选择Caco-2细胞单层模型研究转运蛋白对黄连解毒汤有效活性成分的吸收和转运机理.结果:黄连解毒汤中小檗碱和黄芩苷活性单体能阻断TLR4介导的信号通路的传导,显著抑制NF-κB因子的生成;摄取实验中,黄芩苷和小檗碱配伍组能够显著提高小檗碱活性单体在Caco-2细胞中摄取量[(1.23±0.03) ng/μg],加入多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-as-sociated protein 2,MRP2)抑制剂MK-571之后,小檗碱的摄取量有显著提高[(1.05 ±0.09) ng/μg],但是在加入P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抑制剂维拉帕米后,虽然有黄芩苷存在,小檗碱的摄取量未见提高[(0.53 ±0.05) ng/μg].结论:通过TLR4受体介导NF-κB通路抑制剂筛选模型,筛选出黄连解毒汤内小檗碱能够有效阻断TLR4/NF-κB信号通路的传导,在小檗碱的跨膜转运的过程中不存在肠道转运蛋白P-gp的作用,但存在MRP2的外排作用,这可能是因为黄连解毒汤中配伍黄芩苷可抑制MRP2蛋白活性,从而使Caco-2细胞中小檗碱被外排的量减少,增加小檗碱的吸收量.