目的:了解多重RT-PCR方法检测13种常见呼吸道感染病原体，在老年患者呼吸系统感染病原体检测中的应用价值。方法:317例2016年6月至2017年5月在石家庄市第一医院老年科就诊的具有呼吸系统感染症状的老年患者，年龄60～98岁，采集其抽吸痰液，提取病毒DNA/RNA，利用多重RT-PCR技术扩增，通过毛细管电泳，同时检测13种呼吸道病原体；并以直接测序方法和荧光实时PCR法为标准，评价该试剂的临床性能。结果:使用直接测序和荧光实时PCR结果为参照，多重RT-PCR技术的准确性为99.93% (95% CI: 99.79%～99.98%)，阳性预测值为99.24% (95% CI: 97.78%～99.74%)，阴性预测值为100% (95% CI: 99.9%～100%)，Cohen’s kappa值为0.9958 (95% CI: 0.965 2～1.026)。在317例老年患者中，呼吸道病原阳性检出率为75.7% (240/317)，其中甲型流感病毒最高，为20.2% (64/317)，主要为H3亚型(70.3% (45/64)；其次为鼻病毒、腺病毒、肺炎支原体和乙型流感病毒，检出率分别为15.5% (49/317)、13.6% (43/317)、11.0% (35/317)和10.1% (32/317)。此外，同时检出2种以及2种以上病原体的老年患者为81例，检出率为25.6% (81/317)。 结论:多重RT-PCR方法能满足临床对呼吸道病原体检测的需求，并为老年患者呼吸系统感染的防治提供有效的临床资料。

目的:为了弥补传统大规模人群监测的不足，在新冠疫情爆发初期提供预警信号，重庆市自2023年起开展城市污水新冠病毒监测工作。方法:新冠病毒"乙类乙管"后，选择了重庆主城4个区5个有自动样本采集设施的污水处理厂作为监测点，每周每个污水处理厂各采集2份污水，用铝盐沉淀法进行富集浓缩，应用多重实时荧光RT-PCR方法对新冠病毒进行检测和分析。结果:2023年1月16日至12月31日累计监测城市污水496份，其中新冠病毒核酸检测阳性285份，总检出率57.46%。第3～5周、18～21周、40～47周新冠病毒检出率均为100.00%。城市污水中新冠病毒核酸浓度在第18周达到高峰，随后开始下降，进入低水平、波动流行期，污水监测新冠病毒核酸日均浓度与传染病监测系统显示的每日新增新冠感染者数、发热门诊新冠阳性检出率的变化趋势基本吻合。结论:重庆市城市污水中新冠病毒的检出率较高，尤其是4～5月份，污水监测可以间接反映新冠病毒感染状况。

目的:探讨痤疮丙酸杆菌生物膜诱导人原代角质形成细胞发生炎症反应的分子机制。方法:体外构建痤疮丙酸杆菌生物膜模型，激光共聚焦显微镜观察其三维立体结构。将培养的人原代角质形成细胞分成3组：二甲基亚砜（DMSO）对照组（仅加入0.01% DMSO）、痤疮丙酸杆菌悬浮菌组（加入痤疮丙酸杆菌悬浮菌，简称悬浮菌组）、痤疮丙酸杆菌生物膜悬液组（加入痤疮丙酸杆菌生物膜悬液，简称生物膜悬液组）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测孵育6 h后各组白细胞介素6（IL-6）、IL-8以及肿瘤坏死因子α（TNF-α） mRNA相对表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测孵育24 h后各组IL-6、IL-8及TNF-α游离蛋白水平，Western印迹法检测角质形成细胞Toll样受体2（TLR2）蛋白表达水平。进一步用TLR2/丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）/核因子κB（NF-κB）信号通路关键分子的阻断剂（C29、ST2825、BAY11-7082、SB203580、U0126-EtOH）联合痤疮丙酸杆菌生物膜悬液作用于人原代角质形成细胞，同时设DMSO对照组和痤疮丙酸杆菌生物膜悬液阳性对照组，然后检测IL-6、IL-8及TNF-α mRNA和游离蛋白表达水平。多组间比较采用单因素方差分析，两两多重比较采用Bonferroni法。结果:激光共聚焦显微镜下，痤疮丙酸杆菌生物膜形成草坪般的三维立体结构，生物膜生长状态良好。RT-qPCR及ELISA显示，生物膜悬液组、悬浮菌组、DMSO对照组炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α mRNA及游离蛋白表达水平差异均有统计学意义（mRNA： F = 89.70、312.17、46.09，均 P < 0.001；游离蛋白： F = 886.12、634.25、307.01，均 P < 0.001）；生物膜悬液组IL-6、IL-8、TNF-α mRNA及游离蛋白表达均显著高于悬浮菌组和DMSO对照组（均 P < 0.001）；悬浮菌组IL-6 mRNA表达及TNF-α游离蛋白表达均显著高于DMSO对照组（ P < 0.001、= 0.003），但IL-6游离蛋白、TNF-α mRNA、IL-8 mRNA及游离蛋白表达与DMSO对照组相比差异无统计学意义（均 P > 0.05）。Western印迹结果显示，生物膜悬液组和悬浮菌组TLR2蛋白表达均明显高于DMSO对照组。经不同MAPK/NF-κB通路抑制剂预处理及痤疮丙酸杆菌生物膜悬液共孵育，C29组、ST2825组、BAY11-7082组、SB203580组、U0126-EtOH组及DMSO对照组IL-6、IL-8、TNF-α mRNA及游离蛋白表达水平均显著低于生物膜悬液组（均 P < 0.05）。 结论:痤疮丙酸杆菌生物膜诱导人角质形成细胞发生炎症反应能力较强，可能通过激活TLR2/MAPK/NF-κB信号通路实现。

呼吸道感染性疾病在儿童、老年人和免疫低下人群中发病率高，病死率高，病原学诊断极为关键。然而，呼吸道感染病原复杂，明确病原是临床的难点。传统的呼吸道病原检测方法包括涂片染色镜检法、微生物培养法、免疫学方法等。近几年，分子生物学检测方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、多重PCR、宏基因组二代测序（mNGS）和靶向基因组测序（tNGS）技术逐渐兴起。每种检测方法各具其优势和不足，因此，临床医生应根据患者疾病病情、免疫状况及影像学表现，选择适当的检测方法，必要时联合多种检测手段进行相互验证，以便做出符合患者病情的正确诊断。

探讨山东省青岛市地区急性呼吸道感染患儿人副流感病毒3型（HPIV-3）的感染情况，并分析HPIV-3血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）基因特征。本研究为横断面研究，青岛市妇女儿童医院、青岛大学附属医院西海岸院区及崂山院区在2018年1月至2019 年12月期间，每月随机采集急性呼吸道感染（ARTI）儿科患者的咽拭子样本，总共1 674份，采用多重实时荧光逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法，筛查HPIV-3阳性样本。采用巢式PCR方法扩增HPIV-3阳性样本HN全长基因并进行序列测定，序列结果与GenBank中HPIV-3的代表株进行对比分析，建立系统进化树。结果显示，1 674份咽拭子样本中，HPIV-3阳性有90份，检出率为5.37%，其中，6岁以下儿童占97.78%（88份）。HPIV-3阳性病例主要分布在春季和夏季。通过巢式PCR方法扩增得到44株HPIV-3 HN基因全长序列，序列比对及进化分析表明，HPIV-3 HN基因属于C3基因亚型的C3a和C3b分支，其中，C3a亚型有30株，C3b亚型有14株。44株青岛分离株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0%~100.0%和98.5%~100.0%。综上，2018至2019年间，HPIV-3 C3基因型的C3a和C3b分支在山东省青岛市地区循环流行，其HN基因型变异较小，进化上具有一定的地域特征。

目的:报告濮阳市首例发热伴血小板减少综合征病例，通过流行病学调查和基因测序了解其流行病学特点并分析濮阳市首例新型布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)分离株S、M、L片段分子特征。方法:采用流行病学调查方法，分析流行病学特点，用Vero细胞分离病毒，提取SFTSV核酸，实时荧光定量PCR进行检测；构建多重PCR法对病毒核苷酸序列进行特异性扩增，利用二代测序仪进行全基因组测序，DNAStar、MEGA11等生物信息软件进行同源性分析，构建系统进化树。结果:流行病学调查结果显示，患者及其密切接触者14 d内均无旅居史，有野外作业史，无蜱虫叮咬史；血液样本检测SFTSV核酸阳性；SFTSV基因型为E型，其S、M、L片段基因均为E型，与GenBank中已知的SFTSV核苷酸序列进行比对，核苷酸序列同源性分别为94.8%~99.9%、94.0%~99.8%、95.7%~99.7%。结论:该患者确诊为濮阳市首例SFTSV感染引起的发热伴血小板减少综合征，与河南近年来分离株基因分型差异较大，与国内分离株亲缘关系近，考虑病毒存在从河南省内其他地方及湖北等地输入的情况，需加强监测和宣教，同时关注病毒的进化与变异。

目的:了解我国儿童急性下呼吸道感染（ALRTI）住院病例呼吸道合胞病毒（RSV）的感染状况。方法:于2017年6月至2020年3月，在我国华北地区的首都医科大学附属北京儿童医院、东北地区的中国医科大学附属盛京医院、西北地区的银川市妇幼保健院、华南地区的广州市妇女儿童医疗中心、东南地区的温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院和西南地区的贵阳市妇幼保健院开展前瞻性儿童ALRTI病例感染RSV的多中心研究，最终共纳入2 839例病例。采集儿童ALRTI住院病例的呼吸道样本，使用多重实时荧光定量PCR方法筛检样本中的16种呼吸道病毒，分析儿童ALRTI住院病例中RSV感染状况。结果:RSV总检出率为18.6%（528/2 839）；各地区RSV检出率5.5%~44.3%。男童的RSV检出率高于女童检出率（20.2% 比16.3%）（ P=0.009）。<5岁年龄组的RSV检出率（22.3%，501/2245）高于5~18岁组（4.5%，27/594），差异有统计学意义（χ 2=97.98， P<0.001）；<6 月龄组患儿的RSV检出率（37.0%）高于其他年龄组，且差异有统计学意义（均 P<0.001）。2018年1月至2019年12月，RSV全年均有检出（除2019年6月和7月），冬春季是流行高峰。270例重症肺炎病例中，RSV核酸阳性病例占比为17.0%（46/270），其中36例为单纯RSV感染。 结论:RSV是引起我国5岁以下儿童ALRTI的常见病毒病原体；全年均可检出，并呈现出冬春季流行高峰。

目的:分析北京市西城区2015—2022年5岁以下腹泻患儿A组轮状病毒（group A rotavirus，RVA）病原学及临床特征，为RVA腹泻的临床诊断、疫苗研发和防控提供科学依据。方法:2015年1月—2022年12月，按月收集北京市西城区两家哨点医院就诊的5岁以下腹泻患儿粪便标本，采用实时荧光PCR法进行RVA检测，采用多重半巢式RT-PCR进行基因分型，使用SPSS 19.0软件对流行病学及临床数据进行统计学分析,率的比较采用卡方检验，使用二分类非条件logistic回归分析临床特征差异。结果:共收集粪便标本1 617件，总阳性率13.48%（218/1 617）。每年12月到次年2月为RVA流行高峰，3—5月为次高峰。12~23月龄年龄组阳性率最高（20.44%，84/411）。170件RVA阳性标本进行了G、P基因分型，G分型以G9为主（84.12%，143/170），P分型以P[8]型为主（93.53%，159/170），G/P组合基因型以G9P[8]和G8P[8]为主，2015—2021年G9P[8]为优势基因型，2022年G8P[8]取代G9P[8]成为优势基因型。与每日最高腹泻次数<5次的患儿相比，每日最高腹泻次数≥5次的患儿RVA阳性的风险为1.481（95% CI：1.113~1.972）倍。与未出现水样便的患儿相比，出现水样便的患儿RVA阳性的可能性为3.971（95% CI：2.958~5.331）倍。 结论:RVA具有明显季节性，冬春季高发，12~23月龄为主要感染年龄组，自2022年G8P[8]取代G9P[8]成为优势基因型。出现水样便及每日最高腹泻次数≥5次的患儿RVA感染风险更高。

目的 为了探索诺如病毒的分布和时间动态变化特征,初步量化污水中诺如病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型(GⅠ和GⅡ)RNA浓度,以构建污水中诺如病毒定量检测数据库,为进一步开展基于污水流行病学诺如病毒监测预测人群感染的研究提供基本资料与数据支撑.方法 在深圳市设立5个污水采样点,进行为期一年的定性定量监测.从2022年8月-2023年8月,每周规律采样.采用逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)方法,对诺如病毒(GⅠ和GⅡ)进行检测和定性分析;采用圆盘电泳过滤器和聚乙二醇沉淀法,提取核酸;采用定量逆转录-聚合酶链反应(quantitative re-verse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)进行定量分析.诺如病毒RNA载量进行log10转化,数值归一化处理;率的比较采用x2检验或Fisher确切概率法;对定量数据(不符合正态分布)比较采用Wilcoxon符号秩和检验.结果 在5个污水处理厂采集的260份污水中,诺如病毒GⅠ型、GⅡ型的总检出率分别为88.85％、91.15％,其中,96.5％样品同时检测出GⅠ、GⅡ型.研究期间,诺如病毒在2月和3月达到高峰,GⅠ、GⅡ型最高值达到108.67 GC/L和108.06 GC/L.诺如病毒在原始废水样品中广泛分布,GⅠ、GⅡ型分别为83.3％～100％和91.6％～100％,其中,诺如病毒GⅠ、GⅡ型RNA载量范围分别为3.8～6.66 log10 GC/L、3.8～7.3 log10 GC/L,均值为106.11 GC/L、106.15 GC/L.结论 通过污水中诺如病毒的监测,证实诺如病毒常年存在,全年四季的病毒浓度差异及其趋势特征符合诺如病毒季节性流行病学特征.探索利用污水流行病学方法来提示诺如病毒在人群中的流行病学特征,是对目前主要基于确诊病例被动监测的重要补充.

目的 通过研究2018-2022年辽宁省沈阳市监测周期中流感病毒的病原学监测情况,了解该市流感病毒的流行特征,同时,对乙型流感病毒的血凝素全长基因进行扩增,分析沈阳市流感病毒流行的分子特征及谱系进化特点.方法 采集2018年10月1日至2022年3月31日沈阳市哨点医院门诊ILI咽拭子标本,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法确认流感病毒核酸阳性后进行病毒分离,选取部分乙型流感毒株,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对其血凝素全长基因进行扩增测序,使用Snapgene软件对测序结果进行拼接,Clustal W比对多重序列,最后使用MEGA 7.0软件构建进化树分析氨基酸突变位点.结果 2018-2022监测周期中沈阳市流感病毒检出总阳性率为5.00％,主要以A/H1N1型病毒为主(44.38％),其次是A/H3N2病毒(28.37％)和B/Victoria(27.24％),未检测到B/Yamagata系毒株.在2020-2021和2021-2022两个流行季中B/Victoria系毒株占比分别为83.33％和86.66％,为绝对优势株,且人群分布中5～14岁年龄组易感.沈阳市分离到的B/Victoria系毒株其血凝素基因均在V1A分支上.与疫苗株相比,流行株在HA蛋白的120环、150环、160环及190螺旋等关键抗原决定簇部位有多个氨基酸位点突变.结论 在2018-2022年监测周期中,流感病毒流行的亚型多样性减少,但B/Victoria系遗传多样性增加,而且在多个关键抗原决定簇上发生突变,因此,需对流感的流行特征和乙型流感分子进化情况作以持续的监测,为以流感为主的呼吸道传染病防控提供科学依据.