目的:探讨雄蚕益肾方含药血清对H2O2诱导小鼠睾丸间质细胞氧化应激损伤后铁死亡的影响.方法:应用H2O2诱导小鼠TM3 睾丸间质细胞建立氧化应激损伤模型,将诱导成模的TM3 细胞随机分为模型组、雄蚕益肾方组、铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 组、Ferrostatin-1 联合雄蚕益肾方组,分别用空白血清、20%含药血清、2 μmol/L Ferrostatin-1、2 μmol/L Ferrostatin-1+20%含药血清干预,另设置对照组(正常TM3 细胞+空白血清).观察各组细胞形态,检测各组细胞分泌的睾酮、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、铁蛋白重链1(FTH1)、溶质载体家族7 成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4)、脂肪酸辅酶A连接酶4(FACL4)、总铁离子及亚铁离子含量.结果:与模型组比较,对照组ROS、MDA、FACL4、总铁和亚铁离子表达均显著降低(P<0.05),睾酮、SOD、谷胱甘肽、FTH1、SLC7A11 及GPX4 表达均显著升高(P<0.05);雄蚕益肾方组能显著促进TM3 细胞分泌睾酮并上调TM3 细胞FTH1、SLC7A11、GPX4、GSH和SOD表达(P<0.05),显著下调ROS、MDA、FACL4、总铁离子和亚铁离子表达(P<0.05).结论:H2O2 暴露后可通过氧化应激诱导小鼠TM3 睾丸间质细胞发生铁死亡,雄蚕益肾方可能通过激活SLC7A11/GSH/GPX4 轴拮抗TM3 细胞氧化应激损伤及铁死亡,这可能是雄蚕益肾方治疗男性迟发性性腺功能减退症的潜在作用机制.

目的 观察艾灸是否通过影响氧化应激,维护生殖系统中睾酮之水平,以期为深入研究艾灸延缓生殖衰老机制问题奠定基础.方法 以自然衰老小鼠(18月龄)为衰老模型,随机分为衰老组、艾灸组;另设青年组(3月龄).艾灸组进行麦粒灸双侧足三里穴,艾绒制成麦粒大小的艾炷,置于涂抹凡士林的穴位上,线香引燃,每穴5壮,衰老组只在相同部位做抓取固定动作,不做艾灸,麦粒灸每干预5次间隔2 d.采用HE染色、衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色观察麦粒灸足三里穴干预自然衰老小鼠的效应,并应用ELISA法测量血清睾酮(testosterone,T)含量,WB法测量p53、p21、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)表达量.结果 HE染色结果显示麦粒灸足三里穴可改善自然衰老小鼠睾丸组织形态学,SA-β-gal染色结果显示麦粒灸足三里穴可改善自然衰老小鼠睾丸衰老程度.与青年组比较,衰老组p53、p21表达均显著升高,表明造模成功,而经过麦粒灸足三里穴干预后,均显著降低;衰老组血清T显著降低,而艾灸组显著上升;在氧化与抗氧化指标方面,衰老组MDA明显上升,而艾灸组MDA水平下降,衰老组MnSOD、GPX4都下降,而艾灸组显著升高.结论 麦粒灸足三里穴可以提高自然衰老模型小鼠的血清睾酮水平,而这种作用的发挥与氧化应激密切相关,艾灸通过抑制活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生与增强抗氧化能力,进而阻碍氧化应激,维护了睾丸间质细胞的结构与功能,提高了睾酮水平,从而延缓了睾丸间质细胞的衰老.

目的:探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）移植对氧化损伤衰老小鼠睾丸功能的影响及分子机制。方法:共纳入18只6~8周SPF级C57BL/C雄性小鼠，完全随机分组法分为3组，对照组：小鼠注射等量生理盐水；模型组：颈背部皮下注射D-半乳糖连续9周，造模第4周末，每只小鼠尾静脉注射生理盐水；hUCMSCs组：颈背部皮下注射D-半乳糖连续9周，造模第4周末，每只小鼠尾静脉注射hUCMSCs。9周后，称取小鼠体质量和睾丸重量，计算睾丸指数，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测小鼠血清睾酮水平、睾丸组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量。肉眼观察睾丸外观，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察睾丸组织病理学变化，实时荧光定量聚合酶链反应和Western blotting分别检测核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信号转导相关基因和蛋白表达。结果:模型组小鼠睾丸指数［（0.64±0.05）%］较对照组［（0.81±0.13）%， P=0.006］降低，睾丸体积缩小，生精小管完整性破坏，生精细胞和精子减少，间质稀疏；血清睾水平［（4.10±0.67）μg/L］、睾丸组织SOD活性［（48.87±6.40）U/mg Prot］较对照组［（5.71±0.81）μg/L， P=0.002；（78.53±9.70）U/mg Prot， P=0.001］均降低，而MDA含量［（1.11±0.19）nmol/mg Prot］较对照组［（0.77±0.07）nmol/mg Prot， P=0.001］增加。 Keap1 mRNA和蛋白表达量较对照组均增高（ P=0.006， P=0.043）， Nrf2、 SOD和 NQO1 mRNA表达量较对照组减少（ P=0.002， P<0.001， P=0.001），Nrf2、HO-1蛋白表达量较对照组均明显降低（ P=0.011， P=0.021）。与模型组比较，hUCMSCs组小鼠睾丸指数［（0.79±0.03）%， P=0.010］增高；睾丸组织结构较为清晰、完整，生精小管各级生精细胞和精子及间质细胞较丰富；血清睾酮水平［（5.24±0.21）μg/L， P=0.028］及睾丸组织SOD活性［（79.47±14.32）U/mg Prot， P=0.001］增高，MDA含量［（0.77±0.08）nmol/mg Prot， P=0.001］降低； Nrf2、 SOD和 NQO1 mRNA表达量均增高（ P=0.024， P=0.037， P=0.005）， Keap1 mRNA表达量减少（ P=0.044），Nrf2、HO-1蛋白表达量均增高（ P=0.009， P=0.012），Keap1蛋白表达量降低（ P=0.035）。hUCMSCs组小鼠睾丸指数、血清睾酮、SOD活性及MDA含量都与对照组差异均无统计学意义（均 P>0.05）。 结论:hUCMSCs明显改善氧化损伤所致衰老小鼠睾丸结构和功能损伤，其作用机制与上调Nrf2信号转导及其相关下游抗氧化活性SOD、HO-1蛋白表达，减少Keap1介导的Nrf2降解有关。

目的 精子发生过程复杂,需要睾丸内细胞之间复杂的相互作用,但是支持细胞参与精子发生的机制仍有待探讨.方法 从高通量基因表达数据库(GEO:GSE113293),收集了正常精子发生的野生型C57BL/6J雄性小鼠和4 种不同突变小鼠(敲除Mlh3、Hormad1、Cul4a;Cnp转基因)的单细胞RNA测序数据,进而对支持细胞差异基因进行基因功能富集分析(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集通路分析、蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析、转录因子调控分析(SCENIC)及基因集变异分析(GSVA).结果 本研究鉴定出 9 种生精细胞亚群(未分化精原细胞、分化精原细胞、细线期/偶线期、粗线期、双线期、圆形精子细胞、长形精子细胞及精子)、2 种体细胞群(间质细胞和支持细胞)和1 种未知类型的细胞群.与正常精子发生模型相比,小鼠精子发生缺陷模型的支持细胞有276 个基因表达上调,234 个基因表达下调.GO功能富集分析显示,支持细胞的差异基因在精子发生及能量代谢等过程中显著富集.KEGG富集分析显示,支持细胞在核糖体、糖酵解、氧化磷酸化等途径显著富集.PPI网络分析鉴定出20 个hub基因,均属于核糖体基因.GSVA分析显示支持细胞中上调的基因与Notch信号通路密切相关.结论 支持细胞相关的的hub基因及Notch信号通路参与精子发生的过程,本研究为精子发生障碍导致不育症提供新的视角.

目的 探讨微小RNA(microRNA,miRNA)中的miR-221-3p靶向DNA损伤诱导转录本4(DNA-damage-inducible transcript 4,DDIT4)对镉诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响和机制.方法 小鼠睾丸间质细胞(mouse testicular stromal cells,TM3)经不同浓度的镉(0、10、20、30和40 μmol/L)染毒后,使用CCK-8检测细胞活性.提取镉染毒TM3细胞的总RNA,以差异倍数(fold change,FC)＞1.2,P＜0.05作为标准筛选显著差异表达miRNA.TM3细胞分为空白对照组、阴性对照组、镉染毒组(CdCl2,20 μmol/L)和镉染毒+miR-221-3p模拟物组,其中对镉染毒+miR-221-3p模拟物组,先将miR-221-3p模拟物转染进TM3细胞,再联合镉染毒24 h.Hoechst染色检测细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡率,实时荧光定量PCR和Western blot免疫印迹法检测DDIT4表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-221-3p与DDIT4的结合,生物信息学分析DDIT4的功能及与细胞凋亡的关联,过表达miR-221-3p后观察B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)的表达水平.结果 镉染毒可降低TM3细胞活性且存在剂量-效应关系.细胞形态学发现,与对照组相比,镉染毒组细胞皱缩、细胞核浓染,凋亡率升至19.66％±0.45％(P＜0.01);与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组正常形态细胞增多,凋亡率降至13.76％±0.37％(P＜0.05).镉染毒组miR-221-3p表达水平下调(P＜0.01),DDIT4表达水平上调(P＜0.05).生物信息学分析和双荧光素酶报告分析发现DDIT4为miR-221-3p的靶基因之一.与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组DDIT4表达水平下调(P＜0.05),Bcl-2/BAX比值由0.54±0.03增加为0.71±0.04.结论 miR-221-3p通过靶向DDIT4进而抑制镉诱导的TM3细胞凋亡.

冬虫夏草(cordyceps sinensis,CS)是东方社会历史悠久的强壮滋补类草药,可以增强生殖活动并恢复受损的生殖功能.CS成分复杂,其主要提取成分包括虫草素、异黄酮(isoflavones obtained from Cordyceps sinensis,CSIF),以及CS水提取成分F1(水溶性多糖)、F2(水溶性蛋白质)和F3(水溶性较差的多糖和蛋白质).截至目前,关于CS及其成分在生殖功能中的作用、具体机制及临床应用尚无系统阐述.首次综述CS及其成分对雌性及雄性生殖类固醇激素生成的体内外作用及机制.在雌性生殖系统中,CS通过上调类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenesis acute regulator protein,St AR)和芳香化酶(aromatase,AROM)的表达促进人颗粒黄体细胞(granulosa luteal cell,GLC)中雌二醇(estradiol,E2)的生成,此外,口服从CS中提取的CSIF对去卵巢(ovariectomized,OVX)大鼠具有显著的雌激素作用;在雄性生殖系统中,CS及其不同成分不仅对原代小鼠睾丸间质细胞中睾酮及小鼠睾丸间质肿瘤细胞(MA-10细胞)中孕酮生成有积极作用,还可显著提高小鼠血浆睾酮水平.不仅为研究CS调节生殖功能及在辅助生殖技术中的应用提供新的研究方向,同时提供新的临床治疗策略.

目的 比较亚硒酸钠(Se)和纳米硒(Nano-Se)对镉(Cd)致小鼠睾丸间质细胞毒性的干预作用.方法 将小鼠睾丸间质细胞分成四组,分别是对照组、镉染毒组(Cd 20 μmol/L)、硒+镉染毒组(Se+Cd)、纳米硒+镉染毒组(Nano-Se+Cd),每组至少 3 个样本,重复 3 次以上.CCK-8 检测细胞活性,Hoechst染色检测细胞凋亡形态变化,流式细胞仪分析细胞凋亡率,Western blot 测定蛋白的相对表达含量.结果 与Cd染毒组比较,Se组和Nano-Se组细胞活性明显上升(P＜0.01);当Se和Nano-Se的浓度达 20 μmol/L时,Se组和Nano-Se组细胞活性最高(P＜0.01),且Nano-Se与相同浓度的Se比较,Nano-Se组的细胞活性较高(P＜0.01).细胞形态观察发现,Cd染毒组细胞皱缩变圆,体积变小,细胞间距变大,荧光染色细胞核染色较多;与 Cd 染毒组比较,Se 组和 Nano-Se 组生长形态较好,荧光染色细胞核染色较少,Nano-Se 组比 Se 组生长情况更佳.Cd 染毒组细胞凋亡率显著高于对照组(P＜0.01),而与Cd染毒组比较,Se组和Nano-Se组细胞凋亡率明显降低(P＜0.01);且与Se组比较,Nano-Se组细胞凋亡率更低(P＜0.01).与对照组比较,Cd染毒组TM3 细胞Bax/Bcl-2 比值明显增大(P＜0.01);与Se组比较,Nano-Se组的Bax/Bcl-2比值更低(P＜0.05).结论 Nano-Se与Se比较对Cd致TM3 细胞毒性干预作用更好,可能与Nano-Se能更好抑制镉引起的TM3 细胞凋亡有关.[营养学报,2023,45(6):583-587]

目的 探讨养精胶囊促进睾丸间质细胞合成睾酮(T)的具体机制.方法 将雄性BALB/c小鼠饲养至18 月龄,以生理盐水和不同剂量养精胶囊混悬液灌胃处理30 天.ELISA法检测小鼠血清T水平;Western blot检测小鼠睾丸组织Beclin-1 和LC3 蛋白的表达水平;透射电镜观察小鼠睾丸间质细胞的自噬情况.结果 养精胶囊灌胃处理后,老年小鼠的血清T水平增加,且呈剂量依赖性,养精胶囊低、中、高剂量组小鼠的血清 T与老年对照组相比,均有显著差异(P<0.01);养精胶囊低、中、高剂量组小鼠睾丸组织中的 Beclin-1 和 LC3 II/I均显著高于老年对照组(P<0.05);透射电镜结果显示,与老年对照组相比,养精胶囊低、中、高剂量组小鼠睾丸组织中间质细胞内自噬小体明显增多,尤其是养精胶囊高剂量组.结论 养精胶囊可以通过调控睾丸间质细胞的自噬,从而提高其合成T的功能.

目的 探讨长链非编码RNA H19对小鼠睾丸间质细胞(LCs)合成分泌睾酮功能的影响及其可能的机制.方法 采用原代小鼠LCs和TM3细胞为研究对象,细胞分为二甲基亚砜(DMSO)组、2-硝基丙烷(2-NP)处理组、si control 组、si H19 组、si Creb1 组、Mimic control 组、miR-181c-5p mimic 组、Inhibitor control 组、miR-181c-5p inhibitor 组、si H1 9+Inhibitor control 组和 si H19+miR-181c-5p inhibitor 组共 11 组.干扰 H19 表达后,ELISA法检测其睾酮分泌水平的变化,CCK8法检测LCs增殖变化;生物信息学分析预测各基因的结合位点.RT-qPCR法和Western-blot检测各组小鼠LCs转染后各相关基因及蛋白表达的变化.结果 (1)与si control组比较,si H19组LCs培养液睾酮水平及细胞增殖水平均显著下降(72 h后,P＜0.01).(2)各相关基因之间存在结合位点.(3)与DMSO组比较,2-NP组LCs的p-STAT1表达增加、H19表达明显升高,而miR-181c-5p表达明显降低(P＜0.01).(4)与 si control 组比较,si H19 处理可显著下调 LCs 的 H19、Creb1、HSD3B1 和 HSD3B6 RNA 表达水平并显著上调miR-181c-5p表达水平(P＜0.01),si Creb1处理可显著下调Creb1、HSD3B1和HSD3B6 mRNA表达水平(P＜0.01);si H19组和si Creb1组Creb1、3β-HSD蛋白表达均明显降低(P＜0.01);与Mimic control组比较,miR-181c-5p mimic组H19、Creb1、HSD3B1和HSD3B6 mRNA表达明显降低,miR-181c-5p表达水平明显升高且Creb1、3β-HSD蛋白表达显著降低(P＜0.01);与Inhibitor control组比较,miR-181c-5p inhibitor组的各相关基因及蛋白表达呈现与miR-181c-5pmimic组作用相反的效应;与si H1 9+Inhibitor control组比较,si H19+miR-181c-5p inhibitor组H19表达显著升高,miR-181c-5p表达水平明显降低,Creb1、HSD的mRNA和蛋白表达均明显升高(P＜0.01).结论 H19低表达可通过抑制细胞增殖、miR-181c-5p表达升高、Creb1蛋白表达降低和3β-HSD蛋白表达降低导致LCs合成分泌睾酮能力降低.STAT1/H19/miR-181c-5p/Creb1/3β-HSD通路可能在LCs功能调控中发挥重要作用.

目的 探讨参杞强精颗粒对过氧化氢H2O2诱导的小鼠睾丸间质细胞TM3氧化应激损伤的作用.方法 以小鼠睾丸间质细胞为细胞模型,用MTT法检测参杞强精颗粒对正常TM3的细胞毒性作用;以500 μmol/L H2O2诱导损伤TM3细胞4 h后复制氧化应激损伤模型,采用CCK-8法检测不同浓度参杞强精颗粒对H2O2损伤TM3细胞增殖活力的影响;分别给予参杞强精颗粒(0.4、0.8和1.6 mg/mL)干预处理24 h后,用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中睾酮分泌水平、一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量及谷胱甘肽-S转移酶(GST)的活性;同时检测细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及总抗氧化能力(TAOC)的含量;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测睾酮合成酶类固醇合成快速调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、17β-羟基固醇脱氢酶(17β-HSD)mRNA表达.结果 参杞强精颗粒在浓度为0.05～2.50 mg/mL时对正常TM3细胞无毒性作用.与H2O2损伤模型组比较,参杞强精颗粒各剂量组能提高TM3细胞增殖活率(P<0.05).与H2O2模型组比较,参杞强精颗粒各剂量组提高细胞上清液中睾酮水平和NO含量,增加GST活性,降低LDH和8-OHdG含量(P<0.05).与H2O2 损伤模型组比较,参杞强精颗粒各剂量组降低细胞内ROS、MDA含量,同时增强CAT、SOD和TAOC的活性(P<0.05).与H2O2 模型组比较,参杞强精颗粒各剂量组能提高睾酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA相对表达量(P<0.05).结论 参杞强精颗粒对H2O2诱导睾丸间质细胞氧化应激损伤具有保护作用,其机制可能通过清除氧自由基、抗氧化应激损伤及促进睾酮合成有关.