目的:分析1例A w37B亚型患者及其家系的血清学和分子特征，探讨其分子生物学机制及在疑难血型鉴定和临床输血中的意义。 方法:应用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-sequence specific primer，PCR-SSP)进行 ABO基因分型，并对 ABO基因的全部外显子进行扩增产物直接测序。进一步对第6、7外显子进行克隆测序。 结果:先证者红细胞为A弱B表型，其血清样本中含有弱反应性抗-A抗体，依据血清学特征可定义为A wB血型。血型基因分型检测到 A和 B等位基因。基因克隆测序显示在 A等位基因第7外显子存在 ABO* AW.37的特征性变异c.940A>G，导致多肽链第314位的赖氨酸(Lys)被谷氨酸(Glu)替换。同时测序发现先证者的女儿遗传了 ABO* AW.37等位基因。 结论:ABO血型基因第7外显子c.940A>G变异导致α-1，3-N-乙酰半乳糖基转移酶活性降低，产生A w37表型。

目的:应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法:选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型，设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3，制备AAV，病毒滴度达1～4×10 13 GC/ml；感染WD肝细胞，72 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出其中活性最高者sgRNA1，构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT，应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞，测序和T7E1酶切检测模板修复效率；用HT特异性引物行PCR，验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。 结果:Sanger测序结果显示，sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%]，与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%]，差异有统计学意义( P<0.05)。进一步用HT进行基因修正，能检出特异性修正后的ATP7B基因；二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。 结论:AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

目的:建立Junior血型基因分型技术，用于Jr(a-)稀有血型的鉴定和筛查。方法:选取2021年1月至2021年5月于深圳市血液中心无偿献血的O型RhD＋健康受试者( n＝1 568)和1个疑难交叉配血家系( n＝3)，共1 571例，为研究对象。用血清学检测技术进行先证者血型鉴定、意外抗体鉴定以及抗体效价测定。用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术进行先证者 RHD基因分型。建立 ABCG2基因编码区测序和PCR-SSP基因分型技术，对先证者及其家系成员进行基因型检测，并在深圳地区无偿献血者人群( n＝1 568)中开展Jra抗原阴性的稀有血型献血者筛查。 结果:先证者ABO血型为B型，RhD血型为部分D( RHD*DVI.3/RHD*01N.01)，Junior血型Jra抗原为阴性，血浆存在抗-D合并抗-Jra。 ABCG2基因测序发现先证者等位基因型为 ABGG2*01N.01/ABGG2*01N.01[c.376C>T(p.Gln126X)纯合变异]，为亚洲人群中最常见的Jr(a-)血型等位基因。在深圳地区无偿献血者人群中进行筛查，无Jr(a-)稀有血型献血者检出。通过杂合子的统计分析，发现 ABCG2*01N.01(c.376T)的等位基因型频率约为0.45%，这一分子背景的Jr(a-)稀有血型在深圳地区的出现频率约为0.2‰。 结论:本研究发现国内首例部分DVI.3型且Jr(a-)稀有血型，并成功建立Junior血型 ABCG2基因编码区测序以及PCR-SSP基因分型技术。

目的:了解青海省手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)患者中肠道病毒流行情况和基因型特征。方法:采集青海省HFMD患者的咽拭子标本，进行病毒分离和特异性引物聚合酶链反应(RT-PCR)，对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析，并参考NCBI部分毒株序列构建基因进化树。结果:采集临床诊断HFMD阳性病例标本1 738份，其中人肠道病毒A组71型(EV-A71)型326例，占18.76%、人肠道病毒柯萨奇A16型(CV-A16)型237例，占13.64%、人肠道病毒柯萨奇A6型(CV-A6)型628例，占36.13%，4年间不同基因型别间存在差异，具有统计学意义(EV-A71， χ2＝245.315, P<0.001; CV-A16， χ2＝27.680, P<0.001; CV-A6， χ2＝702.713, P<0.001)，用RD细胞分离后共得到到317株细胞培养物，测序后选取2017年和2018年典型基因型的VP1区核酸序列进行序列分析，全部基因型VP1区核酸序列间同源性在59%~100%之间，19株EV-A71VP1序列间核苷酸同源性分别在93%~100%之间，20株CV-A16型核酸VP1序列的同源性在92%~100%之间，6株CV-A6型VP1核酸序列的同源性在97%~99%之间。从进化树图上看，青海省流行的EV-A71毒株序列全都在进化树图的C4a分支上；CV-A16型分离到20个毒株序列出现在进化树图上的分为两个基因型别，18株为B1b，2株为1D基因型；CV-A6型分离到5个毒株为D3基因型，1株属于B1型。 结论:青海省2015—2018年HFMD的流行基因型别由EV-A71向CV-A16和CV-A6转变，青海省流行的EV-A71型一直是C4a基因型，CV-A16和CV-A6存在不同的基因型别，不同基因型间核酸序列差异性较大，同一基因间序列变异较小。

目的:探讨杀伤细胞免疫球蛋白受体(killer cell immunoglobulin receptor，KIR)基因多态性与烟台地区汉族无偿献血女性妊娠遗传易感性关系及与妊娠女性免疫球蛋白G ( immunoglobulin G，IgG )抗A(B)抗体效价的相关性。方法:收集2016年1月至2016年12月烟台地区无偿献血女性外周血样本，随访样本2017年1月至2018年12月间妊娠状态，分为妊娠组(160例)和未妊娠组(126例)。通过聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)法进行KIR基因分型。微柱凝胶法检测妊娠女性血清中其血清IgG抗A(B)抗体的效价。统计分析KIR基因频率及单倍型与妊娠遗传易感性的关系，以及与妊娠女性IgG抗A(B)抗体效价的关系。结果:在KIR基因水平，与未妊娠对照组比较，妊娠组KIR2DL5A基因频率高(48.1%比33.3%， χ2＝6.348， P<0.05)，而KIR3DL1、KIR2DS4*FUL基因频率低(86.3%比93.7%，66.9%比80.2%， χ2值分别为4.112和6.271， P值均<0.05)，差异有统计学意义。在KIR单倍型水平，与未妊娠对照组比较，妊娠组单倍型A比例低，而单倍型B比例高(41.3%比56.4%，58.8%比43.7%， χ2值均为6.440， P值均<0.05)，差异有统计学意义。KIR2DL2、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS4*DEL、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR3DP1*FUL在血清IgG抗A(B)抗体低效价组(<64)基因频率高于高抗体效价组(≥64)(20.9%比5.4%，60.5%比33.8%，15.1%比5.4%，62.8%比37.8%，25.6%比5.4%，55.8%比33.8%，48.8%比20.3%，60.5%比33.8%，23.3%比4.1%， χ2值分别为8.084，11.342，3.950，9.912，11.897，7.781，14.154，11.342，11.915， P值均<0.05)，而KIR2DS4*FUL基因频率在低效价组低于高效价组(51.2%比85.1%, χ2＝20.722， P<0.05)，差异有统计学意义。在KIR单倍型水平，单倍型A在低抗体效价组的比例低于高抗体效价组(18.6%比55.4%， χ2＝23.488， P<0.05)，而单倍型B在低抗体效价组比例高于高抗体效价组(81.4%比44.6%, χ2＝23.488， P<0.05)。 结论:KIR基因频率及单倍型与烟台地区汉族无偿献血女性妊娠及妊娠后IgG抗A(B)抗体效价相关，可为妊娠的遗传易感性和ABO系统新生儿溶血病的遗传筛查提供了新的方向。

目的:建立登革病毒(dengue virus, DENV)、黄热病毒(yellow fever virus, YFV)和基孔肯雅病毒(chikungunya virus, CHIKV)核酸的三重实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测方法。方法:通过全球共享数据库下载DENV(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)、YFV、CHIKV全基因组序列进行比对分析，针对这3种病毒的相对保守区域分别设计特异性引物和探针，建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法，以其他病毒核酸评价方法的特异性，用病毒体外转录RNA评价方法的灵敏度，以病毒高、中、低浓度核酸进行独立重复实验评价方法的重复性。DENV采用登革热患者血清进行验证，YFV、CHIKV采用模拟阳性标本进行验证，采用健康人血清进行阴性验证。结果:本方法与其他病毒核酸无交叉反应；对DENV(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)、YFV、CHIKV的最低检出限分别为21.55拷贝/反应、21.25拷贝/反应、21.85拷贝/反应、22.75拷贝/反应、22拷贝/反应、45.65拷贝/反应；各浓度检测 Ct值的标准差在0.5以内、变异系数在3%以下；临床阳性标本及模拟阳性标本的检出率为100%，健康人血清的阴性率为100%。 结论:本研究建立的DENV、YFV和CHIKV的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。

目的:探讨建立同步扩增中国人群全部 KIR基因和鉴定 KIR基因有无的序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法。 方法:选取2015年1月至2015年11月在深圳市血液中心无偿献血的132份健康受试者的血样为研究对象。基于中国人群精细水平 KIR等位基因的多态性和单核苷酸多态性(SNP)信息，参考IPD-KIR数据库，设计 KIR基因特异性引物用于扩增16种 KIR基因及 2DS4-Normal、 2DS4-Deleted 2种亚型；并采用 KIR基因型已知样本，对每对PCR引物的特异性进行验证。在 KIR基因的PCR扩增反应中，复合扩增人体生长激素( HGH)基因片段作为内对照，以防止PCR扩增出现假阴性结果。随机选取132份 KIR基因型已知的健康受试者DNA样本进行盲检，验证该方法的可靠性。 结果:本研究设计和筛选出的 KIR特异性引物，可鉴定相应的 KIR基因，而且内对照条带和特异性扩增条带均清晰、明亮；采用本研究建立的鉴定 KIR基因有无的PCR-SSP方法检测纳入研究的132份样本的盲检结果，与已知 KIR基因型完全一致。 结论:本实验建立的 KIR PCR-SSP方法，鉴定中国人群 KIR基因的有无可获得准确、可靠的结果。

目的:应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法:选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型，设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003，应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞，48 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出效率最高者crRNA001，并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板；用crRNA001和ssODN共转染肝细胞，模板特异性引物行PCR，验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。 结果:Sanger测序结果显示，crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后，模板特异性引物行PCR，能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带；二代测序结果显示，ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论:CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率，相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因，为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

目的:原核表达糖尿病创面来源大肠杆菌谷氧还蛋白(Grx)GrxB，制备GrxB多克隆抗体。方法:根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布的大肠杆菌K12标准株grxB基因序列(Gene ID：946926)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株糖尿病创面大肠杆菌基因组(煮沸裂解法获得)为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出grxB全长663 bp，使用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-grxB转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GrxB蛋白，使用N 2+镍离子层析柱对蛋白进行纯化。纯化后的重组GrxB蛋白免疫BALB/c小鼠，完成免疫程序后使用蛋白质印迹法(Western blot)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对多克隆抗体的特异性和效价进行测定。两组间比较采用 t检验。 结果:经测序，扩增出的grxB序列与K12标准株的完全一致，并成功表达出可溶性重组GrxB蛋白，大小为31.2 kDa，与预测大小一致。血清51 200倍稀释后，免疫组效价显著高于磷酸盐缓冲液(PBS)组(1.146±0.066比0.12±0.011， t＝15.000， P<0.05)，免疫组血清与重组GrxB蛋白和大肠杆菌全菌均具有良好的特异性反应。 结论:成功表达可溶性重组GrxB蛋白，并获得高滴度多克隆抗体。

目的:建立BCR：：ABL1 p210转录本荧光定量PCR（RQ-PCR）实验室自建检测方法和分析性能确认。方法:本研究采用欧洲抗癌计划（EAC）公布的BCR：：ABL1 p210转录本RQ-PCR检测的引物和探针序列建立了BCR：：ABL1 p210转录本RQ-PCR实验室自建检测（LDT）方法，通过WHO国际参考品获得转换系数（CF），并使用K562和HL60细胞系混合物构建两个不同水平的实验室内部质控品。回顾性分析慢性髓细胞性白细胞（CML）患者阳性标本，参考CLSI MM01-A3等指南评价实验室自建BCR：：ABL1 p210 RQ-PCR 方法的精密度、正确度、线性范围、分析灵敏度和分析特异性等参数。采用Bland-Altman法对LDT方法与美国FDA批准的BCR：：ABL1 p210转录本定量检测体外诊断（IVD）试剂盒检测结果进行一致性分析。结果:本中心通过WHO国际参考品校准获得的BCR：：ABL1国际标准值（BCR：：ABL1 IS）的CF为0.535。本研究建立的LDT方法在4个分子学反应（MR）水平（0.5、1.5、2.5、3.5）的BCR：：ABL1 IS 的重复性变异系数（ CV）分别为7.44%、5.33%、9.12%、18.06%，室内总不精密度 CV分别为7.99%、5.49%、10.95%、17.99%。2020至2022年本实验室所有美国病理学家协会（CAP）能力验证（PT）样本的MR值均在CAP允许的变异范围内，MR结果与CAP-PT MR 平均值强相关（ r=0.999， P<0.01），所有差值均在一致性界限范围内。本研究建立的LDT方法与Qiagen IVD试剂盒检测结果相关性高（ r=0.997， P<0.01）。e13a2转录本的BCR：：ABL1 IS线性范围为0.001%~7.454%，最大 CV值为64.09%。e14a2转录本的BCR：：ABL1 IS线性范围为0.002%~12.398%，最大 CV值为43.37%。e13a2转录本和e14a2转录本的最低检测限（LoD）分别为MR5.0（0.001% IS）和MR4.8（0.002% IS）；e13a2和e14a2转录本定量检测限（LoQ）均为MR4.7（0.002% IS）。该方法分析特异性为100%，与BCR：：ABL1 p190转录本检测无交叉反应性。 结论:本实验室自建的BCR：：ABL1 p210转录本RQ-PCR定量检测体系分析性能良好，可满足CML患者BCR：：ABL1融合基因的临床检测需求。