磁分离是从生物样本中富集特定目标物的常用方法.传统特异性磁分离方法一般通过将抗体与磁珠偶联获得免疫磁珠的方式用于特定目标物的捕获,但由于抗体有成本高、捕获目标物后不易释放等缺点,免疫磁珠难以满足众多研究领域对同时满足目标物大批量、高特异性富集的需求.核酸适配体同抗体一样具备目标物高特异性捕获的能力,相较抗体具有制备成本低、结构简单和化学稳定性高等优点,更适合用来大批量、高特异性富集特定目标物,因此在本研究中,本文利用石墨烯对单链和双链核酸的吸附能力不同的特性,以CD63适配体为例设计了一套可以将适配体展示于石墨烯表面并用于捕获、富集和释放目标物的方法.该设计主要包括2个单元,一是可以贴附于石墨烯表面并将CD63适配体展示于石墨烯外的双链寡核苷酸支架,二是采用与支架足部序列互补的单链寡核苷酸,将所捕获的目标物从石墨烯表面解吸附.本研究首先以氧化石墨烯(GO)纸为石墨烯界面,通过对支架或CD63蛋白等进行荧光标记,并对比支架释放前后及CD63蛋白捕获前后GO纸表面荧光强度变化表示其支架释放效果与CD63蛋白捕释情况,随后应用氨基修饰的石墨烯壳铁氮磁珠搭载CD63适配体双链支架,用于捕获细胞裂解液中CD63蛋白.结果表明,该支架可以将适配体展示于石墨烯表面捕获CD63蛋白并可以可控释放,使用挑选的改性石墨烯磁珠搭载该适配体双链支架,可以用于细胞裂解液中CD63蛋白的捕获.该方法有望实现多种蛋白质的特异性富集或通过捕获外泌体膜蛋白而富集外泌体等多种用途.

目的:制备并表征包载CPI-444并偶联CD8抗体的纳米微粒(CNP/αCD8),探讨其对CD8+T细胞活化、增殖和抗肿瘤作用的影响.方法:采用复乳溶剂蒸发法和EDC/NHS法制备包载腺苷受体A2A(A2AR)特异性拮抗剂CPI-444(C)或香豆素6(C6)荧光素的纳米微粒并分别在其表面偶联CD8抗体,制得CNP/αCD8和C6NP/αCD8.扫描电镜和NanoPlus粒度测定仪表征纳米微粒形态和粒径,液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)法和离心法测定纳米微粒的载药量和药物释放情况,荧光显微镜和流式细胞仪检测CD8+T细胞内化C6NP/αCD8的情况,流式细胞仪、ELISA和LDH法检测CNP/αCD8对CD8+T细胞增殖、活化、细胞毒活性和杀瘤能力的影响.结果:CNP/αCD8纳米微粒为圆形、粒径约150 nm,能有效包载CPI-444和偶联CD8抗体,药物包封率和CD8抗体偶联效率分别约为60%和53.4%;CNP/αCD8纳米微粒具有良好稳定性,能被CD8+T细胞内化,抑制A2AR分子表达.生物学功能实验显示,CNP/αCD8增强CD8+T细胞的增殖能力、促进T细胞活化、分泌细胞因子及产生颗粒酶B和穿孔素,并增强CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的能力.结论:CNP/αCD8纳米微粒能显著增强CD8+T细胞免疫效应功能,其增强CD8+T细胞功能可能是通过抑制A2AR分子的表达起作用.

目的 建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用.方法 选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14 作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25 作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA.分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测.结果 该方法确定的捕获抗体AM14 包被浓度为 1.25 μg/mL,检测抗体D25 浓度为0.50 μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA).方法验证结果显示,线性范围为 1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为 87.41%～117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为 5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在 87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测.结论 成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点.

目的:探讨肾移植前内皮粘蛋白(EMCN)抗体与抗体介导排斥反应(ABMR)以及移植物预后的相关性。方法:选择2021～2022年在山西省第二人民医院进行移植肾穿刺活检诊断为ABMR或高度怀疑为ABMR的受者作为病例组，以2022年行肾移植且移植肾功能稳定的受者作为对照组。最终病例组纳入18例受者，对照组纳入37例受者；另有9例受者移植肾穿刺活检诊断为非ABMR，纳入移植物预后分析。比较两组移植前EMCN抗体水平差异，利用受试者工作特征(ROC)曲线确定移植前EMCN抗体预测术后ABMR的最佳截断值，分析移植前EMCN抗体对移植肾存活和功能恶化的影响，通过单因素和多因素Cox比例风险模型分析ABMR发生的危险因素。结果:病例组和对照组受者移植前EMCN抗体检测校正值分别为(0.87±0.64)和(0.41±0.31)，差异有统计学意义(t＝2.85，P<0.05)。移植前EMCN抗体水平对ABMR发生具有预测作用，ROC曲线下面积为0.7679(95%CI 0.64～0.90，P<0.05)。根据约登指数(0.41)确定截断值为0.4276，敏感度为70.59%，特异度为70.27%。移植前EMCN阳性受者和EMCN阴性受者移植肾存活率无统计学意义差异(P>0.05)，EMCN阳性受者经移植肾穿刺活检确诊或高度怀疑ABMR的比例高于EMCN阴性受者(41.4%和14.3%)，移植肾功能恶化比例亦高于EMCN阴性受者(48.3%和11.4%)(P均<0.05)。肾移植前EMCN抗体水平和HLA-DSA是术后发生ABMR的独立危险因素(HR＝5.50和5.56，95%CI 1.89～16.06和1.08～28.63)，供肾冷缺血时间越短ABMR风险越低(HR＝0.41，95%CI 0.25～0.70)。结论:肾移植前EMCN抗体水平与术后ABMR和移植物功能恶化相关，对ABMR有预测作用，是ABMR发生的独立危险因素。

目的:探讨尿β2-微球蛋白(β2-MG)在原发性膜性肾病(PMN)患者预后评估中的作用。方法:回顾性分析2018年12月至2023年11月在安徽医科大学附属阜阳医院首诊收治的66例PMN患者，根据尿β2-MG水平分为高β2-MG组(尿β2-MG>0.3 mg/L，40例)和低β2-MG组(尿β2-MG≤0.3 mg/L，26例)。收集患者的一般资料、实验室指标和肾穿刺活检病理检查结果。采用Logistic回归方法分析尿β2-MG的相关影响因素，以受试者工作特征曲线分析尿β2-MG对患者预后的评估作用。结果:首诊时，高β2-MG组的平均动脉压、血清肌酐、24 h尿蛋白、抗磷脂酶A2受体抗体、肾间质病变积分均大于低β2-MG组，而eGFR则小于低β2-MG组(P均<0.05)。多因素分析显示，eGFR、24 h尿蛋白、抗磷脂酶A2受体抗体、肾间质病变积分是高尿β2-MG的独立危险因素。相比首诊数据，高β2-MG组末次随访的血清肌酐、24 h尿蛋白及抗磷脂酶A2受体抗体水平均明显升高，eGFR水平则明显降低(P均<0.05)，且各指标与低β2-MG组相比，亦有统计学差异(P均<0.05)。与低β2-MG组相比，高β2-MG组的预后不良率更高(P<0.05)。受试者工作特征曲线分析显示，尿β2-MG最佳截断值为0.303 mg/L时、曲线下面积为0.875，敏感性为93.7%、特异性为76.9%。结论:抗磷脂酶A2受体抗体、eGFR、24 h尿蛋白、肾间质病变积分是高尿β2-MG的独立危险因素，高尿β2-MG患者预后较差。尿β2-MG水平有可能预测PMN患者的病情转归，在免疫抑制疗法中具有参考价值。

免疫介导坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy,IMNM)是一种特发性炎性肌病(Idio-pathic Inflammatory Myopathy,IIM)的重要亚型.IMNM的典型临床表现包括对称性四肢近端肌无力,伴随血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)等肌酶谱的显著升高.此外,部分患者还可能出现皮疹、间质性肺病和心肌受累等骨骼肌外表现.自2003年首次被国际医学界命名以来,IMNM逐渐被研究者和临床医师所认识.IMNM的发病率和患病率在不同地域和种族间可能有所不同,如在美国的小样本调查中,IMNM的发病率为0.83/10万,患病率为1.85/10万;而在欧洲西班牙北部地区,抗HMGCR抗体阳性患者的IMNM发病率为0.6/10万,患病率为3/10万,目前中国尚缺乏相关数据.IMNM的患病风险因素包括易感等位基因如HLA-DRB1*11,以及使用他汀类药物、免疫检查点抑制剂和感染病毒感染等.诊断IMNM需要综合考虑肌肉受累症状、肌炎特异性自身抗体、肌酶谱水平和肌活检病理等检查结果.目前,IMNM的治疗主要基于临床经验,包括使用糖皮质激素和传统免疫抑制剂.对于难治性患者,可能采用利妥昔单抗和静脉注射人免疫球蛋白等治疗方案.针对B细胞及其致病性自身抗体的产生过程,未来的研究可能揭示新的治疗靶点.本文旨在系统介绍IMNM的临床特征、诊断方法及相关辅助检查,并探讨当前的治疗策略,以期为临床医师提供诊治IMNM的参考和借鉴.

目的 制备抗猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)A35R蛋白单克隆抗体并建立其双抗体夹心ELISA检测方法,同时对方法进行验证.方法 原核表达MPXV A35R蛋白并免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术制备抗A35R蛋白单克隆抗体,对单克隆抗体的特异性、结合活性进行鉴定;建立双抗体夹心ELISA检测方法,对该方法的线性范围、检测限、专属性、准确性、精密度进行验证.结果 制备了 7 株抗MPXV A35R单克隆抗体.Western blot鉴定结果显示,7株单克隆抗体均与MPXV A35R蛋白及灭活MPXV发生特异性反应;7株单克隆抗体结合活性为11.35～27.73 ng/mL;抗体经配对筛选后,确定以7G5和2F5为最佳配对抗体,用于建立双抗体夹心ELISA方法.该方法对灭活MPXV抗原最低检测限为1.250×104 TCID50/mL,对MPXV A35R蛋白最低检测限为 1.95 ng/mL,线性范围为 3.91～125.00 ng/mL,线性回归方程为y=1.732 0x-0.920 8,R2=0.984 3;该方法专属性较强且不与其他病毒及蛋白发生交叉反应;准确性验证结果显示,病毒抗原回收率为 96.94%～110.04%;批间CV为 0.26%～8.13%,批内CV为 2.10%～5.48%.结论 成功制备了抗MPXV A35R蛋白单克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测方法.验证结果显示,该方法具有较高的灵敏度、准确度、重复性及专属性,可用于以A35R蛋白为基础的猴痘亚单位疫苗的生产质量控制.

目的 制备靶向抗T细胞免疫球蛋白-ITIM结构域蛋白(T cell immune receptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus re-ceptor-related immunoglobin domain-containing protein,PVRIG)双特异抗体,探究其体外生物学活性.方法 用PVRIG人源化抗体hP1和TIGIT人源化抗体hT1构建KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体,将纯化得到KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳、热稳定性检测和稳定性分析;采用流式细胞术(Fluorescence activated cell sor-ting,FACS)检测双特异性抗体的结合活性;采用生物干涉膜技术(Bio-layer interferometry,BLI)检测双特异性抗体亲和力;用 Jurkat-NFAT-Luc2-PD1-TIGIT-PVRIG 细胞和 293T-OS8-PVRL2-PDL1细胞中检测双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV对于TIGIT/PVRIG靶点的阻断作用;采用CMV recall assay法检测IFN-r在上清液中的浓度.结果 SDS-PAGE凝胶电泳结果显示KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV双特异性抗体纯度＞95％;Tm结果为Tm1:66.34,Tm2:80.95.采用SEC-HPLC对双特异性抗体KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV进行稳定性分析,其纯度均＞90％.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体和PVRIG的人源化抗体hP1与293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.168 70 μg/mL 和 0.038 65 μg/mL,与 293T-cyno-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.037 14 μg/mL 和 0.031 98 μg/mL,与 Human PVRIG Protein,His Tag的亲和力为 1.74E-10M 和 1.69E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体和 TIGIT 的人源化抗体 hT1 与 293T-PVRIG cell line 的 EC50 分别为 0.070 27 μg/mL 和 0.031 21 μg/mL;与293T-cyno-TIGIT cell line 的 EC50 分别为 0.020 28μg/mL 和 0.028 22 μg/mL;与 Human TIGIT Protein,His Tag 的亲和力为 8.50E-10M 和 8.47E-10M.KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 抗体具有阻断 PD1/PDL1/TIGIT/PVRIG 相互作用活性,且 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV 的 EC50为 0.007 μg/mL,优于单独人源化抗体 hT1(EC50为 0.013 μg/mL)和 hP1(EC50为 0.048 μg/mL)的作用.在含 pp65 peptide 条件下 KY-TIGIT-h1gG4M-PVRIG-SCFV 抗体分泌 IFN-r 为 349.72 pg/mL,明显高于其他抗体.结论 KY-TIGIT-hlgG4M-PVRIG-SCFV抗体具有高亲和力和良好的生物学活性,有望开发成为肿瘤免疫治疗的抗体药物.

目的 探讨补体、免疫球蛋白、自身抗体在系统性红斑狼疮辅助诊断中的应用价值.方法 选取2018年至2023年于首都医科大学附属北京天坛医院就诊的SLE患者89例作为SLE组,其他自身免疫性疾病患者84例作为非SLE组,同期健康体检者102例作为对照组,分析3组受试者的一般资料(年龄、性别),检测3组受试者免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、补体C3(C3)以及补体C4(C4),定性检测3组受试者自身抗体,定量检测SLE组和非SLE组抗双链DNA抗体(抗dsDNA).将P<0.05的指标进行ROC曲线分析,并分析其诊断效能.结果 SLE组年龄低于非SLE组、SLE组年龄低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);SLE组男性9例,女性80例,非SLE组男性6例,女性78例,对照组男性68例,女性34例,其中SLE组与对照组、非SLE组与对照组性别有差异,差异有统计学意义(P<0.05).SLE组IgG、IgA高于对照组、SLE组C3、C4低于对照组;非SLE组IgG、IgA、IgM高于对照组、非SLE组C4低于对照组;SLE组IgM、C3、C4低于非SLE组,差异有统计学意义(P<0.05).SLE组nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、PM-SCL、dsDNA、Histone、Rib.P-Prot、AMA-M2、Ro-52、NUC阳性率高于对照组;非SLE组nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、CENPB、dsDNA、Histone、Rib.P-Prot、AMA-M2、Ro-52、NUC阳性率高于对照组;SLE组抗dsDNA高于非SLE组;SLE组nRNP/Sm、Sm、CENPB、Histone、Rib.P-Prot、NUC阳性率高于非SLE组,差异有统计学意义(P<0.05).将IgG、IgA、C3、C4分别进行ROC曲线分析,曲线下的面积AUC分别为0.799、0.629、0.812、0.812,灵敏度分别为78.7％、61.8％、61.8％、65.2％,特异性分别为74.5％、65.7％、91.2％、88.2％.将曲线下的面积AUC>0.8的指标联合检测绘制ROC曲线.C3、C4联合检测曲线下的面积AUC为0.827,灵敏度为74.2％,特异性为83.3％.结论 血清补体、免疫球蛋白、自身抗体对SLE辅助诊断有重要意义,其中C3、C4联合检测在SLE辅助诊断中具有较高的应用价值.

目的 探讨自身免疫性胃炎(autoimmune gastritis,AIG)的临床、病理特点,加强相互联系,提高诊断的时效性和准确性.方法 收集11例AIG患者临床、病理资料,结合文献进行分析.结果 女性8例,男性3例,年龄31～78岁,中位年龄53岁;临床表现为非特异性症状,3例合并幽门螺杆菌感染;萎缩最常见于胃体,其次为胃底;4例贫血症状患者,3例行病理检查,均合并有神经内分泌细胞增生性病变;1例患者出现贫血症状到最终在病理医师指导下确诊为AIG耗时3年.结论 AIG患者不同临床阶段临床症状、内镜及病理学表现不尽相同,容易漏诊;建议对疑有胃底、胃体黏膜萎缩病例常规进行活检,尤其是胃体黏膜活检对AIG的诊断具有重要价值;贫血伴神经内分泌细胞增生性病变及萎缩伴神经内分泌细胞增生性病变高度提示AIG可能.