目的 建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用.方法 选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14 作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25 作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA.分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测.结果 该方法确定的捕获抗体AM14 包被浓度为 1.25 μg/mL,检测抗体D25 浓度为0.50 μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA).方法验证结果显示,线性范围为 1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为 87.41%～117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为 5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在 87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测.结论 成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点.

目的:建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，DAS-ELISA)检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)滴度。方法:以RSV融合前F蛋白的两种抗体AM14与D25作为捕获抗体和检测抗体，通过对其抗体浓度的优化来确定DAS-ELISA较适反应条件，并对该方法的特异性、重复性、灵敏度及适用性进行验证。结果:选择用AM14抗体作为捕获抗体，D25作为检测抗体。捕获抗体AM14较适工作浓度为20 μg/mL，检测抗体D25的稀释比例为1∶3 000。建立的DAS-ELISA与轮状病毒(rotavirus，RV)和人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3，HPIV-3)无交叉反应，且不同稀释倍数的RSV病毒进行批内与批间重复试验的变异系数(coefficient of variation， CV)均<10%；不同亚型的RSV及蛋白进行试验，均能检测到病毒滴度；检测结果与CCID 50比较，可检测的稀释倍数略高。 结论:建立了检测RSV滴度的DAS-ELISA，该方法可为实验室RSV病毒滴度检测提供依据。

目的:探究生物素对免疫检测的干扰及大剂量服用生物素对免疫指标的影响。方法:招募哈尔滨医科大学附属第一医院体检健康的志愿者34名，并将其分为5组：对照组(10例)、低剂量组(6例)、中剂量组(6例)、高剂量组(6例)和超高剂量组(6例)。同期选择本院10例慢性心衰稳定期随访者作为稳定心衰组，采用化学发光法自动化检测平台检测心肌肌钙蛋白I、肌钙蛋白T水平，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA )方法检测生物素水平。结果:与对照组相比，稳定心衰组患者第1日至第5日生物素浓度明显降低，肌钙蛋白I、肌钙蛋白T水平明显升高，差异具有统计学意义( t1d＝11.40、13.33、63.60， t2d＝17.11、6.67、63.42， t3d＝14.10、13.33、64.71， t4d＝16.67、6.67、62.43， t5d＝15.80、13.33、66.05， P值均<0.001)。与用药前相比，服用5 mg生物素后低剂量组、服用10 mg生物素后中剂量组、服用20 mg生物素后高剂量组、服用50 mg生物素超高剂量组肌钙蛋白I、肌钙蛋白T及生物素浓度均明显升高，组间差异均具有统计学意义( F＝148.11、53.08、38.39、147.26、57.47、42.63、152.82、69.26、58.63、152.68、62.57、48.27， P值均<0.001)。 结论:生物素会干扰链霉亲和素捕获目标分析物的能力，从而导致检测结果的假性升高或者降低，影响临床判断。

目的:对1型糖尿病（T1DM）患者含NLR家族CARD域蛋白4（NLRC4）基因外显子及外显子内含子交界区的罕见变异进行鉴定，并探讨其对基因功能的影响。方法:选取2017年8月到2020年9月中南大学湘雅二医院代谢内分泌科508例T1DM患者作为病例组，男264例，女244例，年龄［ M（ Q1， Q3）］为27（11，43）岁。同时选取同期体检科527名健康对照者，男290名，女237名，年龄［ M（ Q1， Q3）］为47（36，60）岁。对T1DM患者和健康对照者的NLRC4基因的外显子区域进行捕获测序，并进行一代测序验证。构建NLRC4基因野生型和突变型质粒，转染293T细胞，采用免疫印迹试验（WB）检测NLRC4蛋白表达量以及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶前体（procaspase-1）切割产物含量。在转染野生型或突变型NLRC4质粒的293T细胞中加入放线菌酮（CHX），检测NLRC4蛋白降解情况。使用免疫荧光检测NLRC4蛋白质的定位。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清白细胞介素（IL）-1β浓度。 结果:测序结果显示，4例患者及2名健康对照者NLRC4基因的3号外显子存在杂合变异c.208C>T；2例患者4号外显子存在杂合变异c.1564T>C，1例患者4号外显子存在c.1219G>C；这3种变异可能为T1DM的致病性变异。NLRC4野生型和c.208>T、c.1564T>C、c.1219G>C突变型质粒转染的293T细胞中，NLRC4蛋白表达水平、降解速率、定位以及procaspase-1的切割产物含量无明显改变；但转染c.1219G>C、c.208C>T突变型质粒的293T细胞分泌的IL-1β浓度［ M（ Q1， Q3）］分别为15.25（12.98，17.52）、15.44（13.81，17.07）ng/L，均低于野生型质粒的18.70（16.59，20.81）ng/L（ P=0.020、0.010）。 结论:NLRC4基因外显子罕见变异c.208C>T、c.1564T>C和c.1219G>C可能不改变蛋白质的表达水平、蛋白质的降解及定位，但c.208C>T和c.1219G>C错义突变可能抑制了炎症因子IL-1β的产生，从而对基因功能产生影响。

目的 优化双抗夹心-酶联免疫吸附法(double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测H因子结合蛋白(factor H-binding protein,fHBP)抗原含量的方法,并将其应用于重组B群脑膜炎球菌疫苗体外相对效力评价.方法 筛选 4 种抗fHBP单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAb)适宜的抗体组合,通过方阵滴定法确定适宜的捕获抗体和酶标检测抗体稀释倍数、包被液、包被条件和显色时间,对优化后方法的专属性、线性、检测限、精密度和准确度进行了验证,并利用该方法检测fHBP蛋白相关制品的抗原含量.结果 确定了适宜的双抗体检测组合以及试验条件(以柠檬酸缓冲液,4℃孵育 16 h),在以柠檬酸缓冲液包被捕获抗体5.000 0 μg/mL、检测抗体 1∶2 000 稀释、显色时间 15 min的条件下,A450 nm-fHBP浓度曲线相关系数(r)>0.98,平行孔CV<10%,检测限<0.000 2 μg/mL,精密度<15%,准确度(直接回收率)<20%.亚家族之间抗原检测无干扰.多批fHBP相关制品检测结果稳定,差异无统计学意义(P>0.05).结论 优化后的方法可用于fHBP抗原含量的检定.

目的 探讨HIV-1重组抗原捕获酶联免疫试验(RAg-CEIA)在哨点监测人群HIV-1新发感染检测中的应用价值.方法 针对云南省2015年艾滋病哨点监测人群,选择HIV-1抗体确证阳性血浆样本中符合新发感染检测标准的样本,使用HIV-1 RAg-CEIA进行检测.通过标准化光密度(ODn)值识别HIV-1新近感染者,再估算人群的HIV-1新发感染率,比较HIV-1 RAg-CEIA与BED捕获酶联免疫试验(BED-CEIA)和限制性抗原亲和力酶联免疫试验(LAg-Avidity EIA)所得的检测和分析数据.结果 纳入研究的哨点监测血浆样本共计51 313份,其中HIV-1抗体阳性1 255份,应进行新发感染检测373份,实检测253份.使用HIV-1 RAg-CEIA、BED-CEIA和LAg-Avidity EIA检出的HIV-1新近感染样本数分别为88、78和54份,估算哨点监测人群新发感染率分别为0.33％(95％CI:0.26％～0.39％)、0.31％(95％CI:0.24％～0.38％)和 0.31％(95％CI:0.22％～0.39％),三者之间两两比较差异无统计学意义(P=0.927).在6类亚人群中,男男性行为者(MSM)的新发感染率可估算,分别为3.50％(95％CI:2.48％～4.52％)、3.92％(95％CI:2.76％～5.08％)和 4.17％(95％CI:2.79％～5.55％),三者之间两两比较差异无统计学意义(P=0.763)o HIV-1 RAg-CEIA与BED-CEIA和LAg-Avidity EIA的样本检测ODn值均呈线性相关(Spearman相关系数分别为0.911、0.755).结论 HIV-1 RAg-CEIA可以有效用于新近感染识别和新发感染率估算,提示该方法在HIV-1新发感染检测中具有良好的应用前景.

目的 通过开展发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)自然疫源地动物宿主感染新布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)的调查研究,明确SFTS自然疫源地SFTSV的传播风险与影响因素,为SFTS的针对性防控提供科学依据.方法 采用卫星定位技术连续跟踪商城县邱湾村、平塘村和龙头桥村3个村庄部分村民家养狗日常活动轨迹2周并采集血清样本,使用间接荧光抗体试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)法检测家养狗血清 SFTSV-IgG 抗体,使用 logistic 回归分析模型分析影响家养狗感染SFTSV的潜在环境影响因素;采用夹(笼)夜法和粘鼠板法对家养狗活动区域内的啮齿动物及小型哺乳动物种群进行密度调查,针对保守基因进行PCR种类鉴定,并采用荧光PCR和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测啮齿动物及小型哺乳动物SFTSV感染情况.结果 通过卫星定位共追踪26条家养狗的日常活动范围信息,采集37条家养狗52份血清,SFTSV-IgG抗体总阳性率为59.46％;共捕获啮齿动物及小型哺乳动物419只,优势种为黄胸鼠、小家鼠、黑线姬鼠,未有SFTSV阳性标本检出;家养狗活动中心离主干道路距离远和到过林地的频次多是感染SFTSV的危险因素,家养狗活动中心离林地距离远是感染SFTSV的保护因素.结论 商城县家养狗SFTSV抗体阳性率较高,感染SFTSV与生态环境相关,建议进一步扩大家养动物的种类,开展SFTSV感染情况的研究;啮齿动物的SFTSV感染率低,在SFTSV自然循环过程中的作用需进一步调查.

目的 调查、证实新疆维吾尔自治区(新疆)阿勒泰山地是否存在鼠疫自然疫源地.方法 2021-2022年在阿勒泰山地(青河县、福海县、阿勒泰市)开展鼠疫疫源性调查,采用鼠疫细菌学、血清学、分子生物学对捕获和捡拾的啮齿类动物脏器、血清、心脏浸液、媒介寄生蚤进行实验室检验检测,鉴定分离鼠疫耶尔森菌株的生化表型.结果 鼠疫细菌学检验阿勒泰山地青河县、福海县和阿勒泰市捕获和捡拾的自毙啮齿动物合计115只,其中长尾黄鼠和灰旱獭为优势种,分别占总数的60.87％和20.87％,宿主寄生蚤9组136只,其中长尾黄鼠和灰旱獭寄生蚤的优势种分别为方形黄鼠蚤阿勒泰亚种和谢氏山蚤,分别占宿主寄生蚤的67.74％和100.00％.血清学检测血清样本86份、小型鼠心脏浸液21份、自毙啮齿动物脏器研磨液8份,荧光定量PCR方法检测自毙啮齿动物脏器组织提取核酸DNA 8份.1份长尾黄鼠血清鼠疫F1抗体阳性[间接血凝试验(IHA)滴度为1∶128,酶联免疫吸附试验(ELISA)滴度为1∶256].1份自毙灰旱獭脏器研磨液鼠疫Fl抗原阳性[反相间接血凝试验(RIHA)滴度为1∶64,ELISA滴度为1∶128].2份自毙长尾黄鼠脏器研磨液鼠疫F1抗原阳性(RIHA滴度分别为1∶512和1∶1 024;ELISA滴度分别为1∶2 048和1∶4 096).2份脏器组织鼠疫特异核酸阳性.分离到鼠疫耶尔森菌2株,生化鉴定为古典型,不具有酵解鼠李糖的特性.结论 新疆阿勒泰山地存在鼠疫自然疫源地,菌株生化鉴定为古典型.

背景与目的 长非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)在各种癌症中发挥至关重要的作用.在本研究中,我们旨在研究肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)中上调以及和生存相关的lncRNA LINC00525的功能和分子机制.方法 采用定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)和原位杂交(in situ hybridization,ISH)测定组织中LINC00525的表达水平.在体内外实验中,采用功能获得和功能丧失的方法研究LINC00525在LUAD中的功能作用.RNA pull-down,RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)、染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)、三联体捕获试验、双荧光素酶检测试验、基因表达芯片和生物信息学等手段用于研究潜在机制.结果 LINC00525在LUAD细胞和组织中高表达.生存分析表明,LINC00525的上调与LUAD患者的不良预后相关.体外敲低LINC00525可抑制细胞增殖和细胞周期进程.在异种移植模型中,LINC00525的敲低抑制了荷瘤小鼠的肿瘤生长和肿瘤发生.其机制为LINC00525通过与p21启动子形成RNA-DNA三联体,引导Zeste增强子多聚梳抑制复合物2亚基(zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit,EZH2)至p21启动子,导致p21启动子的组蛋白3(trimethylation of lysine 27 on histone 3,H3K27me3)Lys27三甲基化增加,从表观遗传水平抑制p21表达.另外,LINC00525还通过与RNA结合基序单链相互作用蛋白2(RNA binding motif single stranded interacting protein 2,RBMS2)竞争性结合,促进p21 mRNA的衰变,从而在转录后水平抑制p21的表达.结论 我们的研究结果表明,LINC00525与EZH2和RBMS2协同降低p21 mRNA的转录和稳定性,从而促进LUAD的进展,表明LINC00525可能是LUAD临床干预的潜在治疗靶点.

目的 比较酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法和抗体捕获法检测肠道病毒71型-IgM(EV71-IgM)抗体的特异性.方法 分别建立ELISA间接法和抗体捕获法,并对EV71阳性血清、阴性血清进行测定,利用已建立的两种方法对CoxA16阳性血清进行检测,比较两种方法的特异性.结果 "间接法"检测CoxA16阳性血样,以灭活的EV71病毒颗粒作为抗原包被,假阳性检测率100%;改换VP1蛋白包被,虽然特异性有所提高,但是仍有50% 假阳性;抗体捕获法检测CoxA16阳性血样,假阳性检测率为0%.结论 针对EV71-IgM抗体的特异检测,抗体捕获法克服了特异IgG的竞争,特异性更好.