目的 本研究旨在建立一种可靠的体外评价体系,用于评估人肝UDP-葡萄糖醛酸转移酶活性及药物对人肝UGTs的抑制作用,并验证该体系的准确性和稳定性.方法 选择了人肝微粒体UGTs酶6种主要亚型的6个探针底物,在优化的温孵条件下通过测定其代谢产物生成反映人肝微粒体UGTs酶的活性,代谢产物浓度测定利用经过确证的液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)进行.同时应用已知抑制剂对所建立的温孵体系进行验证.结果 建立的LC-MS/MS分析方法符合生物分析要求;在本实验温孵体系下,已知的UGT抑制剂均表现出明显的抑制作用.结论 该研究成功建立了一种准确可靠的体外评价体系,该方法可应用于评估药物对UGTs酶的体外抑制作用,该研究可为药物研发和临床合理用药提供重要指导.

目的:观察通督启神电针法的抗抑郁作用，探讨其调控抑郁模型大鼠蛋白激酶C（PKC）/还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化应激途径的作用机制。方法:将32只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、通督启神电针组和艾司西酞普兰组。模型组、通督启神电针组及艾司西酞普兰组采用慢性不可预知的应激建立抑郁模型。开始造模后，通督启神电针组每日施以电针治疗，15 min/次；艾司西酞普兰组灌胃艾司西酞普兰30 mg/kg。实验开始前1天和实验第28天称重，观察体重增长情况，并进行糖水偏好实验及旷场实验。采用Western blot免染总蛋白归一法检测大鼠下丘脑组织蛋白激酶Cα（PKCα）、NADPH氧化酶活化蛋白p47（p47phox）、Ras相关C3肉毒菌素物底物1（RAC1）蛋白表达，应用免疫荧光技术检测NADPH氧化酶2（NOX2）阳性面积比率；使用DCFH-DA荧光探针技术检测活性氧（ROS）含量。结果:与模型组比较，通督启神电针组和艾司西酞普兰组大鼠体重增长量升高（ P<0.01），糖水偏好指数升高（ P<0.01），旷场实验总移动距离和中心区停留时间延长（ P<0.01或 P<0.05）；下丘脑区PKCα、p47phox、RAC1蛋白表达降低（ P<0.05或 P<0.01），NOX2蛋白阳性面积比率降低（ P<0.05），ROS水平降低（ P<0.01）。 结论:通督启神电针法可改善抑郁大鼠行为方式，减少PKC/NADPH途径的氧化应激反应，减少ROS生成，从而减轻氧化应激损伤，缓解抑郁症状。

目的 考察英菲格拉替尼及其活性代谢产物BHS697、CQM157对大鼠肝微粒体中细胞色素P450(CYPs)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)的抑制作用.方法 用体外孵育法,将待测化合物(英菲格拉替尼、BHS697或CQM157)、大鼠肝微粒体分别与 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的特异性探针底物共孵育或分别与UGT1 A1、UGT1 A3、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7的特异性探针底物共孵育,用高效液相色谱-串联质谱法检测相应特征代谢物的生成量,用GraphPad Prism 8.0计算半数抑制浓度(IC50)和抑制常数(Ki).结果 英菲格拉替尼、BHS697和CQM157对大鼠CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 和 UGT1A6、UGT2B7 的抑制较弱,IC50值均大于10 μmol·L-1;对UGT1A1具有中等抑制作用,IC50值分别为2.70、3.17、7.43 μmol·L-1.英菲格拉替尼对大鼠UGT1A9和CQM157对大鼠UGT1A3均具有中等抑制作用,IC50值分别为5.61、9.57 μmol·L-1.可逆性抑制分析发现,英菲格拉替尼、BHS697和CQM157均非竞争性抑制大鼠UGT1A1,Ki值分别为1.83、2.51、5.84 μmol·L-1.结论 英菲格拉替尼对大鼠UGT1A1和UGT1A9具有中等抑制作用,其活性代谢产物BHS697、CQM157对大鼠UGT1A1也具有中等抑制作用.

目的:探讨蝉花菌丝联合海昆肾喜胶囊对糖尿病肾病(DN)肾小管上皮细胞自噬-溶酶体的影响与机制。方法:将24只大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素(STZ)诱导SD大鼠高血糖模型后，随机分为模型组(DN)和治疗组(DN+蝉花菌丝联合海昆肾喜胶囊)，用药24周；另外10只未诱导高血糖大鼠设为对照组。检测各组大鼠肾功能指标，取肾皮质行组织病理学检查，采用Western印迹检测大鼠分离肾小管的胶原蛋白-Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转录因子EB(TFEB)、自噬泡标记蛋白LC3和自噬底物p62表达。将HK-2细胞分为牛血清白蛋白(Co-BSA)组、Co-BSA治疗组、糖基化终末产物-BSA(AGEs-BSA)组及AGEs-BSA-治疗组。Western印迹检测各组细胞p62、TFEB表达；以TFEB质粒转染HK-2细胞，通过RT-PCR检测过表达效率，观察各组HK-2细胞溶酶体红色荧光探针荧光强度，并检测各组细胞组织蛋白酶活性。结果:与对照组大鼠相比，模型组大鼠的血肌酐(Scr)、24 h尿蛋白水平增高、LC3、p62、胶原蛋白-Ⅲ和α-SMA表达明显增多，而肾小球滤过率(GFR)、TFEB表达明显减少。与模型组大鼠相比，治疗组大鼠的Scr、24 h尿蛋白均明显降低，GFR明显升高，LC3、p62、胶原蛋白-Ⅲ和α-SMA表达明显减少，TFEB表达明显增多。在HK-2细胞中，TFEB和p62的表达情况与在大鼠肾组织中相似。与Co-BSA组相比，AGEs-BSA组的探针荧光强度和组织蛋白酶活性明显减弱；过表达TFEB后，AGEs-BSA组的荧光强度和组织蛋白酶活性均明显增强。结论:蝉花菌丝联合海昆肾喜胶囊对糖尿病肾小管上皮细胞可能具有上调TFEB表达、调节自噬-溶酶体通路的作用。

目的 考察谷红注射液对体外及体内细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶的影响.方法 人肝微粒体"Cocktail"探针底物法进行体外酶抑制实验,检测7种探针底物代谢产物的相对生成量,计算半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50),评估谷红注射液(0.05％～10％)对7种CYP450亚酶抑制作用.人原代肝细胞体系进行体外酶诱导实验,分别检测酶活性及其mRNA表达水平,评估谷红注射液对CYP450酶诱导作用.采用整体动物法进行体内酶活性实验,检测7种特异性探针底物血浆药物浓度,评估谷红注射液(0.9、3.6mL/kg)对大鼠7种CYP450亚酶活性的影响.结果 谷红注射液对人肝微粒体 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4 的 IC50 值分别为 1.98％、7.95％、2.85％、5.39％、4.92％、7.76％和3.41％,均大于0.5％(理论临床最大血药浓度值);人原代肝细胞CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4 mRNA表达增加＞2倍,且前两者呈浓度相关性增加,对CYP1A2酶活性高于阳性对照40％.谷红注射液在超临床剂量下使大鼠CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19和CYP3A4酶的体内探针底物茶碱、安非他酮、奥美拉唑和咪达唑仑的总清除率明显增加、系统暴露降低.结论 谷红注射液在临床剂量下对7种CYP450酶无显著抑制作用,但不排除高剂量下对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19和CYP3A4的诱导效应,建议开展使用敏感探针底物的临床试验以进一步确认潜在的药物相互作用.

黑曲霉是有机酸与酶制剂重要的工业生产菌株,具有强大的水解酶系与葡萄糖转运系统,可快速响应胞外碳源变化,摄取环境中葡萄糖供给细胞生长和产物合成.作为重要的碳源底物与关键的信号分子,葡萄糖的摄取吸收直接影响黑曲霉细胞生长与发酵性能.针对目前丝状真菌缺乏简便葡萄糖吸收能力定量表征方法的问题,本文以 2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)作为葡萄糖吸收探针,通过将预培养的黑曲霉孢子与 2-NBDG孵育后,利用荧光显微成像与流式细胞分析,建立了丝状真菌的葡萄糖吸收的定量检测方法.结果发现,2-NBDG 的最佳使用浓度为 150 μmol/L,最佳孵育时间为4 h.进一步利用该定量分析方法,发现低亲和力葡萄糖转运蛋白MstC的过表达使黑曲霉葡萄糖吸收提高 1.44 倍,同时在前期研究的基础上,利用多序列比对分析,设计了MstC的突变体R188K,通过检测发现该点突变可直接导致MstC葡萄糖转运活性的丧失,这表明Arg188 是影响MstC葡萄糖转运能力的关键氨基酸位点.本文葡萄糖摄取定量检测方法的建立及其在MstC功能研究上的应用,不仅加深了丝状真菌葡萄糖吸收的定量认识,也为葡萄糖转运系统的改造优化提供了技术支撑.

目的 考察穗花杉双黄酮对CYP2C8代谢酶活性的影响.方法 构建体外人肝微粒体代谢体系,以紫杉醇为探针底物,考察穗花杉双黄酮对CYP2C8活性的影响.大鼠连续7 d尾静脉注射穗花杉双黄酮3 mg·kg-1,考察紫杉醇在大鼠体内的药动学.采用HPLC-MS/MS法分别测定体外代谢体系中6α-羟基紫杉醇及大鼠血浆中紫杉醇的含量.结果 穗花杉双黄酮在体外对CYP2C8有较强的抑制效应,半数抑制浓度(IC50)=0.2765 μmol·L-1,抑制常数(Ki)=0.034μmol·L-1,抑制类型为混合型抑制.给予3 mg·kg-1穗花杉双黄酮不会通过与CYP2C8的直接相互作用而改变紫杉醇的药动学.结论 穗花杉双黄酮为人肝微粒体中CYP2C8代谢酶的强抑制剂,但在体内对CYP2C8的活性无影响.

目的:探讨光动力纳米载体联合小干扰-脯氨基3-羟化酶家族成员（si-P3H4）精准治疗膀胱肿瘤的疗效。方法:RT-qPCR和Western Blot分别检测转染siRNA后膀胱癌EJ和T24细胞株中的P3H4mRNA和蛋白表达量。CCK8、划痕实验和Transwell小室检测敲低P3H4后对EJ和T24膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。以氨基树脂为底物合成高分子纳米载体CH3-R9-cRGD，将纳米载体药物包裹si-P3H4、光敏剂Ce6转染至膀胱癌细胞（HCV29细胞），检测不同pH及激光照射条件下药物体外释放情况。同时，探索纳米药物与膀胱癌细胞靶向结合内吞机制，检测细胞内活性氧（ROS）水平。将不同分组纳米复合物转染至膀胱癌细胞，CCK8法检测各组细胞活力，体内试验进一步探索不同分组纳米复合物肿瘤抑制能力。结果:RT-qPCR显示EJ组和T24组P3H4mRNA表达量分别降低至对照组的68.4%和57.1%。Western Blot显示EJ组和T24组P3H4蛋白表达较阴性对照组分别下降至20.3%和36.5%。CCK8实验吸光度A值为EJ组相对于对照组96 h：（0.785±0.084） vs （1.358±0.064），t=12.06，P<0.01；T24组相对于对照组96 h：（0.833±0.065） vs （1.346±0.545），t=13.415，P<0.01。划痕实验细胞愈合率：EJ组相对于对照组为（47.8±4.32）% vs （68.60±4.39）%，t=7.545，P<0.01；T24组相对于对照组为（50.40±3.64）% vs （70.61±3.85）%，t=8.521，P<0.01。Transwell细胞穿膜数：EJ组相对于对照组为[（302.71±7.56） vs （130.42±3.95）]个，t=53.40，P<0.01；T24组[（99.56±4.50） vs （35.22±6.28）]个，t=24.974，P<0.01。成像结果显示多肽纳米载体上具有良好的渗透性，可以同时将si-P3H4和Ce6靶向运输至膀胱癌细胞中。CCK8法检测结果显示当纳米复合物CH3-R9-cRGD&Ce6的浓度为50 μg/ml时，激光照射组的细胞活力均低于无激光照射组，且纳米探针+激光+siP3H4组细胞活力最低（F=299.57，P<0.05）。体内试验显示纳米复合物/si-P3H4/激光抑制肿瘤细胞增强效果最为显著。结论:纳米载体可以同时将si-P3H4和Ce6靶向运输至膀胱癌细胞中抑制细胞增殖，实现对膀胱癌的综合治疗。光动力和基因治疗在膀胱肿瘤治疗领域具有互补优势，两者联用可达到协同增强肿瘤治疗的效果，可以将其应用于膀胱尿路上皮癌的治疗。

建立药物对CYP450酶诱导与抑制作用的体外评价方法并进行验证.LC-MS/MS法测定人肝微粒体CYP450酶7种主要亚型的8个底物代谢产物;在优化的温孵条件下,底物法测定人肝微粒体CYP450酶的活性;应用已知抑制剂对所建立的温孵体系进行验证.LC-MS/MS法测定人肝细胞CYP450酶3种主要亚型的底物代谢产物;底物法测定人原代肝细胞CYP450酶的活性,同时收集温孵后的人肝细胞,应用Taqman荧光探针法测定主要亚型mRNA的表达量;应用已知诱导剂对所建立的温孵体系进行验证.建立的LC-MS/MS分析方法符合生物分析要求;已知抑制剂和诱导剂在本实验温孵体系下均表现出明显的抑制作用或诱导作用.建立的实验方法准确、可靠,可用于体外评价药物对CYP450酶的诱导或抑制作用.

目的 采用Cocktail混合探针药物法,探究聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)对大鼠体内Cyp450同工酶活性的影响,为提高临床低生物利用度药物的疗效提供新的途径,也为药物研发领域研制新型制剂选择合适的辅料提供理论依据.方法 选用非那西丁、奥美拉唑、安非他酮和咪达唑仑分别作为大鼠体内4种Cyp450酶(Cyp1a2、Cyp2c11、Cyp2b1、Cyp3a1)的探针药物.SD雄性大鼠连续尾静脉注射吐温80溶液14d,第14日给药30 min后,尾静脉注射混合探针药物后于各时间点取血.采用LC-MS/MS法测定试验组和对照组混合探针药物的血药浓度,用DAS 2.0软件拟合药代动力学参数.结果 吐温80连续尾静脉注射2周后,与空白对照组相比,非那西丁、奥美拉唑、安非他酮的代谢明显减慢,而咪达唑仑的代谢无明显差异.结论 吐温80对大鼠体内Cyp2c11、Cyp2b1、Cyp1a2酶有明显抑制作用,而对大鼠体内Cyp3a1无明显影响.因此,在临床上吐温80与CYP1 A2、CYP2B6、CYP2C19酶相关的底物合用时,应注意给药剂量,防止药物在体内的血药浓度过高从而导致不良反应.