目的:探讨双氢青蒿素(DHA)通过氯离子通道抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖的作用及其机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)法检测DHA抑制LNCaP细胞增殖，并确定其半抑制浓度(IC 50值)：分别配制的浓度梯度为0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000、80.000、160.000 μmol/L DHA溶液，并按实验设计加入含有LNCaP细胞的96孔板中，在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度( A)值；全细胞膜片钳：检测DHA激活LNCaP细胞氯电流以及氯通道抑制剂4，4’-二异硫氰酸基-2，2’-二苯乙烯磺酸二钠(DIDS)和5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)抑制LNCaP细胞氯离子电流。依次用0、±40 mV、±80 mV电脉冲刺激细胞，每个刺激间隔时间为200 ms，每个周期间隔为4 s。开始刺激后的10 ms收集和测量电流。通过将电流归一化到膜电容来确定电流密度。组间比较使用独立样本 t检验。 结果:DHA能够抑制LNCaP细胞增殖，其抑制效果具有时间依赖性，DHA抑制LNCaP细胞增殖的IC 50值随时间延长逐渐降低。在用DHA处理LNCaP细胞24、48、72 h后，其IC 50值分别为(51.34±1.49)、(24.98±2.07)、(22.79±1.38) μmol/L[ n＝3， t＝17.901(24 h比48 h)， t＝24.349(24 h比72 h)， P<0.01]。此外，DHA也能激活LNCaP细胞氯通道产生氯电流，在80 mV电压钳制下，LNCaP细胞的电流密度增加至(48.30±7.52) pA/pF，被激活的电流可被氯通道抑制剂抑制至(6.35±2.47) pA/pF(DIDS)和(9.25±2.09) pA/pF(NPPB)[ n＝3， t＝9.180(DHA比DIDS)， t＝8.666(DHA比NPPB)， P<0.01]。 结论:DHA能够抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖，其抑制效果具有时间依赖性；DHA也能够激活LNCaP细胞氯离子通道产生氯离子电流，且激活的氯电流能够被氯通道抑制剂所抑制。

目的 探究二氢青蒿素对衰老细胞的作用及其机制.方法 利用双氧水诱导小鼠成纤维细胞(NIH3T3)构建应激早衰模型(SIPS),通过衰老特异性标记物SA-β-半乳糖苷酶染色、蛋白质印迹技术进行SIPS鉴定;细胞实验分为对照组(磷酸盐缓冲液+二甲基亚砜)、模型组(双氧水+二甲基亚砜)、药物组(双氧水+二氢青蒿素),采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法、乳酸脱氢酶法、SA-β-半乳糖苷酶染色、细胞内铁含量测定、蛋白质印迹技术、荧光探针染色及流式细胞术检测二氢青蒿素对衰老细胞的影响.结果 CCK-8结果显示,二氢青蒿素作用模型组24 h的半数抑制浓度(IC50)为(8.26±0.66)μmol/L;与对照组相比,模型组存活率降低,且呈剂量依耐性;蛋白质印迹结果显示,与模型组相比,药物组铁蛋白重链(FTH)及谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)蛋白表达水平降低(P＜0.05),细胞内铁、活性氧(ROS)含量增加(P＜0.05).结论 二氢青蒿素可特异性诱导衰老细胞死亡,其机制与铁死亡有关.

目的 探讨二氢青蒿素(DHA)与肌浆/内质网钙ATP酶(SERCA)的结合位点及其通过线粒体途径诱导人结肠癌HCT-116细胞凋亡的作用机制.方法 分别于不同浓度(0,10,20,40μmol/L)DHA环境中培养HCT-116细胞24h后,用Western blotting检测细胞中SERCA2蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖情况;行Hoechst核染色;用JC-1探针检测细胞线粒体膜电位.通过LeDock分子对接方法,预测DHA与SERCA的结合位点.基于生物膜干涉技术,将合成的Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白和非突变蛋白分别与小分子DHA进行结合检测.结果 Western blotting与CCK-8检测结果显示,随着DHA浓度升高,SERCA2蛋白表达水平显著下降,细胞增殖显著降低,并呈剂量相关(P＜0.01).Hoechst核染色显示,DHA诱导了HCT-116细胞核变圆、固缩.JC-1探针检测结果表明,在DHA处理4h内,线粒体膜电位逐渐降低,其后线粒体膜电位则出现明显降低.分子对接预测提示DHA与Thr316形成氢键相互作用,与Ile315则有疏水相互作用.进一步的生物膜干涉技术提示DHA与SERCA2b非突变蛋白结合信号良好,而与Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白结合信号较差.结论 DHA可直接与SERCA2b的Ile315与Thr316位点结合,并通过线粒体途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡.

同时检测黄花蒿Artemisia annua中多个化合物,以对黄花蒿的品质进行多角度评价.建立超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)同时检测黄花蒿中紫穗槐-4,11-二烯、青蒿醛、双氢青蒿酸、青蒿酸、青蒿素B、青蒿烯和青蒿素7个青蒿素类相关化合物的方法,并对黄花蒿不同组织部位(根、茎、叶和侧枝)中这7个化合物含量进行差异比较,检测其在黄花蒿中的累积情况.采集生长盛期4月龄黄花蒿的根、茎、叶和侧枝,检测黄花蒿不同组织部位7个青蒿素类相关化合物的含量.采用UPLC-QQQ-MS/MS的多反应监测(MRM)采集模式,大气压力化学离子源(APCI)正离子模式,色谱柱为Eclipse Plus RRHD C18(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),流动相为含甲酸(0.1％)-甲酸铵(5 mmol·L-1)水溶液(A)和甲醇(B),梯度洗脱(0～8 min,55％～100％B;8～11 min,100％B;平衡 3 min).流速 0.6 mL·min-1,柱温 40 ℃,进样量 5 μL,检测时间 8 min.通过方法学考察,建立了基于UPLC-QQQ-MS/MS同时定量检测青蒿素生物合成途径中7个代表性化合物含量的方法.对黄花蒿根、茎、叶和侧枝的含量比较分析结果表明:黄花蒿中青蒿素含量高于青蒿素B,且青蒿素和双氢青蒿酸在黄花蒿各部位的含量相对较高;7个化合物在各部位的含量存在较大差异,均在叶片中最高,且青蒿烯和青蒿醛在根中未检测到.该研究建立了基于UPLC-QQQ-MS/MS同时检测青蒿素生物合成途径上7个代表性化合物的定量方法,准确、灵敏且高效,可用于黄花蒿中青蒿素类相关化合物的含量测定、新品种选育和中药材质量控制等.

目的 分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征.方法 收集河南省2012-2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Kelch 13螺旋体(PfK13)基因、恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Pfcrt)基因、恶性疟原虫多药物抗性基因1(Pfmdr1)、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(Pfdhps)基因,琼脂糖凝胶电泳后进行双向测序.获得的基因序列通过MEGA7软件与参考基因组进行比较获得突变位点信息,参考基因组来自GenBank的恶性疟原虫3D7野生虫株(GenBank登录号分别为 PF3D7_1343700、PF3D7_0709000、PF3D7_0523000、PF3D7_0417200 和 PF3D7_1324800).使用 SPPS 21.0软件对数据进行统计学分析.结果 2012-2019年,河南省共报告输入性疟疾病例1 522例,其中自赤道几内亚输入病例117例,包括恶性疟病例97例、卵形疟病例16例、间日疟和三日疟病例各1例、恶性疟原虫/三日疟原虫混合感染和恶性疟原虫/卵形疟原虫混合感染病例各1例.测序获得91份恶性疟原虫样品的PfK1 3基因序列,基因突变率为8.8％(8/91);突变样品中共检测出7个非同义突变位点和3个同义突变位点,其中非同义突变位点分别为M476I混合型(混)、A481V混、A564E混、P574L混、A578S、V589I和N609I混,同义突变位点分别为G625G、N664N和C469C.测序获得91份恶性疟原虫样品的Pfcrt基因序列,基因突变率为18.7％(17/91);检测出 3 种Pfcrt 基因型,分别为野生型 C72V73M74N75K76(81.3％,74/91)、突变型 C72V73I74E75T76(12.1％,11/91)和混合型C72V73M/I74N/E75K/T76(6.6％,6/91).测序获得92份恶性疟原虫样品的Pfmdr1基因序列,基因突变率为77.2％(71/92);检测出 3 个突变位点,分别为 N86Y(41.3％,38/92)、Y184F(75.0％,69/92)和 D1246Y(1.1％,1/92),其中 N86Y 突变率从2012年的 68.8％(11/16)下降到 2016年的 11.1％(1/9)(x2=11.58,P＜0.05);检测出5种Pfmdr1基因型,分别为野生型N86Y184D1246(22.8％,21/92),单基因突变型Y86Y184D1246(1.1％,1/92)、N86F184D1246(34.8％,32/92)、N86Y184Y1246(1.1％,1/92)和双重突变型Y86F184D1246(40.2％,37/92).测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhfr基因序列,基因突变率为96.7％(87/90);检测出3个突变位点,分别为N51I(91.1％,82/90)、C59R(93.3％,84/90)和S108N(96.7％,87/90);检测出 5种Pfdhfr基因型,分别为野生型N51C59S108(3.3％,3/90),单基因突变型 N51C59N108(2.2％,2/90),双重突变型 I51C59N108(1.1％,2/90)、N51R59N108(3.3％,3/90)和三重突变型I51R59N108(90.0％,81/90).测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhps基因序列,基因突变率为97.8％(88/90);检测出 6个突变位点,分别为 1431V(8.9％,8/90)、S436A(27.8％,25/90)、A437G(92.2％,83/90)、K540E(3.3％,3/90)、A581G(1.1％,1/90)和 A613S(2.2％,2/90);检测出 8 种Pfdhps基因型,分别为野生型I431S436A437K540A581A613(2.2％,2/90),单基因突变型 I436A436A43(5.6％,5/90)、I431S436G437K540A581A613(66.7％,60/90),双重突变型 I431A436G437K540A581A613(10.0％,9/90)、I431S436G437E540A581A613(3.3％,3/90),三重突变型V431A436G437K540A581A613(8.9％,8/90)、I431A436G437K540G581A613(1.1％,1/90)和 I431A436G437K540A581S613(2.2％,2/90).89份恶性疟原虫样品的Pfdhfr和Pfdhps基因同时测序成功,其中84例(94.4％)同时发生双基因突变,四重突变体I51R59N108-G437占比最高(64.0％,57/89).结论 自赤道几内亚输入的恶性疟原虫样品中检出多个PfKI3基因突变位点,其中M476I和P574L已被证实与青蒿素类药物抗性相关;随着氯喹的停用,与青蒿素配伍药物抗性相关的Pfcrt和Pfmdr1基因突变率呈下降趋势;恶性疟原虫对磺胺多辛-乙胺嘧啶药物抗性水平多为"部分抗性",未检出"超级抗性"样品.

目的:探讨双氢青蒿素(DHA)对小鼠接触性皮炎(CHS)的抑制作用及机制.方法:0.5%2,4-二硝基氟苯(DNFB)涂抹小鼠腹部连续2 d致敏,5 d后用0.25%DNFB涂抹左耳发敏,右耳涂抹丙酮和橄榄油混合液作为对照,于致敏前2 d灌胃给予DHA处理.HE染色观察小鼠皮肤组织病理学变化,免疫组化染色观察小鼠耳部皮肤CD4+T、CD8+T细胞浸润情况,测定脾脏指数.ELISA检测血清IL-6、IFN-γ、IL-10、TGF-β和单核细胞趋化蛋白(MCP)-1变化,Western blot检测皮肤Smad2和Smad3磷酸化水平,流式细胞术检测皮肤和脾脏免疫细胞浸润情况.结果:DHA可显著改善CHS小鼠耳朵肿胀、皮肤红斑及脾脏指数(P<0.05).组织病理学结果显示,DHA处理可明显抑制CHS小鼠皮肤增厚和炎症细胞浸润.流式细胞术结果显示,DHA处理后皮肤和脾脏中浸润的CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞和巨噬细胞显著减少(P<0.05).ELISA结果显示,相对于模型组,DHA处理组血清IL-6、IFN-γ、TGF-β和MCP-1水平明显降低(P<0.05).Western blot结果表明DHA处理显著抑制皮肤Smad2和Smad3磷酸化水平(P<0.05).结论:DHA通过减少免疫细胞浸润和调节TGF-β/Smad信号传导抑制CHS,为治疗CHS提供了新的药物选择和实验依据.

目的:探讨二氢青蒿素对5-氟尿嘧啶治疗胃癌的辅助作用并研究其机制.方法:实验分为对照组、二氢青蒿素组、5-氟尿嘧啶组、5-氟尿嘧啶联合二氢青蒿素组和5-氟尿嘧啶+二氢青蒿素+SIRT1质粒组.MTT法检测胃癌细胞系BGC-823在5-氟尿嘧啶联合二氢青蒿素处理下的细胞活力.Western blot实验检测5-氟尿嘧啶联合二氢青蒿素对BGC-823细胞SIRT1和NADPH氧化酶表达水平,caspase-9和caspase-3活化水平及凋亡信号调节激酶1(ASK1)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白磷酸化水平的影响.流式细胞术检测BGC-823细胞在5-氟尿嘧啶和二氢青蒿素联合处理下的活性氧簇(ROS)生成水平和细胞凋亡率.结果:二氢青蒿素处理能显著抑制BGC-823细胞SIRT1的表达并增加NADPH氧化酶的蛋白水平,明显提高BGC-823细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性,降低5-氟尿嘧啶的半数抑制浓度;转染SIRT1表达质粒后,二氢青蒿素联合5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞的杀伤活性受到显著抑制(P<0.05).二氢青蒿素能明显促进5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞生成ROS的诱导效应和ASK1及JNK的磷酸化(P<0.05).用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或JNK特异性抑制剂SP600125处理后,二氢青蒿素联合5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞的杀伤活性和caspase-9及caspase-3的活化均受到明显抑制(P<0.05).另外,NAC能显著抑制二氢青蒿素联合5-氟尿嘧啶对JNK磷酸化的促进作用,而SP600125却不能影响BGC-823细胞ROS的产生,表明JNK是ROS的下游分子.结论:二氢青蒿素联合5-氟尿嘧啶通过SIRT1/NADPH氧化酶/ROS/JNK通路诱导胃癌细胞发生caspase依赖的凋亡.

目的 观察二氢青蒿素(DHA)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合用药抑制膀胱癌T24细胞增殖并探讨其机制.方法 采用不同浓度(0、12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L)的DHA及加入自噬抑制剂3-MA(5 mmol/L)分别处理膀胱癌T24细胞24、48、72 h后,通过噻唑蓝(MTT)实验分析细胞存活率,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot检测凋亡标记蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3酶原(procaspase-3)、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(t-PARP)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶降解产物(cleaved-PARP)的表达水平.50.0 tμmol/L DHA作用于膀胱癌T24细胞24 h后,丹酰戊二胺(MDC)染色后采用荧光显微镜对自噬进行形态观察,透射电子显微镜观察白噬体超微结构,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1和p62的表达.结果 DHA抑制膀胱癌T24细胞的增殖并诱导其凋亡,作用呈浓度和时间依赖性(12.5 μmol/L的DHA 24、48、72 h抑制率依次是5.79％、6.61％、11.09％;25.0 μmol/L的DHA 24、48、72 h抑制率依次是11.25％、15.32％、21.35％;50.0 μmol/L的DHA 24、48、72 h抑制率依次是27.16％、30.66％、47.58％;100.0μmol/L的DHA 24、48、72 h抑制率依次是41.52％、57.52％、74.29％;12.5 μmol/L的DHA 24、48、72 h死亡率依次是3.66％ 、6.44％ 、9.78％;25.0 μmol/L的DHA 24、48、72 h死亡率依次是7.02％、13.40％、17.55％;50.0 μmol/L的DHA 24、48、72 h死亡率依次是20.53％、26.97％、38.69％;100.0 μ.mol/L的DHA 24、48、72 h死亡率依次是29.82％、39.26％、44.92％),与空白对照组比较差异有统计学意义(P=0.003);与空白对照组、3-MA和DHA单药组比较,自噬抑制剂3-MA和DHA联合用药可增加膀胱癌细胞的凋亡率.荧光显微镜下观察到MDC荧光染色阳性的自噬泡呈点状结构分布在细胞核的胞质内.透射电子显微镜下观察到多个双层膜包裹胞质形成的自噬体.DHA处理膀胱癌T24细胞后,自噬相关蛋白LC3、Beclin-1及凋亡标记蛋白cleaved-PARP的表达量增加,而自噬相关蛋白p62和凋亡标记蛋白procaspase-3、t-PARP表达水平降低;加入自噬抑制剂3-MA后,与对照组比较,cleaved-PARP的表达量增加及procaspase-3、t-PARP表达水平降低这一趋势更加明显.结论 DHA可抑制膀胱癌细胞的增殖并诱导其凋亡及产生自噬现象,且自噬在细胞凋亡过程中对癌细胞起保护性作用.

目的 观察二氢青蒿素对博莱毒素诱导的大鼠肺纤维化的干预作用并探讨可能机制.方法 博莱霉素一次性气管内注射复制大鼠肺纤维化模型,随机分为造模组(BLM组)、地塞米松组(DXM组)、二氢青蒿素组(DHT组).正常对照组(NC组)大鼠气管内注射生理盐水.用药28d后,HE染色及Masson染色分别观察各组大鼠肺泡炎症及纤维化程度,测定肺组织羟脯氨酸含量,Real-time PCR法检测肺组织转化生长因子β-1(TGF-β1) mRNA水平,Western-blot法检测肺组织核因子κb(NF-κb)含量.结果 与BLM组比较,DHT组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度均明显降低(P＜0.01),肺组织羟脯氨酸含量显著减少(P＜0.01),肺组织TGF-β1 mRNA水平明显下降(P＜0.01),NF-κb含量也显著减少(P＜0.01).结论 二氢青蒿素可通过下调NF-κb及TGF-β1表达对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化进程产生抑制作用.

目的 制备还原响应的双氢青蒿素(DHA)前药自组装纳米粒,并对药动学行为进行评价.方法 设计合成以二硫键为连接臂的双氢青蒿素前药,采用分子自组装技术制备DHA前药自组装纳米粒(DSCNs),筛选出较优处方,考察其制剂学性质并对其药动学进行评价.结果 DSCNs粒径均一,外观圆整,包封率、载药量、粒径、PDI和Zeta电位分别为(96.75±0.03)％,(80.62±2.63)％,(128.5±3.0) nm,(0.151±0.044)和(-16.6±0.9)mV.优化后的处方放置12周后仍较较为稳定.体外释放研究中,前药中DHA的释放随着谷胱甘肽(GSH)浓度的增加而增加.药动学研究表明,DSCNs可以显著提高DHA的血液浓度.结论 优化后的制剂能显著提高药物的稳定性及血液循环时间,为青蒿素类药物新型自组装纳米粒的抗肿瘤应用提供试验依据.