目的:原核表达淋病奈瑟球菌MetQ蛋白，采用鼻腔免疫途径初步评估MetQ蛋白的免疫保护效果。方法:利用基因重组技术构建pCold TF-metQ- E.coli BL21表达菌株，并进行MetQ蛋白的表达纯化。将6 ~ 8周龄BALB/c雌性小鼠随机分两组，每组6只，MetQ组：MetQ蛋白+霍乱毒素B亚单位（CTB）佐剂等比例混匀后对小鼠进行鼻腔滴注，10 μg/只；磷酸盐缓冲液（PBS）组：鼻腔滴注等比例、等剂量的PBS + CTB佐剂。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测MetQ组末次免疫后3只小鼠的血清及阴道分泌物中的抗体效价。免疫印迹分析MetQ在不同淋病奈瑟球菌中的表达情况。间接ELISA分析MetQ抗血清与全菌抗原的结合能力。评估MetQ抗血清对淋病奈瑟球菌的杀菌活性以及对ME-180细胞的黏附抑制作用。计量资料以 ± s表示，不同处理组间比较采用 t检验。 结果:成功表达去除信号肽的MetQ蛋白。MetQ组小鼠经鼻腔免疫后血清能检测到特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgA抗体，抗体滴度分别达1 × 10 7、1 × 10 5、2 × 10 4、1 × 10 2，阴道分泌物能检测到特异性IgG、IgA抗体，抗体滴度分别达1 × 10 3和1 × 10 2。免疫印迹结果显示，MetQ蛋白在8株淋病奈瑟球菌中均有表达。间接ELISA结果显示，MetQ抗血清与淋病奈瑟球菌全菌抗原结合能力为20。血清杀菌力实验结果显示，与无血清对照组（100%）相比，MetQ抗血清的有效杀菌滴度可达1∶320（淋病奈瑟球菌存活率：46.33% ± 6.67%， t = 8.05， P = 0.001），MetQ抗血清稀释1∶160、1∶640时，淋病奈瑟球菌存活率分别为22.01% ± 6.80%（ t = 11.47， P <0.001）、84.55% ± 6.99%（ t = 2.21， P > 0.05）。黏附抑制实验结果显示，与无血清对照组（100%）相比，MetQ抗血清稀释1∶20、1∶40、1∶80能抑制淋病奈瑟球菌对ME-180细胞的黏附作用（淋病奈瑟球菌黏附率= 17.25%、28.23%、54.51%， t = 48.44、31.88、7.29，均 P<0.05）。 结论:MetQ蛋白在不同淋病奈瑟球菌中均有表达，经鼻腔免疫小鼠后能在血清及阴道分泌物中检测到高效价的特异性抗体。MetQ抗血清与淋病奈瑟球菌有较好的亲和性，并具有较好的血清杀菌活性及抗体黏附抑制作用，是一种有潜力的淋病奈瑟球菌疫苗候选蛋白。

目的:了解新设计的6组CpG分子在动物体内对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组亚单位疫苗免疫效果的提升作用，以初步筛选出有潜力的新型CpG佐剂。方法:通过序列检索比对，确定人鼠同源的CpG基序，以不同的组合方式设计出6条不同的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）序列，并人工合成相应6种CpG，分别与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用，已上市的佐剂CpG1018作为阳性对照。以间隔2周的方式免疫BALB/c小鼠2次，免疫后每周取眼眶血检测IgG1和IgG2a指标。2针免疫后21 d处死小鼠，取眼球血检测结合抗体抑制率；取脾脏淋巴细胞进行酶联免疫斑点试验检测。结果:初次免疫后14 d，CpG6组小鼠血清IgG2a和IgG1水平分别为3.63±0.27和3.44±1.03，显著高于CpG1018组的2.06±1.30和2.06±0.39。加强免疫后14 d，CpG6组小鼠血清IgG2a水平为6.52±0.21，高于CpG1018组的6.33±0.40。在针对原型株的结合抗体抑制率指标上，初次免疫14 d、加强免疫21 d后，各组间差异存在统计学意义（ F=13.66、12.58、19.38和19.38， P均<0.001）。初次免疫14 d后，稀释10倍血清中CpG6组小鼠血清抑制率为（64.67±20.41）%，高于CpG1018组[（27.84±20.23）%]，差异有统计学意义（ t=2.70, P=0.031）；加强免疫21 d后，稀释1 000倍的血清中CpG6组小鼠血清抑制率针对原型株[（89.71±4.83）%]和Delta株[（79.04±6.32）%]的抑制率水平均显著高于CpG1018组[（70.84±17.20）%和（52.61±14.22）%] ，差异有统计学意义（ t=2.36, P=0.046； t=3.80, P=0.005）。酶联免疫斑点实验结果显示，CpG1018组针对SARS-CoV-2原性株敏感和Delta突变株敏感的特异性IFN-γ分泌细胞数与CpG6组相比，差异均无统计学意义（ t=0.76， P=0.469； t=0.78， P=0.459）；在特异性IL-2分泌细胞数上，两组差异亦无统计学意义（ t=0.70， P=0.503； t=0.90， P=0.395）。 结论:CpG6与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用，能在疫苗初次免疫后更快速地在小鼠体内产生体液免疫应答，且加强免疫后体液免疫和细胞免疫效果均不弱于已上市的CpG1018佐剂。CpG6有望成为潜在的备选佐剂与疫苗联用。

目的:探讨可能影响mRNA疫苗粒径和粒径分布的因素。方法:在不同离子强度缓冲液、pH值、稀释剂类型、稀释度和检测仪器条件下，采用动态光散射法对3批mRNA疫苗的粒径和粒径分布进行检测。结果:稀释剂的离子强度增大时，疫苗的粒径随之增大，粒径分布不发生改变；稀释剂的pH值增加时，疫苗的粒径随之增大，当pH值达到弱碱性时，粒径分布出现明显变化；选择不同溶液作为稀释剂时，mRNA疫苗的粒径均不同，粒径分布无明显变化；疫苗稀释度≤100时，粒径和粒径分布均无明显改变；不同仪器参数下疫苗的粒径和粒径分布差异无统计学意义，但粒径分布略有不同。结论:粒径和粒径分布受稀释剂、稀释度和检测仪器等因素影响，在生产与质控中应予以关注。

目的:评价不同剂量的GⅠ.1/GⅡ.4诺如病毒(norovirus，NoV)病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)疫苗在小鼠体内的体液免疫应答。方法:将GⅠ.1/GⅡ.4诺如病毒疫苗稀释成50、25、8.3和2.8 μg/0.5 ml，形成4个剂量组，同时设氢氧化铝佐剂为对照组。每组免疫10只7周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 ml疫苗或对照，免疫程序为0、21 d免疫。第35天采血，测定血清中GⅠ.1和GⅡ.4型抗体的组织血型抗原(histoblood group antigen，HBGA)阻断效价，采用SPSS23.0软件统计各组间抗体水平的差异。结果:首次免疫后第35天，50、25、8.3 μg/0.5 ml剂量组的GⅠ.1型和GⅡ.4型HBGA阻断抗体均为阳性。50 μg/0.5 ml剂量组的GⅠ.1和GⅡ.4型抗体几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)分别为488(95%CI：249~955)、489(95%CI：302~790)；25 μg/0.5 ml剂量组的GMT分别为278(95%CI：106~728)、738(95%CI：299~1 820)；8.3 μg/0.5 ml剂量组的GMT分别为300(95%CI：158~570)、486(95%CI：222~1 068)。2.8 μg/0.5 ml剂量组的GⅠ.1和GⅡ.4型阻断抗体阳性率分别为40%和70%，GMT分别为23(95%CI：10~51)、85(95%CI：24~304)，对照组抗体均为阴性。50、25、8.3 μg/0.5 ml剂量组的抗体水平与对照组组间差异均有统计学意义(校正 P<0.05)，3个组的GⅠ.1型抗体与2.8 μg/0.5 ml剂量组的组间差异也有统计学意义(校正 P<0.05)，25 μg/0.5 ml剂量组的GⅡ.4型抗体与2.8 μg/0.5 ml剂量组的差异有统计学意义(校正 P<0.05)。 结论:(50~8.3) μg/0.5 ml剂量组的GⅠ.1/GⅡ.4诺如病毒VLP疫苗均可诱导小鼠产生相应的体液免疫应答。

目的 探讨脊髓灰质炎疫苗猴体神经毒力试验毒力返强对神经免疫反应的影响及病理机制.方法 Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)的原液(≥7000 lgCCID50/L)以及10-1稀释各型脊髓灰质炎疫苗采用脑内法进行神经毒力试验,观察脊髓灰质炎的病理变化,并利用免疫组织化学法检测脊髓灰质炎病毒受体CD155以及CD4+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+小胶质细胞的分布.结果 发生脊髓灰质炎的猴体出现脊髓炎症细胞浸润,少量神经元变性,脊髓神经元变性坏死、卫星现象、噬神经细胞现象、血管周围炎症细胞袖套状浸润和胶质细胞增生;主要为CD4+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+小胶质细胞大量浸润在血管袖套和增生的胶质结节中;在发生和未发生脊髓灰质炎的猴体中,CD155分布未见明显差别,均表达在神经元和胶质细胞,而血管内皮细胞未见表达.结论 脊髓灰质炎疫苗毒力返强导致典型病毒性脑脊髓炎.

目的 优化双抗夹心-酶联免疫吸附法(double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测H因子结合蛋白(factor H-binding protein,fHBP)抗原含量的方法,并将其应用于重组B群脑膜炎球菌疫苗体外相对效力评价.方法 筛选 4 种抗fHBP单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAb)适宜的抗体组合,通过方阵滴定法确定适宜的捕获抗体和酶标检测抗体稀释倍数、包被液、包被条件和显色时间,对优化后方法的专属性、线性、检测限、精密度和准确度进行了验证,并利用该方法检测fHBP蛋白相关制品的抗原含量.结果 确定了适宜的双抗体检测组合以及试验条件(以柠檬酸缓冲液,4℃孵育 16 h),在以柠檬酸缓冲液包被捕获抗体5.000 0 μg/mL、检测抗体 1∶2 000 稀释、显色时间 15 min的条件下,A450 nm-fHBP浓度曲线相关系数(r)>0.98,平行孔CV<10%,检测限<0.000 2 μg/mL,精密度<15%,准确度(直接回收率)<20%.亚家族之间抗原检测无干扰.多批fHBP相关制品检测结果稳定,差异无统计学意义(P>0.05).结论 优化后的方法可用于fHBP抗原含量的检定.

目的 制备百日咳毒素(pertussis toxin,PT)兔多克隆抗体(简称多抗),建立定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,并进行验证及应用.方法 采用传统方法,用PT免疫青紫蓝兔制备PT兔多抗.优化ELISA系统反应条件,建立PT双抗体夹心ELISA定量检测方法,并进行特异性、线性、准确性、精密性、灵敏度验证.采用建立的方法对脱毒过程样品及其他百日咳抗原纯化过程样品菌毛蛋白(fimbriae proteins,FIM)原液中PT抗原含量进行检测.结果 PT抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的工作条件为PT兔多抗包被浓度为1 μg/mL,酶标抗体稀释度为1∶8 000.此检测系统能与PT纯化蛋白发生特异性反应,而与百日咳丝状血凝素、白喉类毒素、破伤风类毒素均未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法线性检测范围在25～400ng/mL之间;PT高、中、低浓度回收率分别为103.27％、91.48％、103.52％;酶标板内和板间的变异系数(CV)均小于10％;该方法的灵敏度为20.719 ng/mL,检测下限为41.438 ng/mL.检测5种不同脱毒工艺条件下、不同取样时间点的35批样品,其抗原含量变化均符合脱毒反应变化趋势.结论 成功制备了PT兔多抗,并建立了精密性和准确性良好的定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,可用于组分百白破联合疫苗生产过程中化学脱毒样品的抗原含量检测.

目的 采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定吸附无细胞百(三组分)白破灭活脊髓灰质炎和 b 型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗(以下简称 DTacP-sIPV-Hib)中多糖含量,并对方法进行验证.方法 在 1 ml 样品中加入 0.02 g 柠檬酸钠,振荡混匀后,置于 37℃保温 24 h,4000×g 离心 5 min 收集上清液,稀释后加入 6 mol/L 盐酸,100℃下加热 2 h,冰浴 10 min后加入 0.8 ml 氢氧化钠(1 mol/L)溶液用于终止酸水解.采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法根据检测信号峰面积计算对应水解荚膜多糖(PRP)含量,通过 PRP 占多糖含量干重的 41.3%计算出总的多糖含量.结果 核糖醇参考品浓度在 0.1～1.5 μg/ml 范围内标准曲线 r2>0.99,检测下限可达 10 ng/ml.核糖醇加标回收率均在 95%～105%;对高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法检测多糖的重复性和中间精密度进行验证,相对标准偏差(RSD)均小于 5%,方法专属性和耐用性良好.结论 使用柠檬酸钠作为解吸附剂,与高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法相结合可用于 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib多糖的含量检测,为产品的质量控制和稳定性研究提供参考.

目的 优化氢氧化铝A1(OH)3佐剂与甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原的吸附条件,并评价吸附产物的免疫原性.方法 选取缓冲盐终摩尔浓度(0.01、0.02和0.04 mol/L)、pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、氯化钠(NaCl)终摩尔浓度(0.075、0.13、0.15、0.17、0.45、0.75、1.0 mol/L)、混合方式(稀释后混合、不稀释直接混合)及滴加顺序[HAV原液滴加至Al(OH)3溶液、Al(OH)3溶液滴加至HAV原液]进行单因素筛选.以Al(OH)3吸附率为评价指标,通过正交试验对筛选出的因素进行优化.采用最优及次优组合条件制备的吸附产物经腹腔免疫NIH小鼠(雌雄各半),0.5 mL/只,每组10只,于免疫后28 d,经眼球或心脏采血,分离血清,HAV抗体定性检测试剂盒(ELISA法)检测HAV抗体水平,小鼠血清抗体阳转率评价吸附产物的免疫原性.结果 单因素筛选结果表明,缓冲盐终摩尔浓度、pH、NaCl终摩尔浓度对吸附效果可产生明显影响(F分别为6.582、14.007、8.612,P均＜0.05),混合方式和滴加顺序对吸附效果无影响(t分别为-0.696和1.153,P均＞0.05),确定缓冲盐终摩尔浓度为0.01及0.02 mol/L,pH为5.5～7.0、NaCl终摩尔浓度为0.13-0.17mol/L.正交试验确定影响吸附效果因素依次为:缓冲盐终摩尔浓度＞pH＞NaCl终摩尔浓度,最优组合为:pH 6.3+缓冲盐终摩尔浓度0.01 mol/L+NaCl终摩尔浓度0.15 mol/L,次优组合为:pH 5.8+缓冲盐终摩尔浓度0.02 mol/L+NaCl终摩尔浓度0.17 mol/L.最优及次优组合制备吸附产物免疫小鼠的血清抗体阳转率均为100％.结论 优化条件制备的吸附产物具有良好的免疫原性,本研究为甲肝灭活疫苗研究奠定了基础.

目的:建立并验证荧光灶法(FFA)检测冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度的可行性.方法:采用FFA分别检测冻干鼻喷流感减毒活疫苗H1N1型、H3N2型、B型单一病毒收获液病毒滴度,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性和耐用性.结果:该方法专属性良好;准确度回收率均为80％～115％,病毒滴度的试验内及试验间精密度RSD值均<10％;3个型别样品稀释倍数对数与病毒滴度呈线性关系,相关系数R2均>0.98;不同孵育温度的病毒滴度RSD值均<10％,耐用性良好.结论:建立的FFA具有良好的专属性、准确度、精密度、线性及耐用性,可用于冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度检测.