中国南海与作为海洋生物多样性中心的印太珊瑚大三角区具有一定的环境与生物连通性,其生境多样,为各种生物类群提供了有利的热带和亚热带海洋环境栖息地,具有极其丰富的生物多样性,是中国海洋生物多样性热点地区,也是重要的海洋生物多样性资源宝库.海洋细菌在生态系统循环中发挥重要作用,通过对南海海洋深层水细菌的探测,可以更加清晰地了解西太平洋和印太交汇区的生物多样性.研究基于参加开放项目获得的南海的深海站点水样,采用高通量测序进行了 16S rRNA基因序列测序,分析了南海深海海水细菌群落多样性、菌群构成和多样性特征.该站点南海海洋深层水测定的细菌分属于15门、20纲、24目、86科、140属、150种,表明该区海洋深层水细菌群落丰富.测得优势菌属包括类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、海旋菌属(Thalassospira)、噬甲基菌属(Methylophaga)、拟杆菌属(Bacteroides)、纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)、海洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、海源菌属(Idiomarina)、嗜油菌属(Oleiphilus)、食碱菌属(Alcanivorax),这些属的细菌在生物材料或药物、生物燃料、水处理、降解石油烃等方面均有开发利用的潜力.属内的解淀粉芽孢杆菌(Lentibacillus amyloliquefaciens)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)、三浦半岛盐乳杆菌(Halolactibacillus miurensis)、海迪茨氏菌(Dietzia maris)可以具体鉴定到种,这些深海细菌目前已在产抗生素、生物防治、石油降解、反硝化等方面被开发利用.基于高通量测序显示出采样点南海海洋深层水细菌具有独特菌群特征和多样性,有其极为丰富的生物学开发利用价值.

以白头叶猴粪便为材料分离到一株不形成芽孢、可产黄色色素的细菌,革兰氏染色为阴性,接触酶阳性,经形态学观察和分子生物学鉴定为Sphingobacterium daejeonense NS6-1.NS6-1 不能水解淀粉,但能降解肝素,肝素酶酶活为46.60 U/mL,当添加100 mmol/L的Ca2+为辅助剂时肝素酶活性可达107.29 U/mL.通过K-B纸片琼脂扩散法检测菌株对几种常规药物的敏感性,发现NS6-1对卡那霉素和庆大霉素耐药,对利福平、四环素、多黏菌素B、氧氟沙星、头孢哌酮和万古霉素敏感.基于Illumina Hiseq 4000 平台对NS6-1 进行全基因组序列测定,结果显示其基因组大小为 4381042 bp,GC含量为 37.21%,预测到的蛋白质编码基因数为 3852 个.功能基因注释结果显示,基因组中含 1 个编码肝素酶Ⅱ/Ⅲ基因,1 个氨基糖苷类抗生素耐药功能基因以及 1 个与芳香烃化合物降解相关的邻苯二酚 1,2-双加氧酶基因.利用antiSMASH预测到 6 个次级代谢产物生物合成基因簇,其中,2 个为类胡萝卜素合成基因簇,1 个为高分子表面活性剂emulsan合成基因簇.综上,NS6-1 具有肝素类物质降解能力以及潜在的石油降解能力和类胡萝卜素合成能力.以上结果为该菌的后续研究及实际应用奠定了理论基础.

石油降解菌在各种有害环境因素作用下会进入活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态,从而影响其生长及石油降解率.为了研究有害环境因素对石油降解菌生长及石油降解率的影响,采用分光光度法、荧光染色-激光共聚焦显微镜观测 H2O2 胁迫下苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)JP1 细胞的生长及VBNC状态形成情况.结果表明,不同浓度H2O2 对其生长有一定抑制作用,当培养液中H2O2 浓度为 75.0 mmol/L时,可有效抑制苍白杆菌JP1 生长,处理12h后苍白杆菌JP1 进入VBNC状态.VBNC状态的苍白杆菌JP1 细胞缩小变成球体,周质间隙增大;在适宜条件下,VBNC状态苍白杆菌JP1 能够复苏为可培养状态,添加丙酮酸钠能够促进VBNC状态细菌细胞的复苏.复苏后的苍白杆菌RJP1 具有良好的环境适应性和石油降解能力,为石油污染生物修复的菌种筛选及应用提供了新的策略.

[背景]生物表面活性剂具有毒性低、生物兼容性好和可降解等优点,是化学表面活性剂的优良替代物.目前产生物表面活性剂的微生物多为常温菌,从低温环境中挖掘高产新型生物表面活性剂的生产菌株具有重要的意义.[目的]从南极土壤中筛选产表面活性剂的低温微生物,对其表面活性剂进行纯化和结构解析并评估其性能.[方法]采用排油圈法对分离自南极菲尔德斯半岛土壤样品中的细菌菌株进行筛选,获得一株在菌苔表面产白色固体颗粒的菌株,对菌株进行形态观察和 16S rRNA 基因序列分析以确定该菌株系统发育地位.利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分离产物,并用核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance,NMR)技术对产物的化学结构进行鉴定.采用单因素试验和响应面设计方法对发酵培养基进行优化.此外,对产物的乳化性能及其对柴油的降解能力进行评估.[结果]得到了一株高产生物表面活性剂的耐冷土地杆菌属(Pedobacter)GW9-17,其最优发酵培养基(g/L)组成为:可溶性淀粉18.0、胰蛋白胨 9.0、C3H3NaO34.4、K2HPO43.6、MgSO41.2,pH 7.0±0.2.在此条件下,按 10%(体积分数)接种量、28℃、180 r/min培养 7 d后表面活性剂的浓度可达到(3.0±0.5)g/L.利用HPLC和 NMR 技术发现菌株 GW9-17 表面活性剂主要成分为 flavolipid-9U,9U,表面活性剂粗提物的甲醇-水溶液(体积比 1:1)对液体石蜡油有良好的乳化能力,菌株GW9-17 在柴油含量为 5%时,在 4℃和 28℃条件下对柴油的降解率分别达到 40.1%和 57.3%.[结论]从南极土壤中获得了一株高产低分子量表面活性剂的低温Pedobacter sp.GW9-17,其产物flavolipids具有对烷烃类污染物质增溶分解的潜力,对石油污染的低温生态修复有重要的利用潜能.

[背景]石油被称为"液体黄金",人类的工业生产活动在利用其创造巨大社会价值的同时,也对自然环境造成了严重的污染.微生物修复技术是现阶段治理石油类污染有效的手段之一,具有经济、高效、无二次污染等优点.[目的]从受石油污染的土壤中分离高效降解长链烷烃正二十四烷的菌株,探究其降解特性及在微生物修复中的应用前景.[方法]通过形态学及 16S rRNA基因测序进行菌株鉴定,采用气相色谱法检测菌株对正二十四烷的降解效果,并结合气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析降解中间产物以推测其潜在代谢途径.[结果]筛选到一株可高效降解正二十四烷的菌株 C24MT1,经鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter).该菌株最适降解条件为 30 ℃、pH 9.0、盐度 2 g/L,该条件下生长 7 d对 9 g/L正二十四烷的降解率高达86.63%;与此同时,菌株在强碱性环境(pH 11.0)中生长良好(OD600 为 0.39)并保持较高烷烃降解率(75.38%),对极端环境具备较强的耐受能力;对降解中间产物进行分析,推断菌株代谢长链烷烃正二十四烷的途径可能包括末端氧化及次末端氧化.[结论]不动杆菌C24MT1 具有良好的环境适应能力及烷烃降解能力,在后续微生物菌剂开发和石油类污染土壤的环境修复领域具有巨大的应用前景.本研究可为盐碱地区高浓度石油类污染土壤的修复提供优良菌种,并进一步丰富石油烃类生物降解的菌种资源库.

从石油污染土壤中分离得到1株石油降解菌1217,经细菌形态学、生理生化及16S rDNA序列分析初步鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa).在温度5～65℃,pH 2～10,盐度0～9％的条件下菌株能很好生长,在以正十二烷、正十八烷、苯、甲苯、二甲苯和萘为唯一碳源的培养基中生长良好.在10℃和30℃条件下培养7 d,对原油的降解率分别为21.57％和15.15％.菌株产生的生物表面活性剂可以将表面张力从72.20 mN/m降至35.14 mN/m.利用特异性PCR扩增,在菌株中检测到烷烃单加氧酶、甲苯双加氧酶、联苯双加氧酶、芳香烃双加氧酶和氧化还原酶基因,并成功克隆出烷烃单加氧酶和芳烃双加氧酶基因,同相关基因比对分析,与铜绿假单胞菌PAO1的相应基因相似度分别为99.91％和99.22％.研究表明,菌株在生物修复和石油烃污染环境中具有潜在的应用价值.

以长期被石油污染的沈抚污灌渠底泥为菌源,富集筛选出以芘为唯一碳源能够生长的菌株HXY-5,采用形态学和分子生物学鉴定相结合的方法进行菌株鉴定,运用光电比浊法测定其对芘的降解效果,通过单因素实验和正交实验确定其最佳发酵和培养条件.结果表明:HXY-5菌株为间型假丝酵母(Candida interme-dia);其最适发酵和培养条件为蔗糖20 g,酵母浸粉2 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl20.01 g,KH2PO40.5 g,溶于1000 mL蒸馏水中,初始pH 6.0,培养温度为25 ℃,175 r/min发酵24 h;在初始芘浓度为100 mg/L的液体无机盐培养基中,15 d时,HXY-5菌株对芘的降解率可达63%.结果表明,HXY-5菌株可以对芘环境污染进行修复.

为研究铜绿假单胞菌NY3胞外分泌物PCH对菌体自身及其对烃类降解的作用,对PCH影响烃类降解的效率及机理进行研究.分别以NY3菌降解烃类污染物的无机盐培养基和M9培养基为例,研究PCH含量对NY3菌降解十六烷活性的影响.结果表明,PCH分泌量与对NY3菌生长量及其对十六烷的比降解率呈负相关.将PCH加入到NY3菌降解十六烷体系中,发现少量PCH对NY3菌生长及其十六烷降解效率有促进作用,PCH浓度超过5.2 mg/L时,十六烷降解率及菌体的生长明显被抑制.进一步研究发现,PCH浓度过高会对NY3菌自身造成一定损害,抑制NY3菌烷氧化酶活性,同时增强降解体系中自由基信号强度,从而导致细胞对十六烷降解能力下降,同时使细胞大量死亡.该研究结果表明,使用NY3菌修复石油烃污染物过程中应严格控制PCH分泌量,为NY3菌在石油烃修复的应用提供参考.

目的 研究发酵培养基主要组分的种类和浓度对海洋石油降解菌Acinetobacter sp.Y9生长的影响.方法 采用单因子实验及正交实验对海洋石油降解菌Acinetobacter sp.Y9发酵培养基中的碳源、氮源及磷源进行筛选和优化,并用优化后的发酵培养基在10 L发酵罐中进行Y9菌株的初步发酵培养.结果 经优化,Y9菌株的最适发酵培养基配方为:葡萄糖1％,蛋白胨2％,磷酸盐缓冲溶液(磷酸氢二钠+磷酸二氢钾)0.1 mol/L,氯化钠0.05％,氯化钙0.001％,氯化镁0.019％.在10 L发酵罐中培养12h后,OD600值达8.24.结论 优化后的发酵培养基可用于Y9菌株的中试发酵生产,提高了菌体产量,为大规模发酵生产奠定了基础.

复苏促进因子(Rpf)广泛存在于高G+C含量的革兰氏阳性细菌中,与细菌生长及抵抗不良环境有关,不同细菌Rpf种类和数量有一定差异.红平红球菌(Rhodococc us e rythropolis)KB1分离自石油污染土壤,具有高效石油降解能力和环境适应性.为探索Rpf在红平红球菌KB1适应环境过程中作用,设计了复苏因子基因特异引物,从红平红球菌KB1基因组DNA扩增出4种rpf基因.序列分析发现4种基因分别与藤黄微球菌(Micrococcus luteus)rpf基因,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) rpfB、rpfC及链霉菌(Streptomyces coelicolor) rpfB相似性较高.4个rpf基因编码蛋白都有一个类似Mt细胞复苏促进因子Rpf域,由大约70个氨基酸组成.其中Rpf-1与结核分枝杆菌、链霉菌RpfC相似,只含1个Rpf结构域;Rpf-2与结核分枝杆菌RpfB相似,含有1个Rpf域、1个G5域和2个DUF348;Rpf-3与链霉菌RpfB相似,含有1个Rpf域、G5域和3个DUF348;Rpf-4与藤黄微球菌Rpf相似,含1个Rpf域和1个LysM域.Rpf-2、Rpf-3含信号肽序列,Rpf-1、Rpf-4不含信号肽.