目的:探讨盐酸法舒地尔(fasudil hydrochloride，FH)对蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)大鼠早期脑损伤海马区Rho激酶2(Rho-associated kinase 2，ROCK2)蛋白及铁死亡的影响。方法:36只SPF级Sprague-Dawley大鼠用随机数字表法分为3组：假手术组(Sham组)、蛛网膜下腔出血组(SAH组)、SAH+ROCK2蛋白抑制剂FH组(FH组)，每组12只。颈内动脉刺破法建立SAH大鼠模型，FH组大鼠于造模成功后30 min腹腔注射FH(15 mg/kg)，Sham组与SAH组注射等体积0.9%氯化钠溶液。干预后24 h，采用穿梭箱实验观察大鼠学习记忆能力，比色法检测大鼠海马区脑组织中Fe 2+含量，免疫组化及Western blot检测海马组织中ROCK2蛋白及铁死亡相关蛋白长链脂酰辅酶A合成酶4(long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)的表达水平。采用SPSS 20.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。 结果:(1)穿梭箱实验中3组大鼠的躲避反应次数及躲避反应时间均差异有统计学意义( F＝20.348，22.316，均 P<0.05)，SAH组大鼠躲避反应次数少于Sham组[(17.92±2.94)次，(27.13±3.48)次， P<0.05]，躲避反应时间长于Sham组[(9.15±2.87)s，(3.68±1.09)s， P<0.05]，而FH组反应次数[(21.63±4.11)次]多于SAH组，躲避反应时间[(6.08±1.76)s]短于SAH组(均 P<0.05)。(2)比色法检测结果显示，3组大鼠海马组织Fe 2+含量差异有统计学意义( F＝7.965， P<0.05)，SAH组Fe 2+含量高于Sham组[(0.091±0.032)nmol/mg，( 0.038±0.024)nmol/mg， P<0.05]，FH组Fe 2+含量[(0.065±0.021)nmol/mg]低于SAH组( P<0.05)。(3)免疫组化中3组大鼠海马组织ROCK2、ACSL4、GPX4阳性细胞数差异有统计学意义( F＝7.602，14.171，36.077，均 P<0.05)，SAH组ROCK2及ACSL4阳性细胞[(21.63±4.72)个，(55.13±19.41)个]显著高于Sham组[(11.63±3.62)个，(23.38±3.74)个] (均 P<0.05)，FH组ROCK2及ACSL4阳性细胞数[(15.88±6.64)个，(44.75±8.29)个]均低于SAH组(均 P<0.05)，而SAH组GPX4阳性细胞数[(25.38±6.30)个]显著低于Sham组[(60.25±10.36)个]( P<0.05)，FH组GPX4阳性细胞数[(45.13±7.51)个]高于SAH组( P<0.05)。(4) Western blot结果显示，3组大鼠海马组织ROCK2、ACSL4、GPX4蛋白表达水平均差异有统计学意义( F＝4.812，12.573，10.849，均 P<0.05)，SAH组ROCK2及ACSL4蛋白表达水平均显著高于Sham组(均 P<0.05)，FH组ROCK2及ACSL4蛋白表达水平均低于SAH组(均 P<0.05)，而SAH组GPX4蛋白表达水平显著低于Sham组( P<0.05)，FH组GPX4蛋白表达水平高于SAH组( P<0.05)。 结论:FH可抑制海马区的铁死亡，改善大鼠学习记忆能力，其机制可能与下调ROCK2蛋白有关。

目的:融合穿梭肽和狂犬病单链抗体，优化在大肠杆菌中的表达条件，获得具有中和活性的重组穿梭肽-单链抗体。方法:重新编码SO57抗体序列，在N端融合Arg 12的穿梭肽，构建pET22(b)-rSO57表达载体，在大肠杆菌中重组表达。在菌体生长密度OD 600、诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度条件进行优化，获得较高的表达效果。使用固定化金属螯合层析对重组蛋白进行纯化，测定了重组单链抗体的相对亲和力，通过rSO57/CVS-11混合感染细胞和快速荧光灶抑制实验(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)，验证重组单链抗体的中和作用。 结果:rSO57构建成功，在 BL21(de3)中诱导表达，最优表达条件为菌体密度OD 600在0.8时，使用0.4 mmol/ml的IPTG诱导，16 ℃下诱导24 h，rSO57以可溶形式表达，表达量占到了菌体可溶性蛋白的19.8%。层析纯化后，获得了纯度为84%的重组rSO57。ELISA实验显示，rSO57的相对亲和力系数Ka＝4.3×10 5。当rSO57与CVS-11混合时，随着稀释的增加，细胞的感染率上升，表明重组抗体具有中和狂犬病病毒的能力。使用RFFIT进行测定，50 μg的rSO57相当于2.17IU的狂犬病中和血清。 结论:本实验重组表达了融合穿梭肽的重组单链抗体rSO57，且可以中和狂犬病病毒，以期制备可以用于狂犬病治疗的特异性和靶向性的抗病毒药物载体。

目的 构建一种特异性标记过氧化物酶体的GFP腺病毒载体.方法 设计含过氧化物酶体信号肽的GFP序列,PCR法扩增该序列片段,并将其与腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack连接,然后将连接产物转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中获得重组质粒并测序鉴定.重组质粒经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后,转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞中进行同源重组.重组腺病毒质粒经限制性内切酶Pac Ⅰ酶切线性化后感染293A细胞,进行病毒包装,得到含过氧化物酶体信号肽的Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒.用腺病毒Ad-GFP-Peroxi和不含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP感染培养的大鼠心肌细胞H9C2,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光强弱.将用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染的H9C2细胞分为正常培养组和1％O2浓度培养组,培养24 h后于共聚焦显微镜下观察,并进行荧光信号聚集情况分析.结果 含过氧化物酶体信号肽的GFP腺病毒载体构建成功.与不含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP相比,含过氧化物酶体信号肽的腺病毒Ad-GFP-Peroxi能够特异性显示大鼠心肌细胞H9C2内过氧化物酶体的分布,且缺氧培养的H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象.结论 利用同源重组方法成功构建了过氧化物酶体特异性GFP腺病毒,其对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率,共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况.

目的:比较"标本配穴"和"常规取穴"艾灸对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)伴焦虑模型大鼠心率变异性(HRV)和心肌心房利钠肽(ANP)表达的影响.方法:从50只健康SPF级3月龄雌性SD大鼠中随机选取8只作为空白组,剩余大鼠制备IBS-D伴焦虑模型,将造模成功的24只大鼠随机分为模型组、常规组和标本组,每组8只.常规组予"天枢""足三里""上巨虚"艾灸干预,标本组予"内关""足三里""关元"艾灸干预,每次20 min,每天1次,共干预14 d.分别于干预前后比较各组大鼠体质量、粪便含水率;应用腹壁撤退反射(AWR)实验评价内脏高敏感性,高架十字迷宫和明暗穿箱实验评价焦虑状态.干预后,比较各组大鼠HRV,采用透射电镜观察各组大鼠肠黏膜超微结构,Western blot法及免疫荧光法检测大鼠心肌组织ANP表达.结果:干预前,与空白组比较,模型组、常规组、标本组大鼠体质量、内脏疼痛阈值降低(P<0.05),粪便含水率、AWR评分(扩张压力为40、60、80 mm Hg时,1 mm Hg≈0.133 kPa)升高(P<0.05),开放臂停留时间、进入开放臂次数、总运动路程(高架十字迷宫)及明箱停留时间、明暗箱穿梭次数、总运动路程(明暗穿箱)均减少(P<0.05).干预后,与空白组比较,模型组大鼠体质量、内脏疼痛阈值、RR间期标准差(SDNN)、连续RR间隔均方差的平方根(RMSSD)降低(P<0.05),粪便含水率、AWR评分(扩张压力为40、60、80 mm Hg时)、低频/高频(LF/HF)、ANP表达升高(P<0.05),开放臂停留时间、进入开放臂次数、总运动路程(高架十字迷宫)及明箱停留时间、明暗箱穿梭次数、总运动路程(明暗穿箱)减少(P<0.05);与模型组比较,常规组和标本组大鼠体质量、内脏疼痛阈值、SDNN、RMSSD升高(P<0.05),粪便含水率、AWR评分(扩张压力为60、80 mm Hg时)、LF/HF、ANP表达降低(P<0.05),开放臂停留时间、进入开放臂次数、总运动路程(高架十字迷宫)及明箱停留时间、明暗箱穿梭次数、总运动路程(明暗穿箱)增多(P<0.05);与常规组比较,标本组大鼠体质量、内脏疼痛阈值、SDNN、RMSSD升高(P<0.05),粪便含水率、AWR评分(扩张压力为80 mm Hg时)、LF/HF、ANP表达降低(P<0.05),开放臂停留时间、进入开放臂次数、总运动路程(高架十字迷宫)及明箱停留时间、明暗箱穿梭次数、总运动路程(明暗穿箱)增多(P<0.05).空白组大鼠肠黏膜上皮细胞形态正常;模型组大鼠肠黏膜上皮紧密连接形态破坏,缝隙连接增宽;常规组大鼠肠黏膜上皮紧密连接不完整;标本组大鼠肠黏膜上皮紧密连接较完整.结论:"标本配穴"艾灸较"常规取穴"艾灸能更好地改善IBS-D伴焦虑大鼠症状,其机制可能与缓解焦虑样负性情绪、良性调节HRV、稳固IBS-D肠黏膜屏障、下调心肌ANP表达有关.

目的 探究D-半乳糖诱导小鼠衰老过程中补充二甲双胍对小鼠学习记忆能力的影响及可能机制.方法 将24只雌性ICR小鼠随机分为3组:对照组、衰老组、衰老+二甲双胍组,每组8只,连续给药16周.监测各组小鼠体重及食物摄取量;行为学检测小鼠学习记忆能力;HE染色观察小鼠海马组织结构;比色法检测各组小鼠海马组织中谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平.结果 与衰老组相比,衰老+二甲双胍组小鼠体重降低(P<0.05);Morris水迷宫逃避潜伏期、游泳路程明显减少(P<0.01或P<0.05),目标象限内游泳时间延长(P<0.05),游泳速度加快(P<0.05);穿梭实验中主动回避次数升高(P<0.05);HE染色显示海马齿状回中核皱缩、深染的海马神经元明显减少;海马组织GSH水平显著升高(P<0.05).结论 补充二甲双胍可以明显延缓小鼠衰老过程中学习记忆能力的下降,维持海马神经元正常结构,其机制可能与降低小鼠体重及增强海马组织抗氧化水平有关.

目的 探讨核桃肽(WP)对幼年小鼠学习记忆能力的改善作用及其机制. 方法 选用北京大学医学部实验动物科学部提供的48只初断乳C57BL/6J雄性小鼠,随机分成4组,空白对照组和低(110 mg/kg·bw)、中(220 mg/kg bw)、高(440 mg/kg·bw)3个剂量WP组,每组12只,干预30 d后进行开阔场实验、Morris水迷宫实验、跳台实验和穿梭箱实验,观察小鼠的自主活动能力及情绪反应、空间记忆能力和主动及被动回避能力. 结果 Morris水迷宫结果显示,WP高剂量组小鼠的逃避潜伏期较空白对照组明显缩短,WP中、高剂量组在目标象限停留时间和穿台次数较空白对照组明显增加,差异均有统计学意义.跳台实验24 h测试中,与空白对照组相比,WP低、高剂量组错误次数减少,三个干预组停留潜伏期均增长,5d后测试中,WP中剂量组对电击的记忆消退较慢,差异均有统计学意义.穿梭箱实验中,与空白对照组相比,WP低、中、高干预组小鼠的主动回避次数增多,受到电击次数减少.WP剂量组血清T-SOD及GSH-Px活性高于空白对照组,MDA水平低于空白对照组,差异均有统计学意义. 结论 WP可以增强幼年小鼠学习和空间记忆能力、主动及被动回避能力,也可能具有延缓小鼠学习记忆的衰退的作用,其机制可能与WP的抗氧化性有关.

[背景]沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)的分泌蛋白在Ct与宿主细胞的相互作用、感染发育周期及致病过程中发挥着至关重要的作用.GlgA蛋白是课题组前期研究发现的一种新的Ct分泌蛋白,其表达和分泌的具体机制及作用还不清楚.[目的]寻找调控Ct GlgA蛋白表达和分泌的分子机制,为后续Ct致病机制研究提供实验基础和新思路.[方法]采用SignalP 4.1软件对GlgA蛋白N端进行信号肽预测分析,并用细菌分泌蛋白特异性阻断剂C16和C1化合物分别或同时处理Ct感染的HeLa细胞,观察阻断Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径对GlgA蛋白分泌的影响;经新生霉素处理、噬斑筛选及穿梭质粒转染技术,构建Ct质粒缺失株和缺失互补株,并鉴定质粒编码基因在两种菌株的缺失及表达情况;间接免疫荧光法观察质粒缺失对GlgA表达和分泌的影响.[结果]GlgA蛋白N端无信号肽序列,细菌Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径特异性阻断剂C16和C1化合物不能阻断GlgA的胞浆分泌;Ct质粒缺失株CTD1的质粒编码基因pgp7丢失,且质粒编码蛋白Pgp3及基因组编码蛋白GlgA的表达和分泌现象均消失;Ct缺失互补株CTD1-pGFP::SW2重新获得pgp7基因,并恢复Pgp3蛋白和GlgA的表达和分泌.[结论]初步证实Ct糖原合酶GlgA蛋白的表达和分泌不依赖细菌Ⅱ型和Ⅲ型分泌途径,而且与衣原体质粒密切相关.

白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤,其中急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)约占所有白血病的59％,其发病机理尚不十分清楚,现认为多种因素在多个层面、多个阶段的相互作用导致白血病的发生.NPM1蛋白可以穿梭于胞浆与胞核之间,并主要定位于细胞核内,与多种蛋白结合.NPM1突变在急性髓系白血病中占25～30％,产生的突变的NPM1蛋白因缺乏核定位肽段而滞留于细胞浆,对细胞核的稳定性以及某些癌基因的表达产生负面影响.在含有NPM1基因突变的AML中,约70％的病人同时含有DNA甲基化调节基因的突变(DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2等),并且已知表观遗传学的异常可以直接破坏核稳定性,上调某些白血病相关基因的高表达.NPM1突变基因的白血病细胞具有特殊的基因表达特征,如HOX家族基因、MEIS1基因在突变系统中显著高表达,这些基因不仅是引发白血病的关键调节子,而且是MLL融合蛋白的下游靶点.在携带有MLL融合蛋白的AML中,MLL的融合伴侣可以募集DOT1L,对MLL靶点基因上的H3K79位点进行甲基化,造成这些基因过度活化.同MLL基因的异常相比,NPM1突变保持着相似的转录特点,然而NPM1突变是否能够影响组蛋白H3K79甲基化的变化还不是很清楚.本综述着重探讨NPM1突变与H3K79甲基化的关系,以及H3K79甲基化转移酶DOT1L抑制剂对NPM1突变的AML的作用,从而为白血病发病寻求新的分子机制和治疗策略.

根据信号肽N端电荷数,选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒,首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达.Tat途径信号肽PhoD促进蛋白质分泌的效果最好,胞外酶活力达20.25U/ml,为不添加信号肽的2.2倍,信号肽N端较多的电荷数,可能有利于多聚体蛋白的分泌.对表达产物进行纯化和酶学性质测定.结果表明,纯酶比酶活为 13U/mg;L-Leucine 为底物时酶的 Km为 6. 17mmol/L,Vmax为 14. 49μmol/(L·min);底物特异性研究发现,酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好,对一些脂肪族氨基酸也有活性,对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性;酶的最适pH为10.5～12.0,pH稳定范围为5.0～11.0;最适反应温度为55℃;圆二色谱变温扫描酶二级结构变化,α螺旋含量随温度升高逐渐降低;差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度(Tm值)为64.13℃,表明该酶具有较好耐热性.

目的 观察五味子粉对D-半乳糖所致小鼠衰老模型的影响.方法 72只昆明种小鼠随机分为对照组、模型组、脑康灵(0.810 g/kg)组和五味子粉高、中、低剂量(3.00、1.50、0.75 g/kg)组.小鼠颈背部sc 1.25 g/kg D-半乳糖制备衰老模型,连续40 d,于第11天开始ig给予相应剂量的药物,连续给药30d.于第39天进行小鼠行为学避暗实验;末次给药后2h,检测小鼠脑匀浆、肝匀浆及血浆中丙二醛(MDA)水平,全血中过氧化物酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及还原型谷胱甘肽(GSH)水平;光镜下观察各组小鼠脑、肝脏、胸腺、脾脏的形态变化.结果 与模型组比较,各剂量五味子粉均可延长小鼠避暗潜伏期,减少小鼠明暗穿梭次数;不同程度降低小鼠脑匀浆、肝匀浆及血浆中MDA水平,升高全血中CAT、SOD活性及GSH水平;不同程度升高小鼠脾脏、胸腺和脑指数,降低肝脏指数.结论 五味子粉可显著改善衰老模型小鼠的各项生化指标和组织病理状态.