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68Ga-DOTATATE注射液放化纯与体内显像效果关系的研究
编辑人员丨5天前
目的:探讨 68Ga-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)- D-苯丙氨酸1-酪氨酸3-苏氨酸8-奥曲肽(TATE)注射液放化纯与体内显像效果的关系。 方法:采用高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)法测定 68Ga-DOTATATE、 68Ga 3+、 68Ga胶体及 68Ga-DOTA- D-苯丙氨酸1-酪氨酸3-苏氨酸8-去苏氨酸-奥曲肽(heptapeptide),考察标记前体DOTATATE的纯度对标记产物放化纯的影响。建立大鼠胰腺外分泌腺肿瘤细胞AR42J荷瘤裸鼠模型,行microPET显像,考察不同放化纯 68Ga-DOTATATE注射液的摄取情况,计算肿瘤组织的靶/非靶(T/NT)比值。采用单因素方差分析和Pearson相关分析数据。 结果:68Ga 3+和 68Ga胶体的含量与标记前体DOTATATE的纯度无明显相关性( r值:0.385、0.497, P值:0.306、0.137), 68Ga-DOTA-heptapeptide的含量与标记前体中DOTA-heptapeptide的纯度呈正相关( r=0.957, P<0.001)。纯度分别为90.9%、91.6%、99.2%的DOTATATE,其标记产物 68Ga-DOTATATE注射液的放化纯分别为(87.0±2.3)%、(86.8±0.8)%、(94.0±3.1)%。MicroPET显像示,将放化纯为95.7%、85.8%、84.5%和79.9%的 68Ga-DOTATATE注射液分别注入荷瘤裸鼠体内,肿瘤组织的摄取与放化纯呈正相关( r=0.828, P<0.001),其T/NT比值分别为21.25±8.84、8.50±1.51、11.38±1.65和6.01±0.99 ( F=11.48, P=0.001)。 结论:68Ga-DOTATATE注射液的放化纯受标记前体纯度及制备工艺的影响,其放化纯与体内显像效果有一定关系。
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编辑人员丨5天前
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18F-阿法肽的自动化制备及其前列腺癌PET/CT显像
编辑人员丨5天前
目的:探讨基于CFN-100氟多功能模块自动化制备 18F-阿法肽(Alfatide Ⅱ)的方法并进行前列腺癌显像。 方法:通过氟离子分装器分出200~500 μl氟离子至反应管中,与标记前体1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸-E[(聚乙二醇)] 4-环(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸- D-苯丙氨酸-酪氨酸)] 2{NOTA-E[PEG 4-c(RGDfk)] 2}(冻干药盒)反应,在水相中与 18F经铝介导螯合标记,再经C18柱分离纯化,自动化制备得到 18F-阿法肽,测定其放化产率。对 18F-阿法肽注射液进行质量分析,并对2例前列腺癌患者(72岁和66岁)行 18F-阿法肽PET/CT显像。 结果:采用结合双管路氟离子分装器的CFN-100氟多功能模块成功自动化制备 18F-阿法肽,合成时间约30 min,放化产率为(28±3)% (非衰变校正, n=6),放化纯>98%,比活度为2.8×10 7 MBq/mmol,核素纯度大于99%。2例患者PET/CT显像示 18F-阿法肽高度浓聚于前列腺癌病灶,最大标准摄取值(SUV max)分别为35.6和5.0。 结论:利用改进的CFN-100氟多功能模块成功自动化制备 18F-阿法肽,产物合成方法稳定,合成时间短,放化产率高,可高度浓聚于前列腺癌病灶。
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编辑人员丨5天前
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CD137信号调控巨噬细胞M1/M2极性转变促进血管新生
编辑人员丨5天前
目的:探讨CD137-CD137L信号(简称CD137信号)是否通过调控巨噬细胞M1/M2极性转变促进血管新生。方法:将3%巯基乙酸盐肉汤诱导的小鼠腹腔原代巨噬细胞分3组,即对照组、CD137信号激动组和CD137信号抑制组,通过检测M1和M2型巨噬细胞的相关特异性标志物观察巨噬细胞表型的变化,采用流式细胞术(FCM)检测巨噬细胞表面CD137、CD86及CD206的表达,Western blot和RT-PCR检测巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、Ⅰ型精氨酸酶(Arg-1)的蛋白和mRNA表达。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测巨噬细胞培养上清中白细胞介素(IL)-12和IL-10分泌水平。将巨噬细胞和内皮细胞(bEnd.3)共培养,上室种植巨噬细胞,下室基质胶种植内皮细胞,实验分为3组,即对照组、CD137信号激动组和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)抑制组,检测各组内皮细胞的管腔形成能力。结果:(1)分离的小鼠腹腔原代巨噬细胞纯度为(97.93±1.31)%,巨噬细胞表面CD137表达为(97.40±2.70)%。(2)与对照组比较,CD137信号激动组Arg-1 mRNA和蛋白表达水平较高( P<0.05),iNOS mRNA和蛋白表达水平较低( P<0.05);与CD137信号激动组比较,CD137信号抑制组Arg-1 mRNA和蛋白表达水平较低( P<0.05),iNOS mRNA和蛋白表达水平较高( P<0.05)。流式细胞术显示,CD137信号激动组CD206平均荧光强度高于对照组( P<0.05),而CD86平均荧光强度低于对照组( P<0.01);CD137信号抑制组CD206表达明显低于CD137信号激动组( P<0.05),CD86表达高于CD137信号激动组( P<0.01)。ELISA显示,CD137信号激动组IL-10分泌高于对照组( P<0.01),IL-12分泌明显低于对照组( P<0.01);而与CD137信号激动组比较,CD137信号抑制组IL-10分泌较低( P<0.05),IL-12分泌较高( P<0.05)。(3)内皮管腔形成实验显示,CD137信号激动组内皮细胞小管长度大于对照组,分支数量多于对照组( P<0.05);PPAR-γ抑制组的内皮细胞小管长度及分支数量的形成明显被抑制( P<0.05)。 结论:CD137信号可能通过调控巨噬细胞M1/M2极性转变促进血管新生。
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编辑人员丨5天前
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重组人tau441 (P301S)蛋白表达纯化及生物学特性分析
编辑人员丨5天前
目的:初步了解重组人tau441 (P301S)蛋白体外聚集、抗原性及免疫原性等生物学性质。方法:原核表达带His标签的tau441 (P301S)重组质粒,镍亲和层析纯化重组蛋白,BCA测定蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色确定蛋白的纯度;采用Western blot (WB)和负染透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)鉴定;间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测所得蛋白的抗原性;以重组蛋白免疫小鼠,检测免疫血清特异性抗体滴度来分析其免疫原性。结果:所得重组人tau441 (P301S)纯度为70%,WB显示在相对分子质量(Mr.×10 3)64和更高相对分子质量处有特异性条带。TEM显示,tau441 (P301S)呈絮状团块聚集,团状面积显著大于tau441野生型蛋白(t=6.439, P=0.003);4 ℃孵育9 d后,tau441 (P301S)形成明显的纤维状结构。间接ELISA结果显示,tau441 (P301S)能被tau单抗HT7(1∶80 000)识别;小鼠免疫血清tau特异性抗体滴度达到1∶128 000,且WB显示,免疫后血清识别阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)转基因小鼠脑裂解抽提物。 结论:重组人tau441 (P301S)蛋白具有体外聚集性增强的特性但其抗原性和免疫原性未改变。
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编辑人员丨5天前
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重组人Ⅲ型胶原蛋白的表达纯化及性能研究
编辑人员丨5天前
目的:表达和纯化重组人Ⅲ型胶原蛋白(rhCol),并评价其性能。方法:构建重组基因工程菌pET30a(+)-1880/pACYCDuet-hy726/BL21(DE3),稳定共表达rhCol和脯氨酰羟化酶。通过大肠杆菌高密度发酵与盐析和柱层析蛋白纯化技术制备并纯化rhCol。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定rhCol的纯度,全自动蛋白质多肽测序仪测定rhCol的N端氨基酸序列,紫外分光光度法测定rhCol中的羟脯氨酸含量,噻唑蓝法评价rhCol的细胞相容性。结果:高密度发酵最终菌体湿重约200 g/L,表达量约3 g/L,通过亲和层析获得的rhCol的纯度大于95%。rhCol的羟脯氨酸含量为11.44%,其水溶性及细胞相容性良好。结论:本研究制备的rhCol可作为一种优良的生物材料广泛用于皮肤护理及生物医药等领域。
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编辑人员丨5天前
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不同实验条件对淋病奈瑟球菌体外转化效率的影响
编辑人员丨5天前
目的:探讨不同实验条件对淋病奈瑟球菌(淋球菌)体外转化效率的影响。方法:以淋球菌D株DNA为模板扩增penA基因,采用重叠延伸PCR制备penA A501V(耐药突变)基因,购买淋球菌penA H041基因(耐药阳性对照)。制备含penA/penA A501V/penA H041基因的质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用蓝白筛选培养基克隆扩增;分别采用日本TaKaRa公司质粒提取试剂盒和天根生化科技(北京)有限公司高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。以penA质粒、penA A501V质粒、penA H041质粒、penA A501V基因、penA H041基因为底物采用直接孵育法转化淋球菌受体菌株A43、A49,测定转化率(CFU/μg)及头孢曲松(CRO)的最小抑菌浓度(MIC)。以penA A501V、penA H041基因为底物,采用脂质体法转化受体菌株A43、A49,观察转化效率及头孢曲松的MIC。 结果:以D株淋球菌DNA为模板,成功获得1 749 bp的penA及penA A501V基因。提取质粒并电泳后,TaKaRa试剂盒提取的含淋球菌penA、penA A501V、penA H041基因的质粒主要集中在2 500 bp处,迁移速度较快;天根试剂盒提取的质粒主要集中在5 000 bp处,迁移速度较慢。直接孵育法转化时,含野生型penA的A43株的MIC为0.001 μg/ml,转入penA质粒后MIC上升至0.002 μg/ml,转入penA A501V质粒和penA A501V基因转化株MIC均为0.004 μg/ml,转入阳性对照penA H041质粒和penA H041基因后MIC均升至0.512 μg/ml;各底物孵育后CRO对A49株的MIC值与空白对照相同,均为0.016 μg/ml。脂质体法转化时,含野生型penA的A43株对CRO的MIC是0.002 μg/ml,A49株MIC为0.016 μg/ml;penA A501V基因转化A43株后MIC升至0.004 μg/ml,转化A49株后仍为0.016 μg/ml;阳性对照penA H041基因转化A43和A49株后MIC均升至0.250 μg/ml,较空白对照分别升高至125倍和15.6倍。 结论:选择质粒为底物采用直接孵育法对A43株淋球菌有较好转化效率,不同质粒提取方法可能影响转化效率,对于直接孵育法转化效率不高的A49株可采用脂质体法。
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编辑人员丨5天前
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猪囊尾蚴排泄分泌抗原LRRC15蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
编辑人员丨5天前
目的:构建猪带绦虫重组质粒pET30a-富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域15(LRRC15),原核表达纯化的LRRC15重组蛋白,制备兔多克隆抗体。方法:采用全基因合成方法,获得猪带绦虫LRRC15蛋白编码基因;将其克隆至pET30a载体,构建重组质粒pET30a-LRRC15,并进行双酶切PCR鉴定;将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达LRRC15重组蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定表达产物;用Ni-IDA亲和层析柱纯化LRRC15重组蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定;蛋白质印迹法(Western blot,WB)鉴定纯化重组蛋白特异性;用纯化的LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔,制备LRRC15多克隆抗体,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定纯化多克隆抗体的效价。结果:经PCR鉴定,扩增出长度为1 506 bp的条带,与LRRC15基因相符;经SDS-PAGE和WB鉴定,获得相对分子质量( Mr)约为55.36 × 10 3的LRRC15目的蛋白;用LRRC15重组蛋白免疫新西兰兔,获得LRRC15多克隆抗体,其效价为1∶1 587 200。 结论:成功构建重组质粒pET30a-LRRC15,制备出猪带绦虫LRRC15重组蛋白,并获得了高纯度、高效价的LRRC15重组蛋白兔抗多克隆抗体。
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编辑人员丨5天前
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汉城病毒L99株双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立及应用
编辑人员丨5天前
目的:建立汉城病毒(Seoul virus, SEOV)L99株特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法,验证其检测性能,为双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)疫苗研制、生产和检定过程中Ⅱ型病毒抗原含量检测提供有效手段。方法:小鼠体内诱生法制备L99病毒单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)腹水,Protein-A亲和层析纯化腹水抗体,SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度,间接ELISA法测定McAb效价,Western blot鉴定其特异性;叠加ELISA法对4株McAb进行抗体配对。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记单抗后,通过正交试验优化包被和标记抗体使用浓度,建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以Ⅱ型HFRS疫苗标准品作为定量标准,验证方法的检测限、线性范围、专属性、准确性、精密度;通过检测3批Ⅱ型病毒疫苗灭活原液验证方法适用性。结果:4株McAb腹水效价均>1∶10 6,抗体纯度均>98%;经Western blot鉴定,1D5、3A4、5B7特异识别Ⅱ型L99株出血热病毒核衣壳蛋白,2E3与Ⅰ型PS-6株出血热病毒存在交叉反应;经抗体配对筛选后,选择3A4为包被抗体,1D5为标记抗体;棋盘滴定法确定包被抗体工作浓度为20 μg/ml,HRP标记抗体工作浓度为1∶4 000。该方法对SEOV L99抗原最低检测限为0.078 1 μg/ml;线性范围为0.078 1~2.500 0 μg/ml, R2>0.99;专属性验证其对Ⅱ型HFRS疫苗具有检测特异性;抗原回收率在95.8%~108.7%之间,精密度验证变异系数<10%。用该方法检测3批Ⅱ型HFRS灭活疫苗原液结果均呈剂量依赖性。 结论:成功建立了SEOV L99株型特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法,为地鼠肾双价肾综合征出血热疫苗生产及检定过程中,SEOV L99株病毒抗原含量测定提供了检测方法。
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编辑人员丨5天前
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131I标记PD-L1抗体在人乳腺癌荷瘤小鼠模型中分子成像的研究
编辑人员丨5天前
目的:探讨放射性核素 131I标记的程序性死亡受体配体1单克隆抗体(PD-L1 McAb)的物理性质及其在人乳腺癌荷瘤小鼠模型中进行分子成像的可行性。 方法:采用氯胺T法以放射性核素 131I标记PD-L1 McAb,采用纸层析法测定 131I标记PD-L1 McAb的标记率,并计算放射性比活度;标记产物 131I-PD-L1 McAb采用葡聚糖凝胶G-25层析柱分离纯化,采用纸层析法测定 131I-PD-L1 McAb的放射性化学纯度,以及 131I-PD-L1 McAb在生理盐水和健康成人血浆中的稳定性。培养人乳腺癌PD-L1阳性细胞株MDA-MB-231细胞,随机分为总结合实验(TB)组和非特异性结合实验(NSB)组,每组又分为6个亚组,各亚组在PH 7.4的磷酸盐缓冲液中分别加入不同体积的 131I-PD-L1 McAb溶液和PD-L1 McAb溶液,配制总量500 μL,使用GC-300型免疫γ-计数器测量各组细胞中 131I-PD-L1 McAb的每分钟计数(cpm)值。根据TB组与NSB组各亚组之间cpm值的差值,使用Scatchard作图分析方法计算 131I-PD-L1 McAb的平衡解离常数KD值,评估 131I-PD-L1 McAb与MDA-MB-231细胞亲和力。取裸鼠3只,于右前肢前臂皮下接种MDA-MB-231细胞悬液制备人乳腺癌荷瘤小鼠模型,观察接种部位成瘤情况并计算肿瘤体积。裸鼠肿瘤接种后第15天按200 MBq/kg尾静脉注射 131I-PD-L1 McAb溶液,分别于注射后5 min、30 min、60 min、24 h、48 h、72 h使用小动物活体成像仪进行放射性核素成像检查,观察 131I-PD-L1 McAb在荷瘤鼠体内浓聚情况;在小动物活体成像检查图像上选择肿瘤部位、对侧前肢相应部位为感兴趣区,计算相应的放射性计数靶(T)值和放射性计数非靶(NT)值,比较不同时间点肿瘤部位与非肿瘤部位的放射性活度比值(T/NT)的变化情况。 结果:131I标记PD-L1 McAb的标记率为80.10%~82.20%(81.07%±1.06%),标记产物 131I-PD-L1 McAb的放射性比活度为(2.78±0.23)MBq/μg,放射性化学纯度为99.10%~99.60%(99.37%±0.25%)。 131I-PD-L1 McAb在生理盐水与人新鲜血浆溶液中6 h内放射性化学纯度均大于80%。 131I-PD-L1 McAb与MDA-MB-231细胞KD值为60~64(62±2)nmol/L。3只裸鼠均成功建立乳腺癌荷瘤小鼠模型,接种乳腺癌MDA-MB-231细胞后第6天触及肿块,第15天测量肿瘤体积为0.92~1.12(1.00±0.11)cm 3。尾静脉注射 131I-PD-L1 McAb后,不同时间点小动物活体放射性核素成像显示, 131I-PD-L1 McAb早期主要在荷瘤鼠腹部浓聚,24 h时荷瘤鼠右前肢肿瘤部位开始显影,48 h时肿瘤显影最为清晰,72 h时肿瘤部位显影开始模糊。不同时间点放射性计数T/NT值随着注射时间的延长逐渐增加,48 h时T/NT值最大(6.66±1.10),72 h时开始下降,不同时间点T/NT值比较,差异有统计学意义( F=38.04, P=0.011)。 结论:放射性核素 131I标记PD-L1 McAb,具有较高的标记率。标记产物 131I-PD-L1 McAb具有较高的放射性化学纯度及适宜的放射性比活度,在体外有良好的稳定性,且与MDA-MB-231细胞亲和力较高,可用于人乳腺癌荷瘤小鼠模型的分子成像研究。
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编辑人员丨5天前
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GII.6型诺如病毒P蛋白原核表达及多克隆抗体制备
编辑人员丨5天前
目的:原核表达GII.6型诺如病毒(norovirus, NoV)P蛋白和制备多克隆抗体。方法:扩增NoV GII.6型P区基因并克隆至pET28a载体,转化感受态 E. coli BL21(DE3),IPTG诱导进行原核表达。使用Ni-NTA亲和柱层析进行纯化,重组蛋白进行寡糖结合分析,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,western blot (WB)检测抗体的特异性,并进行有效性评估。 结果:成功构建了原核表达载体GII.6P-pET28a并表达相对分子质量约40×10 3的GII.6型P蛋白;Ni柱亲和层析纯化后纯度达90%以上;寡糖结合显示GII.6型P蛋白与B、le b、H2型结合,与A、H1、le a型不结合;ELISA测得抗体的效价为1∶160 000;WB显示抗体具有较高特异性;交叉实验未显示出对GII.4的亲和力。 结论:成功表达了GII.6型P蛋白并获得高效价的抗体,为GII.6的检测和疫苗研发提供有效工具。
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编辑人员丨5天前
