目的:通过筛选能成功诱导人牙髓细胞（human dental pulp cell，HDPC）向成牙本质细胞样细胞分化的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的有效浓度，探讨体内诱导HDPC进行牙本质再生的ATP适宜浓度。方法:用0（对照组）、10、400、600、800 μmol/L ATP处理HDPC后，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）和蛋白质印迹法分别检测HDPC增殖以及成牙本质分化相关基因和蛋白[牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）]的表达；用茜素红染色评估诱导21 d后矿化结节情况（各组样本量均为5），并溶解矿化结节后定量分析各组溶液吸光度值（ A值）。筛选既能有效诱导HDPC成牙本质向分化，又能降低ATP对HDPC增殖抑制作用的浓度作为ATP的适宜浓度，并选用此浓度进行动物体内实验。HDPC经此浓度ATP预处理7 d后接种于明胶海绵上，并置入6~7 mm长、管径1.0~2.5 mm的人牙根管片段内（ATP处理组，样本量为8）；非ATP处理组的明胶海绵接种未经ATP预处理的HDPC（样本量为8），空白对照组的明胶海绵未接种细胞（样本量为2）。各组根管片段移植于免疫缺陷鼠（9只）背部双侧皮下，3个月后取材进行HE染色和组织学观察。 结果:培养5 d时与对照组相比，10 μmol/L ATP组HDPC增殖显著增加（ P<0.05），而600和800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著减小（ P<0.05），且800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著小于600 μmol/L ATP组（ P<0.05）。与对照组相比，600和800 μmol/L ATP组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均显著上调（ P<0.05），且两组间差异无统计学意义（ P>0.05），而其他各组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均无显著上调（ P>0.05）。诱导21 d后600和800 μmol/L ATP组均可见明显的矿化结节，其他组均未见矿化结节；定量分析显示0、10、400、600、800 μmol/L ATP组 A值分别为1.05±0.15、1.11±0.23、1.15±0.17、3.65±0.30、3.40±0.43，600与800 μmol/L ATP组 A值均显著大于其他各组（ P<0.05），且600与800 μmol/L ATP组间差异无统计学意义（ P>0.05）。HE染色结果显示，600 μmol/L ATP可诱导HDPC在根管牙段内分化形成牙本质样结构。 结论:600 μmol/L为ATP诱导HDPC成牙本质向分化的适宜浓度，该浓度ATP可在免疫缺陷小鼠体内诱导HDPC形成牙本质样结构。

背景:甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl,Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率,这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法.目的:探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响.方法:将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中,采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力.将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导,采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况,采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达.结果与结论:①CCK-8检测结果显示,前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高,第10天时速度减缓;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05);③RT-PCR结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05),且14 d基因表达量明显高于7 d(P<0.05).结果表明,培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力,能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力.

背景:牙髓-牙本质再生一直是近几年研究的热点及难点,构建复合生物支架材料为牙髓-牙本质再生提供了新的思路与方法.目的:观察甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质支架对人牙髓干细胞增殖、迁移与成骨分化的影响.方法:将不同质量的经处理牙本质基质分散至甲基丙烯酸酐改性明胶溶液中,使甲基丙烯酸酐改性明胶与经处理牙本质基质的质量比分别为2∶1、1∶1、1∶2,采用冷冻干燥法制备甲基丙烯酸酐改性明胶/经处理牙本质基质支架,检测支架的微观形貌、吸水率及机械性能.采用不同质量比的支架浸提液、DMEM培养基(对照组)分别培养人牙髓干细胞,检测细胞增殖与迁移情况.采用不同质量比的支架浸提液+成骨诱导液、DMEM培养基+成骨诱导液(对照组)分别培养人牙髓干细胞,碱性磷酸酶染色分析成骨能力.结果与结论:①扫描电镜下可见3组支架均具有多孔结构,随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,支架的孔隙率升高,组间两两比较差异有显著性意义(P＜0.05);随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,支架的吸水率升高,组间两两比较差异有显著性意义(P＜0.05);随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,支架的抗压强度、剪切强度增大.②CCK-8检测显示培养3,5,7 d,2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞增殖吸光度值均高于对照组(P＜0.05),并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,细胞增殖吸光度值升高(P＜0.05);细胞划痕实验显示2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞迁移率均大于对照组(P＜0.05),并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,细胞迁移率增大(P＜0.05).③碱性磷酸酶染色显示,2∶1、1∶1、1∶2支架组细胞成骨分化能力均强于对照组,并且随着支架中经处理牙本质基质质量的增加,细胞成骨能力增强.④结果表明,甲基丙烯酸酐改性明胶与经处理牙本质基质质量比为1∶2的支架最适合牙髓干细胞的增殖与分化.

目的 研究季铵盐包裹溴化银纳米复合物(AgBr/BHPVP)对牙本质基质金属蛋白酶(MMP)活性的影响.方法 采用比色试剂盒检测浓度为0.5%~1.5% AgBr/BHPVP对游离型重组人基质金属蛋白酶rhMMP-2、rhMMP-8、rhMMP-9活性的影响.将脱矿的牙本质经0.2%氯己定(CHX)或不同浓度AgBr/BHPVP处理,分别在第3、5、7天测定释放Ⅰ型胶原吡啶交联终肽(ICTP)水平和第30天时测量牙本质条干重损失量,以及使用明胶酶谱法检测对牙源性明胶酶MMP-2、MMP-9活性的影响,用以评估AgBr/BHPVP对结合型MMP活性的影响.采用单因素方差(One-Way ANOVA)分析各处理组rhMMP活性以及各处理组牙本质条干重损失量总体差异,使用重复测量方差分析各处理组在不同时间点对ICTP释放水平的影响,Tukey检验进行组间两两对比.结果 检测浓度AgBr/BHPVP对游离型MMP均具有明显的抑制作用,浓度达1.5%时对rhMMP-2、rhMMP-8、rhMMP-9活性抑制接近90%.ICTP释放量在7 d时,AgBr/BHPVP组

目的 研究氧化海藻酸钠(ADA)改性脱矿牙本质胶原的交联度和显微形貌,及其对牙本质基质金属蛋白酶(MMP)的抑制作用和树脂牙本质粘接强度的影响.方法 制备ADA,进行傅里叶红外线光谱分析(FTIR).采用0.5％、1％、2％、3％和4％的ADA处理脱矿牙本质粉末(DDP)1、2、30 min,5％戊二醛溶液作为阳性对照,茚三酮比色法检测胶原交联度.制备(1.0±0.1)mm厚牙本质片,35％磷酸溶液酸蚀后ADA处理1 min,保持表面干燥或湿润,场发射扫描电镜(FESEM)观察其显微形貌.Sensolyte Generic MMP assay kit试剂盒检测不同浓度ADA对MMP-9的抑制作用.制备树脂牙本质粘接样本,检测ADA预处理试件冷热循环前后的微拉伸强度.使用SPSS 22.0对交联度实验进行多因素方差分析和Tukey检验,MMP-9抑制实验进行秩和检验和Bonferroni检验,微拉伸实验进行单因素方差分析和LSD检验.结果 FTIR显示海藻酸钠氧化后生成醛基形成ADA.DDP经ADA处理后,胶原交联度随处理浓度及处理时间呈依赖性增加,不同浓度组间(F=1329.423,P<0.001)及不同时间组间(F=1142.93,P<0.001)差异均有统计学意义.35％磷酸溶液脱矿牙本质表面经处理后,除阴性对照和0.5％ADA干燥处理组胶原纤维塌陷外,其余组均保持蓬松状态.0.5％～4％ADA对MMP-9的抑制程度为93.5％～100％,不同浓度组间差异有统计学意义(F=13.786,P<0.001).ADA预处理后,2％ADA组粘接样本冷热循环前后的粘接强度最高,分别为(28.2±4.2)、(18.3±3.7)MPa,差异有统计学意义(F前=5.544,P前<0.001;F后=5.181,P后<0.001)MPa.结论 2％ADA处理脱矿牙本质可提高Ⅰ型胶原纤维的交联度,使胶原纤维网保持蓬松状态,同时能抑制MMP-9活性,提高树脂牙本质粘接即刻及老化后的微拉伸强度,有利于改善树脂牙本质的粘接耐久性.

目的 比较不完全脱矿牙本质基质——经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)和完全脱矿牙本质基质——脱矿牙本质基质(demineralized dentin matrix,DDM)的材料制备、表面特性及对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)增殖与成骨分化的影响,为研究牙齿来源的骨替代材料治疗牙周骨缺损提供实验依据.方法 以人离体牙分别采用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)溶液梯度脱矿的方法制备TDM和通过盐酸浸泡完全脱矿的方法制备DDM,通过扫描电镜观察其表面结构;通过培养液浸泡法制备TDM和DDM的浸提液.将hPDLCs分为3组:TDM组(加入TDM浸提液)、DDM组(加入DDM浸提液)、对照组(加入含10％血清的培养液),分别诱导培养hPDLCs.通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测hPDLCs增殖情况,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达和矿化结节形成情况.结果 TDM表面疏松多孔、结构完整,三维结构性能优于DDM.TDM组和DDM组hPDLCs增殖能力均强于对照组,TDM组细胞增殖能力强于DDM组(F=36.480,P<0.05);TDM组细胞ALP活性高于DDM组;成骨诱导14 d后TDM组和DDM组均可见茜素红标记的矿化结节,TDM组多于DDM组.结论 TDM表面结构、促进hPDLCs增殖和成骨分化的能力均优于DDM,其有望作为牙周骨缺损的新型骨替代材料.

目的:建立比格犬年轻恒牙根尖周炎模型,探讨神经生长因子(NGF)对比格犬年轻恒牙牙髓组织再生的影响,阐明其作用机制.方法:选择6只比格犬符合标准的12颗恒牙作为研究对象,将其分为对照组、水凝胶组和水凝胶复合NGF组,每组2只犬4颗恒牙.对照组不建模;水凝胶组建立根尖周炎模型,给予单纯水凝胶处理;水凝胶复合NGF组建立根尖周炎模型,给予NGF复合水凝胶处理.采用HE染色观察各组实验牙组织学变化,测定各组实验牙再生组织长入深度和再生组织面积.结果:比格犬年轻恒牙根尖周炎模型建立成功.对照组牙根管内牙髓组织正常,有成纤维细胞、成牙本质细胞和血管组成;水凝胶组牙根尖部无新形成硬组织,根尖周出现纤维修复;水凝胶复合NGF组牙根管内有新形成的硬组织,可见牙骨质细胞样细胞和牙骨质基质陷窝,根管内可见游离的牙骨质样组织,牙根管内新形成的软组织主要为血管和成纤维细胞.水凝胶复合NGF组牙再生组织长入深度和再生组织面积均高于水凝胶组(t=66.261,P<0.01;t=60.363,P<0.01).结论:NGF具有促进比格犬年轻恒牙根尖周炎牙髓组织再生的作用.

目的 探讨经冷冻干燥处理的牙本质生物活性材料(FD)的生物、力学性能以及该材料对牙髓干细胞(DPSCs)细胞周期及形态特征的影响.方法 制备FD,检测FD、未冻干处理牙本质(D)、羟基磷灰石/磷酸三钙(HA)三组材料的挠曲强度及弹性模量;HE法观察材料的组织结构;ELISA法检测材料Ⅰ型胶原(COL-1)的释放量.将DPSCs分别培养于FD、D、HA及玻片四组材料表面,流式细胞术检测材料表面DPSCs周期,免疫荧光检测材料表面DPSCs的骨架特征.结果 挠曲强度D组为(194.1±24.3)MPa,FD组为(166.1±57.5)MPa,HA组为(6.2±0.2)MPa;弹性模量D组为(5.8±2.1)GPa,FD组为(4.7±1.5)GPa,HA组为(0.05±0.01)GPa.FD组和D组的挠曲强度及挠曲弹性模量差异无统计学意义(P>0.05),而HA组的平均值显著低于其他两组,且差异具有统计学意义(P<0.01).组织学结果显示,冻干处理后牙本质小管形态较完整;FD组、D组二者COL-1释放差异无统计学意义(P>0.05);FD组与D组DPSCs细胞周期分布中各相细胞百分率无明显差异,HA表面DPSCs活性最低;荧光染色显示两个牙本质组表面DPSCs细胞骨架结构优于HA组及盖玻片/α-MEM组.结论 经冷冻干燥处理的牙本质生物活性材料具有与未冻干处理牙本质相似的力学性能和组织结构,对DPSCs周期分布及细胞骨架结构有积极作用.

背景:研究证实牙本质颗粒具有良好的成骨潜能,其中未脱矿牙本质颗粒的空间维持作用好,但降解吸收缓慢,延缓了新骨生成速度;完全脱矿牙本质颗粒降解快,但支架作用不佳、新骨生成量有限.目的:评价部分脱矿牙本质颗粒作为骨移植材料的组织反应与成骨效果.方法:收集临床上拔除的废弃牙齿,去除牙釉质、牙骨质和牙髓,保留健康的牙本质,经过粉碎、筛选、煮沸、灭菌等处理制成直径0.5-1.0 mm的未脱矿牙本质颗粒;将牙本质颗粒先浸泡在2％硝酸中脱矿10 min,制成部分脱矿牙本质颗粒.取5只比格犬进行双侧上颌窦开窗提升骨缺损造模,随机分为2组,实验组植入部分脱矿异种牙本质颗粒,对照组植入未脱矿异种牙本质颗粒,术后3个月对植骨区进行大体观察、影像学检查和组织学测量分析.结果 与结论:①大体观察:两组植骨区愈合良好,无炎症反应,实验组植骨区表面较平坦,可见少量残留牙本质颗粒包埋在骨基质中;对照组植骨区表面不平整,可见较多牙本质颗粒;②锥形束CT检查:实验组植骨区为低密度的阻射影,牙本质颗粒与周围组织边界不清,移植的牙本质颗粒总体积减小,牙本质颗粒间影像密度较高;对照组可见高密度的牙本质颗粒阻射影,与周围组织边界较明显,牙本质颗粒吸收程度较实验组轻;③组织学观察:两组植骨区均未见明显的炎症细胞浸润,实验组牙本质颗粒呈虫蚀状吸收,周围有新生骨组织围绕,新生编织骨较致密;对照组牙本质颗粒吸收程度较实验组轻,新骨生成率低于实验组(P<0.05);④结果表明:两种牙本质颗粒均可以诱导新骨形成,在相同时间内,部分脱矿牙本质颗粒的成骨效果优于未脱矿牙本质颗粒.

目的:探讨沉默整合素α6(integrinα6,ITGA6)是否通过激活FOXO信号通路影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)的成牙本质向分化.方法:利用课题组前期构建的ITGA6沉默慢病毒干扰hDPSCs,通过Real-time PCR和Western blot验证干扰效率,同时检测空载组(sh-NC)和ITGA6沉默组(sh-ITGA6)的FOXO信号通路活性.然后用AS1842856抑制FOXO1,经矿化诱导7 d后进行Western blot和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色来观察hDPSCs的成牙本质向分化情况.结果:Real-time PCR和Western blot结果显示构建的ITGA6沉默慢病毒能有效干扰hDPSCs中ITGA6的表达;与sh-NC组比,sh-ITGA6组FOXO1在mRNA水平表达上调(P<0.05),同时Western blot结果显示其在胞核表达量增加(P<0.05);Western blot检测成牙本质向分化标记物显示,sh-ITGA6组牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)表达上调(P<0.05),经AS1842856处理sh-ITGA6后,DSPP和DMP-1表达下降(P<0.05);ALP染色结果显示,sh-ITGA6组ALP染色明显加深,经AS1842856处理sh-ITGA6后,ALP染色变浅.结论:沉默ITGA6通过激活FOXO1信号通路促进hDPSCs的成牙本质向分化.