目的:探讨巨噬细胞为适应肿瘤微环境(tumor micro-environment，TME)需要而在其自身极化层面上发生谱系变化模型的特征，为进一步研究TME中巨噬细胞的可塑性提供参考。方法:取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转基因并已建成近交系的Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU裸小鼠骨髓细胞，分别在巨噬细胞集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1，CSF-1)、IFN-γ＋LPS、IL-4诱导下，培养出M0、M1和M2亚型，倒置荧光显微镜观察GFP。免疫细胞化学染色法检测巨噬细胞标志蛋白和极化蛋白，并进一步与人脑胶质瘤干细胞SU3共培养。 结果:倒置荧光显微镜下，原始骨髓细胞和条件培养基培养出的M0、M1和M2都发出强烈的绿色荧光。瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色后，普通显微镜下能观察到巨噬细胞固有的可塑性。免疫细胞化学染色检测CD11C和CD206标志蛋白表达都呈阳性，CD68只在M1巨噬细胞上为弱阳性，CSF-1和CSF-1R在各亚型细胞上都呈强阳性。在共培养的干细胞球体中观察到了绿色荧光细胞浸润，并发生了吞噬反应。结论:本研究建立了绿色荧光裸小鼠的髓源性巨噬细胞谱系模型，包含M0、M1和M2亚型，都有巨噬细胞固有的可塑性，表达共同的标志蛋白和极化相关蛋白，具有巨噬细胞固有的吞噬功能，可用于与肿瘤细胞之间相生相克表征的研究，特别是需要示踪研究时，可通过巨噬细胞发出的绿色荧光进行识别。

目的:探讨游离骨移植在颅骨缺损中的成活机制。方法:通过将4周龄绿色荧光蛋白(GFP)小鼠头颅骨移植到4周龄裸鼠颅骨缺损来模拟重建骨移植，实验分观察组、阳性对照组，每组15只。4～24周后进行大体观察，骨组织面积测量(BTA%)和绿色荧光量(GFP%)的检测。结果:大体观察显示，观察组小鼠颅骨左侧缺损术后4～24周逐渐出现成骨，与周围骨组织紧密连接且具有相同的厚度。单纯颅骨缺损区域没有新骨形成，仅被纤维组织覆盖，表明缺损未被修复。组织学提示，观察组术后4、8、12、18、24周颅骨骨移植部位骨组织面积百分比BTA(%)值与阳性对照组差异无统计学意义( P>0.05)。绿色荧光量(GFP%)的检测，观察组术后4、8、12、18、24周为(6.33±0.73) %、(3.40±0.68)%、(1.98±0.21) %、(0.81±0.08)%、(0.68±0.06)%，各观察时间点的数据与阳性对照组比较，差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:游离骨移植在颅骨缺损的成活机制主要是骨的爬行替代和骨再生。

目的:初步探讨改性纳米生物玻璃水凝胶的制备以及它的理化、生物学特性。方法:(1)取400 mL氢氧化钙饱和溶液，加入纳米二氧化硅悬液67 mL，制备纳米生物玻璃悬液，观察其悬浮稳定性。(2)制备终质量分数为10%明胶、1%海藻酸钠的水凝胶，设为对照组；在对照组水凝胶基础上加入实验(1)制备的纳米生物玻璃悬液，制备终质量分数为0.5%生物玻璃、10%明胶、1%海藻酸钠的水凝胶，设为实验组。观察2组水凝胶在4、25 ℃的成胶情况并记录成胶时间及在37 ℃的熔解情况并记录熔胶时间。另取2组水凝胶，4 ℃冷浴后用25 g/L的氯化钙溶液交联，用杨氏模量测定仪测量压缩模量。另取2组水凝胶，同前交联后于-20 ℃冻干，测量相关体积并计算孔隙率。样本数均为3。(3)取12只24 h龄C57BL/6J小鼠乳鼠，分离培养成纤维细胞(Fb)，倒置显微镜下观察其形态，并培养第3代Fb，用于后续实验。取Fb，制备细胞浓度为1×10 5个/mL的单细胞悬液，按随机数字表法(下同)分为实验组和对照组，分别加入实验(2)制备的实验组和对照组液态水凝胶，培养12、24、48 h，每组各取3孔，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞存活率。(4)取第3代Fb，制备细胞浓度为(3.0～4.5)×10 7个/mL的单细胞悬液，分为实验组和对照组，每组1管，加入绿色荧光探针DIO染色，分别加入实验(2)中制备的实验组和对照组液态水凝胶9 mL，同前交联后制备载细胞水凝胶。培养3 d，激光共聚焦显微镜下观察细胞在凝胶中的存活情况；同前制备载细胞水凝胶块但不加绿色荧光探针DIO，培养7 d，在扫描电子显微镜下观察细胞在水凝胶中的黏附及伸展情况。(5)取6周龄雌性BALB/c-nu裸鼠12只，分为实验组和对照组，每组6只，在背部制作直径为1 cm的圆形全层皮肤缺损创面，伤后即刻，分别放入1块实验(4)制备的实验组和对照组载细胞水凝胶块。伤后7、14 d，每组取3只裸鼠，收集创面及创周组织，苏木精-伊红染色，观察创面愈合情况。对数据行独立样本 t检验。 结果:(1)纳米生物玻璃粒子可在水中均匀分散，具有良好的悬浮稳定性。(2)2组水凝胶在37 ℃下均呈熔融状态，均未见粒子析出。实验组和对照组水凝胶在37 ℃下的熔胶时间分别为5、10 min，在25 ℃下成胶时间分别为30、180 min，在4 ℃下成胶时间分别为5、10 min。实验组水凝胶压缩模量为(53±6)kPa，明显高于对照组的(23±6)kPa( t＝6.364， P<0.01)。实验组水凝胶孔隙率为(86.1±2.1)%，与对照组的(88.2±4.4)%相近( t＝1.210， P>0.05)。(3)细胞呈长梭形，细胞核所占比例较大，符合Fb形态学特征。培养12、24、48 h，实验组细胞存活率为(84±4)%、(89±4)%、(130±10)%，与对照组的(89±5)%、(90±4)%和(130±11)%相近( t＝1.534、0.611、0.148， P>0.05)。(4)培养3 d，2组细胞在水凝胶中形态完整，未见细胞核裂解、消失，细胞质保持完好，并且实验组细胞荧光强度明显强于对照组。培养7 d，实验组和对照组细胞在水凝胶中黏附、伸展，且实验组细胞在水凝胶中黏附数明显多于对照组。(5)伤后7 d，对照组、实验组裸鼠创面面积均缩小，且实验组减小更明显，2组裸鼠创面及创周均可见大量炎症细胞分布。伤后14 d，对照组裸鼠创面面积大于实验组，且创面及创周炎症细胞明显多于实验组。 结论:纳米生物玻璃水凝胶具有良好的理化、生物学特性和载细胞潜能，同时还具有促创面愈合能力，在临床应用方面有着较好的潜力。

目的:探讨人脐带血间充质干细胞(HUC-MSCs)对人舌鳞癌细胞(Cal-27)移植瘤生长的影响及其相关特异性蛋白表达机制.方法:将Cal-27细胞移植到BALB/c裸小鼠皮下,待裸鼠肿瘤体积达到50 mm3成瘤标准后通过裸鼠尾静脉注射经GFP绿色荧光蛋白标记的HUC-MSCs,然后研究HUC-MSCs对预先建立的Cal-27细胞移植瘤生长状况的影响.为了阐明其发生机制,我们对具体阳性实验组及阳性对照组肿瘤组织的细胞增殖及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、c-Myc、β-catenin的相对mRNA表达量进行了q-PCR分析实验.结果:在预先建立人舌鳞癌的体内模型中,通过尾静脉注射的经GFP绿色荧光蛋白标记的HUC-MSCs可以在肿瘤组织内富集并可抑制肿瘤生长.通过实时荧光定量PCR实验,我们发现阳性实验组相较于阳性对照组肿瘤组织细胞内Bax的mRNA表达量上调,Bcl-2、β-catenin、c-Myc的mRNA表达量下调.结论:HUC-MSCs通过促进Bax/Bcl-2形成同源二聚体以及抑制Wnt/β-catenin信号通路可抑制Cal-27细胞移植瘤生长.

实体瘤会重构宿主微环境.我们观察双色荧光示踪共培养模型中的宿主巨噬细胞癌变,而且清楚的追踪到恶性转化的具体过程,现报道如下.一、材料与方法1.材料:人胶质瘤干/祖细胞株SU3和表达绿色荧光裸鼠的巨噬细胞,流式细胞仪(BECKMAN),活细胞工作站(Olympus公司),大鼠抗小鼠CD68单克隆抗体(Abcam),细胞计数试剂盒(Abbikine).2.观察细胞融合和分裂:表达红色荧光的SU3(SU3-RFP)细胞与绿色荧光裸小鼠腹腔冲洗细胞按1:8左右的比例共培养.在活细胞工作站中捕捉细胞间相互融合和融合细胞分裂过程.

目的:研究人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)对舌鳞癌基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达的影响.方法:培养Cal-27细胞和经绿色荧光蛋白(GFP)标记的HUC-MSCs细胞,并建立26只裸小鼠Cal-27舌鳞癌移植瘤模型,成瘤后随机分实验组和对照组,每组13只.实验组尾静脉注射GFP标记的人脐带间充质干细胞,对照组注射等量生理盐水.免疫组织化学法检测移植瘤组织中GFP蛋白表达情况,以及MMP-2、MMP-9蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测MMP-2和MMP-9 mRNA的相对表达量.结果:实验组肿瘤组织GFP表达阳性,对照组GFP表达阴性;实验组MMP-2和MMP-9表达量均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:HUC-MSCs有向舌鳞癌的归巢性,下调肿瘤组织MMP-2和MMP-9的相对表达量,提示HUC-MSCs具有抑制舌鳞癌Cal-27细胞侵袭转移的潜力.

目的探索七甲川菁近红外(NIR)荧光染料MHI-148在肝癌移植模型中的代谢特征,明确其识别肝细胞癌(HCC)细胞的特异性.方法体外培养人HCC细胞系Hep3B,荧光显微镜下观察荧光染料MHI-148在肿瘤细胞中富集强度;裸小鼠皮下注射Hep3B细胞建立移植模型,2周后,荷瘤鼠腹腔注射MHI-148溶液,NIR荧光活体成像检测不同时间点肿瘤部位和裸小鼠脏器中荧光强度的变化;连续检测肿瘤部位荧光强度(tumor,T)和临近正常组织荧光强度(background,B),计算最大T/B值.结果MHI-148染料可特异性集聚于体外培养的HCC细胞,识别绿色荧光蛋白(GFP)标记的Hep3B细胞;肝癌皮下荷瘤鼠注射MHI-148,24 h后肿瘤部位荧光强度可达8.35 × 109/cm2,而小鼠其他脏器较少有荧光聚集;T/B值逐渐增加,并在24h达到峰值.结论七甲川菁染料MHI-148可特异性识别人HCC细胞系Hep3B,通过NIR荧光成像或可检测到肝癌的发生.

目的 探讨胶质瘤干细胞(GSC)诱导TME中多种间质细胞的恶性转化及其相关分子特征.方法 将红色荧光蛋白(RFP)基因稳定转染人SU3-RFP的GSC与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因裸小鼠间质细胞体外共培养,将SU3-RFP细胞接种于EFGP-Balb/c裸小鼠不同部位,从体外培养基与体内肿瘤组织中分别单克隆具永生化特征的EGFP+细胞,经染色体分析和致瘤试验证实其具有肿瘤细胞特征,再以RT-PCR、流式细胞术和细胞免疫化学染色等分子手段检测相关分子表型.结果 (1)体外培养共得到2株EGFP+细胞系,体内致瘤实验共得到5株EGFP+细胞系,所克隆的7株EGFP+细胞具自我更新、呈异倍体染色体核型和100％致瘤率;(2)根据细胞标志物表达状况鉴定其分别起源于巨噬细胞(tMΦ1和tMφ2)、树突状细胞(tDC1和tDC2)、成纤维细胞(tFB)、少突胶质细胞(tOG)和骨髓间充质干细胞(tBMSC);(3)根据七株细胞共同表达Sca-1(髓源性干细胞标志物)和c-myc,分别表达Sox2、Nanog等诱导性多能干细胞(iPS)标志物,确定这些恶性转化细胞不同程度上兼具髓源干细胞和iPS细胞的分子特征.结论 (1)TME中肿瘤间质细胞自身恶变与GSC对TME组织重构相关,与其寄生地组织类型关系不大;(2)源于GSC的肿瘤细胞和GSC TME中恶变的间质细胞,是GSC重构的肿瘤组织内两大类不同起源的肿瘤细胞,由此构成广义肿瘤异质性概念的细胞学基础,后者有潜力作为靶向诊疗的新靶标.

目的 建立绿色荧光蛋白(GFP)/荧光素酶(Luc)双标的人食管癌ECA109细胞系(ECA109-Luc-GFP),采用一种非侵入性的生物活体成像方法监测食管癌裸鼠肿瘤模型.方法 MTT、流式细胞仪、划痕实验分析法检测ECA109-Luc-GFP细胞系与正常ECA109细胞的生物学特性差异.利用活体成像系统示踪肿瘤.结果 与正常ECA109相比,ECA109-Luc-GFP细胞在细胞活力、增殖和迁移能力方面差异均无显著性(P>0.05).利用小动物活体成像实验技术观察了肿瘤生长、转移等生物学特性.结论 成功构建了GFP/Luc双标的人食管癌ECA109细胞系(ECA109-Luc-GFP),应用小动物活体成像应用技术并活体观察食管癌动物模型的生长、转移.

目的:采用病证结合模型的方法建立阳虚证肺腺癌骨转移活体荧光成像模型,并评价其可行性.方法:将雌性BALB/c-nu小鼠随机分为假手术组、模型组、阳虚模型组,每组10只.模型组通过股骨骨髓腔种植表达绿色荧光蛋白人肺腺癌A549细胞建立肺癌骨转移活体荧光成像模型,阳虚模型组在模型组小鼠基础上采用臀部肌肉注射氢化可的松的方法建立裸鼠阳虚证模型;通过观察小鼠的一般情况与生存情况、小鼠体质量变化、小鼠肿瘤面积变化和阳虚症状评分,评价该模型的可行性.结果:①一般情况及生存情况:各组小鼠均未出现死亡及严重并发症.②小鼠体质量:实验期间,3组小鼠体质量比较差异均无统计学意义.③小鼠肿瘤面积:通过FluorVivo Model-100成像系统实时观察肿瘤生长情况,各组小鼠未出现其他部位和器官的转移,模型组和阳虚模型组的骨转移瘤面积随时间逐渐增大.实验结束时阳虚模型组肿瘤面积比模型组大,差异具有统计学意义(P＜0.05).④阳虚症状评价:实验结束时,阳虚模型组小鼠均出现了畏寒肢冷,活动减少、精神萎靡,饮食减少、皮毛苍白,大便清稀的阳虚症状,各症状评分明显高于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:采用“氢化可的松阳虚”裸鼠模型和“股骨骨髓腔种植转染绿色荧光蛋白肺腺癌A549细胞”骨转移活体荧光成像模型结合的造模方法安全有效,具有可行性.