目的:探讨西维来司钠是否能够通过抑制中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）进而减少黏蛋白5AC（MUC5AC）在肝内胆管上皮细胞中的表达，为治疗肝内胆管结石（IBDS）提供新的潜在治疗思路。方法:①生信分析：基于基因表达数据库（GEO）对胆结石及胆囊炎的测序数据进行差异基因分析，筛选中性粒细胞及黏蛋白相关的显著差异基因，使用基因与蛋白质相互作用检索数据库（STRING）进行蛋白互作分析，以预测NE基因与MUC5AC是否存在互作关系。②动物实验：将18只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、胆管炎模型组和西维来司钠治疗组，每组6只。结合预实验于大鼠右前叶肝脏一次性注射1.25 mg/kg脂多糖（LPS）建立胆管炎大鼠模型；假手术组肝脏注射等体积生理盐水。建模后，西维来司钠治疗组尾静脉注射西维来司钠100 mg/kg；假手术组和胆管炎模型组尾静脉注射等体积生理盐水；每日1次，连续给药5 d。2周后处死大鼠取肝胆管组织，光镜下观察肝胆管组织病理学改变；免疫组织化学染色检测肝胆管组织NE和MUC5AC表达；蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测肝胆管组织NE、MUC5AC、Toll样受体4（TLR4）的蛋白表达。③细胞实验：将原代人肝内胆管上皮细胞株（HiBEpiC）传代后分为空白对照组、NE组（10 nmol/L NE）、NE+西维来司钠低剂量组（10 nmol/L NE+1×10 -8 g/L西维来司钠1 mL）、NE+西维来司钠中剂量组（10 nmol/L NE+1×10 -7 g/L西维来司钠1 mL）、NE+西维来司钠高剂量组（10 nmol/L NE+1×10 -6 g/L西维来司钠1 mL）。培养48 h后收集细胞，行5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷（EdU）检测细胞增殖活性；酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blotting检测细胞MUC5AC的表达。 结果:①生信分析：NE基因（ELANE）与MUC5AC存在互作关系。②动物实验：光镜下显示，胆管炎模型组肝细胞水肿，肝细胞呈弥漫性点、灶状坏死，汇管区纤维组织及肝内胆管增生与炎症细胞浸润；西维来司钠治疗组肝小叶结构清晰，周围炎症细胞浸润程度较胆管炎模型组减轻。免疫组织化学染色显示，胆管炎模型组NE和MUC5AC较假手术组明显高表达，西维来司钠治疗组NE和MUC5AC表达较胆管炎模型组有所下降〔NE（ A值）：5.23±2.02比116.67±23.06，MUC5AC（ A值）：5.40±3.09比23.81±7.09，均 P<0.05〕。Western blotting检测结果显示，胆管炎模型组肝胆管组织NE、MUC5AC和TLR4的蛋白表达均较假手术组显著升高；西维来司钠治疗组肝胆管组织NE、MUC5AC和TLR4的蛋白表达较胆管炎模型组显著下降（NE/β-actin：0.38±0.04比0.70±0.10，MUC5AC/β-actin：0.37±0.03比0.61±0.05，TLR4/β-actin：0.39±0.10比0.93±0.15，均 P<0.05）。③细胞实验：荧光显微镜下显示，各组HiBEpiC细胞的增殖状态良好，阳性细胞比例无明显差异。ELISA法和Western blotting检测结果显示，NE组细胞MUC5AC表达较空白对照组显著升高；NE+西维来司钠各剂量组细胞MUC5AC表达较NE组显著下降，且随西维来司钠浓度升高呈下降趋势，以高剂量组变化最明显〔MUC5AC（μg/L）：3.46±0.20比6.33±0.52，MUC5AC/β-actin：0.45±0.07比1.75±0.10，均 P<0.05〕。 结论:LPS作用后可致胆管炎大鼠NE、MUC5AC表达上调，西维来司钠可通过抑制NE减少肝内胆管上皮细胞MUC5AC的表达，为IBDS的治疗提供新的方向。

目的:探讨Ras蛋白激活类似物3（RASAL3）在肝内胆管癌（iCCA）中的表达并深入研究其促进iCCA进展的作用机制。方法:收集185例iCCA患者肿瘤与癌旁组织标本，应用免疫组化、RT-qPCR和Western blot法检测RASAL3的表达，并同时检测人胆管癌细胞株和人胆管上皮细胞中RASAL3和FXYD6的mRNA和蛋白表达情况，CCK-8法检测细胞增殖及Na +-K +-ATP酶活性。 结果:RASAL3在胆管癌组织和细胞株中高表达；生存分析结果显示RASAL3高表达与胆管癌的不良预后相关（ P<0.05）。敲降RASAL3抑制胆管癌细胞的增殖；沉默RASAL3降低FXYD6表达水平，抑制Na +-K +-ATP酶活性。 结论:iCCA中RASAL3表达水平显著上调，RASAL3可通过激活FXYD6，上调Na +-K +-ATP酶活性促进iCCA的发展。

胆道闭锁(biliary atresia，BA)是以肝内外胆管进行性炎症及纤维化为特征的疾病，其发病原因不明，可能与病毒感染、免疫损伤有关。BA确诊后应先行Kasai手术，部分患者可恢复胆流，但纤维化过程并没有停止且影响BA预后。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)参与肝纤维化过程，EMT在外界因素刺激下，极化的上皮细胞逐渐松解，转化成为具有间质细胞特征的细胞，导致肝纤维化进一步加重。转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGFβ1)可诱导上皮-间质转化，其诱导EMT通过TGFβ1/Smad通路及不依赖Smad的其他TGFβ1信号通路。微小RNA可影响相关信号通路参与肝纤维化进程。本文将阐述BA中TGFβ1诱导EMT信号通路的研究进展，为抑制甚至逆转EMT进程、延缓肝纤维化提供思路。

目的:探讨肝内胆管上皮细胞(IBDECs)中维生素D受体(VDR)在胆道闭锁(BA)中可能发挥的作用及临床意义。方法:回顾性分析2015年1月至2019年12月在西安交通大学第二附属医院和西安交通大学附属儿童医院接受肝门空肠吻合术(Kasai术)治疗的38例BA患儿IBDECs中VDR的表达水平，免疫组织化学检测VDR在BA患儿IBDECs中的蛋白表达水平，以胆总管囊肿患儿IBDECs中VDR表达水平为对照；用Masson染色法观察肝组织纤维化程度；并分析BA患儿IBDECs中VDR的表达水平与手术时肝纤维化程度及Kasai术后难治性胆管炎发生率和自体肝生存时间之间的相关性。通过聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]模拟dsRNA病毒感染，体外干预人肝内胆管上皮细胞(HiBECs)，观察其对HiBECs活性和凋亡的影响及对HiBECs中VDR表达水平的影响。采用独立样本 t检验比较两组样本之间的差异；采用 χ2检验或 Fisher′ s确切概率法分析VDR与BA患儿临床病理常数的相关性；采用 Kaplan- Meier生存曲线分析不同VDR表达水平组BA患儿Kasai术后自体肝生存时间的差异。 结果:共38例BA患儿纳入本研究，其中23例IBDECs中VDR蛋白水平无显著降低，15例VDR蛋白水平显著降低。与IBDECs中VDR表达水平无明显降低的BA患儿相比，显著降低者肝纤维化程度更严重( P<0.001)，Kasai术后发生难治性胆管炎的比率更高( P＝0.017)。与对照组相比，IBDECs中VDR表达水平显著下降的BA患儿自体肝生存时间更短( P＝0.030)。Poly (I∶C)可引起BA患儿HiBECs的凋亡率增加( P<0.000 1)、细胞活性降低( P<0.05)；Poly (I∶C)还可引起HiBECs培养基中炎症因子(干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6)分泌增加( P<0.001)。Poly (I∶C)干预可引起BA患儿HiBECs中VDR蛋白的表达水平显著下降( P<0.001)。 结论:Poly (I∶C)可引起BA患儿HiBECs损伤及HiBECs中的VDR表达水平下降；IBDECs中VDR表达水平显著下降可能是BA预后不良的标志物。

目的:研究胆道闭锁肝纤维化过程中Shh信号通路核转录因子Gli1/Gli2在肝上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)中的调控作用，为阐明胆道闭锁肝纤维化的机制提供依据。方法:选择2018年1月至2018年12月经手术证实为胆道闭锁Ⅲ型患儿的肝活检组织标本10例作为胆道闭锁组，年龄在1~3月龄。以相同年龄段无肝胆系统畸形死亡新生儿尸检肝组织5例作为正常对照组。应用实时荧光定量聚合酶链(RT-qPCR)反应及蛋白质印迹法检测肝组织中Gli1/Gli2、EMT关键调控因子Snail/Slug及EMT特征性细胞因子的表达。另将2周龄BALB/c小鼠处死后分离肝内胆管上皮细胞mIBEC，按处理方式不同分为正常对照组、干扰对照组、过表达对照组、Gli1-shRNA组、Gli1过表达组、Gli2-shRNA组、Gli2过表达组。其中，正常对照组加入等体积培养基，干扰对照组加入空白慢病毒，过表达对照组加入空白腺病毒，Gli1-shRNA组应用Gli1-shRNA沉默Gli1，Gli2-shRNA组应用Gli2-shRNA沉默Gli2，Gli1过表达组应用Gli1腺病毒过表达Gli1，Gli2过表达组应用Gli2腺病毒过表达Gli2。应用RNA干扰技术研究Shh信号通路关键转录因子Gli1/Gli2表达对EMT过程的调控作用。采用单因素方差分析和LSD- t检验对数据进行统计学分析。 结果:RT-qPCR检测结果显示，胆道闭锁组患儿肝组织Gli2、Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为10.96±6.21、7.37±4.09、8.85±2.37和7.35±4.09，较对照组肝组织4.46±1.24、3.34±0.95、4.49±2.07和3.38±0.93均明显升高，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。胆道闭锁组患儿肝组织E-cadherin相对表达量为3.00±1.29，较对照组4.96±1.91明显降低，组间差异亦有统计学意义( P<0.05)。应用RNA干扰技术沉默Gli2基因后，Gli2-shRNA组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为2.23±0.67、3.11±1.07和2.74±0.61，较干扰对照组5.21±0.88、3.67±1.04和3.46±1.24明显降低，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。Gli2-shRNA组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中E-cadherin mRNA相对表达量为9.09±1.29，较干扰对照组4.36±0.85表达明显升高，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。过表达Gli2基因后，Gli2过表达组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为9.89±2.06、14.51±3.63、12.41±3.00，较过表达对照组4.32±0.78、4.58±0.95、4.09±1.03明显升高，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。Gli2过表达组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中E-cadherin mRNA相对表达量为2.30±0.39，较过表达对照组6.09±1.40表达降低，组间比较，差异有统计学意义( P<0.05)。沉默及过表达Gli1基因未见明确EMT特征细胞因子表达变化趋势。免疫荧光检测显示沉默Gli2基因表达后mIBEC中绿色荧光(胆管上皮细胞标记物CK19)增强，过表达Gli2基因后橙色荧光(间质细胞标记物α-SMA)增强。 结论:Shh信号通路在胆道闭锁肝纤维化中具有的重要作用，信号通路关键转录因子Gli2可显著调控肝内胆管上皮细胞EMT过程。

目的:探讨Hedgehog信号通路和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在胆道闭锁(biliary atresia, BA)肝纤维化进展中的作用，为BA肝纤维化发生机制提供实验依据。方法:选取2019年1月至2020年1月天津市儿童医院普外科12例BA患儿肝组织和4例先天性胆管扩张症(congenital biliary dilatation，CBD)患儿肝组织，通过免疫组织化学观察Hedgehog信号通路配体SHH、效应转录因子GLI2蛋白表达分布情况，并通过蛋白质印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测其蛋白及mRNA表达情况；通过免疫荧光染色观察EMT标记物神经钙粘蛋白(N-cadherin)及CK19表达分布情况。培养人肝内胆管上皮细胞，使用人重组SHH蛋白(r-SHH)和Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺(Cyclopamine)进行外源性干预后，检测Hedgehog信号通路激活水平、EMT标记物E钙黏素(E-cadherin)、N-cadherin蛋白及mRNA表达水平。结果:免疫组织化学实验结果显示，SHH表达于BA胆管上皮细胞胞质中，GLI2表达于BA胆管上皮细胞胞核中。蛋白印迹法实验结果显示，BA组SHH、GLI2蛋白相对表达量分别为2.09±0.43、1.94±0.17，CBD组SHH、GLI2蛋白相对表达量为1.00±0.05、1.00±0.37，组间比较，差异均有统计学意义( P均<0.05)。实时荧光定量聚合酶链反实验结果显示，BA组SHH、GLI2 mRNA的相对表达量分别为2.89±0.96、2.35±0.78，CBD组SHH、GLI2 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.34、1.00±0.22，组间比较，差异均有统计学意义( P均<0.05)。免疫荧光染色结果显示，EMT标记物N-cadherin与CK19共表达于BA胆管上皮细胞。使用r-SHH处理激活Hedgehog信号通路效应转录因子GLI2后，促进了EMT(抑制了E-cadherin，增强了N-cadherin)，阻断该通路后，EMT被阻断。 结论:Hedgehog信号通路在BA中高表达，是促进肝内胆管上皮细胞发生EMT的重要诱导通路，其在BA肝纤维化进程中起重要作用，为BA肝纤维化发生机制提供实验依据。

肝内胆管癌(ICC)是肝脏胆管上皮细胞来源的恶性肿瘤。根治性手术被认为是当前唯一可能治愈的方案，但是预后仍不理想。随着肿瘤免疫治疗的研究进展，化疗联合免疫治疗可提高ICC患者的生存率，已成为一线方案。基于基因组学的靶向治疗能使部分基因突变的ICC患者获益。另外，全身联合局部治疗也能改善部分ICC患者的预后。尽管如此，对ICC的治疗依然困难重重。本文对ICC治疗的策略作一综述，旨在为临床诊疗和基础研究提供有价值的参考。

目的:基于单细胞组学分析肝内胆管癌（ICC）根治性切除术后患者的生存获益。方法:本研究为回顾性病例系列研究。整合基因表达综合数据库中4个数据集的ICC单细胞测序结果，共获得46例患者根治性切除样本，探索ICC微环境的特征。同时分析附有生存数据的EMBI数据库共100例ICC组织芯片数据，通过ssGSEA算法计算芯片数据每个样本中各个上皮细胞亚群的浸润丰度，探索与患者较差预后相关的关键上皮细胞亚群，并研究该亚群关键标志（marker）基因的临床价值。通过单因素与多因素 Cox 比例风险模型筛选预后相关marker基因，使用目标基因构建 Cox比例风险模型并绘制列线图，使用Kaplan-Meier 生存分析验证评分与患者预后的关系，通过受试者工作特征（ROC）曲线、校准曲线及决策曲线（DCA）对模型预测效能进行评估。结果:上皮细胞亚群几乎仅在肿瘤组织中浸润。表达 MT2A的上皮细胞亚群与患者更差的预后相关且浸润丰度很高，以该亚群浸润为特征的患者被定义为抗氧化型。经单因素与多因素Cox比例风险模型筛选该亚群的marker基因，其中 FILPIL、 NAKBIA、 PEG10、 SERPINB5是患者的独立预后因素。用这4个基因表达量构建Cox比例风险模型，根据该模型所区分的高风险组患者的术后1、3、5年总体生存率均低于低风险组患者（ P值均<0.05）；所构建的列线图具有较好的区分度及有效性。ROC曲线显示，模型1、3、5年预测的曲线下面积分别为0.779、0.844、0.845；经校准曲线与DCA检验，对比临床指标，该模型具有较好的预测效能。 结论:MT2A阳性上皮细胞亚群与ICC患者根治性切除术后的生存获益相关，可将ICC组织分为抗氧化型与非抗氧化型，抗氧化型预示患者预后较差，可考虑通过术后辅助治疗等手段改善生存。

原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种以慢性进行性胆汁淤积为主要特征的自身免疫性肝病，针对自身抗原——丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位（PDC-E2）免疫耐受性的丧失是PBC发病的根源。肝内胆管上皮细胞特有的免疫生物学特性使其成为PBC发病的积极参与者。近年来，PBC的检出率逐年提高，但临床上仍未改变熊去氧胆酸单一用药的格局，深入了解PBC的免疫发病机制将有助于临床医师更好地预防和治疗疾病。

目的:通过实验研究胆道闭锁(biliary atresia，BA)患儿总胆固醇(total cholesterol，TC)对胆管损伤的影响，并探讨其免疫学机制。方法:回顾性收集2011—2020年间广州市妇女儿童医疗中心收治的118例经术中胆管造影确诊的BA患儿、80例同龄婴儿肝炎综合征(infantile hepatitis syndrome，IHS)患儿以及165例无肝病学证据且无肝功能异常的同龄正常对照(normal control，NC)儿童外周血TC含量。分析TC与胆管损伤各指标及多种与BA形成相关免疫细胞之间的关联。在体外CD177 ＋中性粒细胞与胆道上皮细胞(biliary epithelial cell，BEC)共培养体系中加入胆固醇，观察其对BEC凋亡的影响，同时观察加入胆固醇刺激后CD177 ＋中性粒细胞内相关指标的变化；根据外周血TC检测数值将BA患儿分为高胆固醇BA组、正常胆固醇BA组，通过RNA测序分析，比较高胆固醇组、正常胆固醇组BA患儿CD177 ＋中性粒细胞基因表达差异。 结果:BA患儿外周血TC含量为4.9(4.0，6.1)mmol/L，高于NC组的3.7(3.1, 4.1)mmol/L及IHS组的4.2 (3.3，5.4)mmol/L，差异有统计学意义( P<0.05)；BA患儿外周血TC含量[4.9(4.0, 6.1)mmol/L]与胆管损伤指标γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)含量[497.0(298.5，843.0)U/L]呈正相关( r＝0.401， P<0.05)，同时与直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)、总胆汁酸(total bile acid，TBA)含量呈正相关( r＝0.338， P<0.05； r＝0.235， P<0.05)；在肝脏组织胆管细胞凋亡数量比例层面，高胆固醇BA组为0.724±0.146，正常胆固醇BA组为0.232±0.141，NC组(患儿年龄相近门静脉海棉样变儿童)为0.242±0.228，高胆固醇BA组与其余两组间差异有统计学意义( P<0.05)；BA患儿外周血TC含量[4.4(3.1，5.5)mmol/L]与外周血CD177 ＋中性粒细胞比例[(26.5±6.4)%]呈正相关( r＝0.503， P<0.05)，与外周血单核细胞[1.0(0.8，1.2)×10 9/L]、中性粒细胞[(3.2±1.4)×10 9/L]无相关性( P>0.05); BA患儿外周血TC含量[(4.7±1.6)mmol/L]与外周血T细胞数量(4 952.1±1 985.0)个/μL呈正相关( r＝0.488， P<0.05)，与外周血B细胞971.0(664.8，1 636.1)个/μL无相关性( P>0.05)；与正常胆固醇BA组相比，高胆固醇BA组线粒体氧化磷酸化相关基因( CYBB、 CALR、 MT- CYB、 MT- ND5、 MT- ND1)表达显著上调，差异有统计学意义( P<0.05)；在胆固醇刺激下，CD177 ＋中性粒细胞中代表线粒体氧化磷酸化的指标TOMM20及DNA 8-OHdG的平均荧光强度分别为73.47±6.36、159.07±10.17，较刺激前差异有统计学意义( P<0.05)，而CD177 ＋中性粒细胞胞外诱捕网指标MPO和H2B分别为60.51±4.26、157.46±9.40，较刺激前差异有统计学意义( P<0.05)；同时在CD177 ＋中性粒细胞与BEC共培养体系中，加入胆固醇刺激后BEC细胞活率较刺激前差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:胆道闭锁中胆固醇可上调CD177 ＋中性粒细胞线粒体氧化磷酸化水平，促进胞外诱捕网的释放，引起胆管损伤。