蛋白结合类毒素是尿毒症毒素的一种，可引起炎症反应并增强氧化应激，促使肾小球硬化和间质纤维化，是慢性肾脏病和血液透析(HD)患者心血管疾病发生发展的关键，可影响长期预后。因其蛋白结合率高，常规HD难以清除。本文就蛋白结合类尿毒症毒素清除策略的研究进展作一综述。

目的:制备含有L452R和T478K突变位点的新型冠状病毒受体结合域（RBD）-破伤风类毒素蛋白（TT），表达后蛋白免疫小鼠以了解突变体蛋白的免疫原性。方法:设计2对新型冠状病毒引物对RBD中的L452R和T478K进行突变，并将TT肽的核苷酸片段嵌入RBD中；利用大肠埃希菌表达系统表达蛋白，借助离子柱层析技术纯化出目的蛋白，复性获得空间构象后通过ELISA、高效液相和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）等进行检定；免疫小鼠后ELISPOT检测其细胞免疫水平；用竞争法ELISA和活病毒中和试验评估其中和抗体对新型冠状病毒流行突变株的抑制能力。结果:成功构建了新型冠状病毒RBD的L452R和T478K突变蛋白，蛋白相对分子质量为26 390。小鼠免疫后产生了特异性的细胞免疫，突变蛋白组刺激后产生的分泌IFN-γ的效应T细胞为（21.43±11.71）个斑点形成细胞/5×10 5个细胞,高于对照组（3.38±2.56）个斑点形成细胞/5×10 5个细胞，差异有统计学意义（ t= 4.17, P=0.003）；同时产生了针对新型冠状病毒德尔塔、奥密克戎（BA.1）流行株的高滴度中和抗体，中和滴度几何平均数分别为3 012.28和1 086.12。 结论:本研究所构建的L452R和T478K突变蛋白对流行的新型冠状病毒德尔塔、奥密克戎（BA.1）流行株有效，为开发重组广谱的新型冠状病毒疫苗提供依据。

目的:研制新型非天然氨基酸标记的HiD-Hin47融合载体蛋白。方法:选择融合蛋白氨基酸序列中合适位置的20个氨基酸位点，利用非天然氨基酸标记技术将原有氨基酸位置插入一种含叠氮基的非天然氨基酸N6-(2-叠氮乙氧羰基)-L-赖氨酸(NAEK)，对不同位点插入NAEK的融合蛋白进行表达和纯化，纯化后产物经SDS-PAGE分析，观察各位点融合蛋白产量，最终E677位点表达稳定性更高，均能达到野生型的70%，选择E677位点表达的融合蛋白与3型和6B型肺炎球菌多糖发生click反应完成偶联，所得结合物纯化后进行动物实验和免疫学检测，并与CRM197、破伤风类毒素(TT)、HiD以常规结合方式与3型和6B型肺炎球菌多糖结合产物进行对比。结果:以HiD-Hin47为载体蛋白的3型肺炎球菌多糖结合物的免疫原性稍优于与其余3组结合物，但差异无统计学意义；以HiD-Hin47为载体蛋白的6B型肺炎球菌多糖结合物的免疫原性显著优于以TT、HiD为载体的结合物，与以CRM197为载体结合物的免疫原性差异无统计学意义。结论:NAEK标记的HiD-Hin47具有作为肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗载体蛋白的潜力，值得进行进一步研究。

近年来,慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的患病率和病死率逐年上升,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是CKD高发病率和高病死率的原因之一.这种高风险不能完全用传统的心血管危险因素来解释,CKD特有的危险因素尿毒症毒素已经成为解释CKD相关CVD的关键因素.本综述通过对典型的蛋白质结合类毒素硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)进行总结,阐述目前它在CKD发生发展中的作用机制,并且通过其在动脉粥样硬化、血管钙化、充血性心力衰竭、心律失常四个方面的作用机制进行展开,显示IS与CKD相关CVD之间存在的关联.强调了有效减少血清中IS的治疗措施包括限制蛋白质的摄入、调节肠道菌群、口服肠道吸附剂以及增强IS清除率的创新透析方法.其中白蛋白结合竞争剂似乎是去除蛋白质结合类毒素的有效方法,未来需要发现更多清除IS的方法,并进一步确定其是否能延缓CKD的进展和减少CKD相关CVD的发生.

目的 比较白喉无毒突变体(cross-reactive material 197,CRM197)、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)及破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)3种不同载体蛋白C群脑膜炎球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)结合疫苗在小鼠体内的免疫原性.方法 在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的缩合作用下,将TT和DT用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备TT-AH及DT-AH衍生物,GCMP再分别与TT-AH、DT-AH及CRM197共价结合制备结合物,经Sepharose 4FF凝胶柱分离纯化后,进行化学检测、相对分子质量测定及鉴别试验.用GCMP及3种结合物经皮下注射NIH小鼠,第0、14、28天各免疫1次,分别于首免后第7、21和35天经小鼠颈动脉采血,分离血清,ELISA法检测抗体效价.结果 GCMP-TT和GCMP-DT的糖/蛋白比及多糖回收率较高,GCMP-CRM197较低,3种结合物游离多糖的含量均在5％以下,相对分子质量分别为5.8× 106、2.8× 106、1.1×106,且均可与GCMP的诊断血清产生沉淀线.3种结合物在小鼠体内均能产生良好的免疫原性,抗体水平均明显高于多糖组(P＜0.05);免疫2针后,GCMP-TT与GCMP-DT组的抗体水平差异无统计学意义(P＞0.05),而GCMP-TT和GCMP-DT组的抗体水平明显高于GCMP-CRM197组(P＜O.05);免疫3针后,GCMP-TT组小鼠产生抗体水平明显高于GCMP-DT及GCMP-CRM197组(P＜0.05).结论 3种不同载体的GCMP结合物免疫小鼠后均可产生良好的免疫应答,对于共价结合的方法,载体蛋白TT优于其他两种载体.

目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物(PS6 B-TT)中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证.方法:采用脱氧胆酸钠-盐酸沉淀法(NaDC/HCl),取不同浓度的载体蛋白破伤风类毒素(TT),加入1％ NaDC溶液混匀,离心后用Lowrry法检测上清中蛋白含量,以确定载体蛋白沉淀范围;用不同离子强度的氯化钠溶液稀释游离多糖对照品与TT的混合物,NaDC沉淀并离心后以蒽酮-硫酸法测定上清中多糖含量、计算回收率,确定游离多糖的最佳分离条件;以NaDC/HCl沉淀6B型多糖测定标准品并绘制标准曲线,与未经NaDC/HCl沉淀的标准品相比较,确定NaDC对蒽酮硫酸法测定结果的影响;由此建立NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法测定6B型结合物中游离多糖含量的方法,并对方法的专属性、准确度及精密度进行验证.结果:此方法沉淀载体蛋白浓度应控制在500μg· mL-以下;选择终浓度0.3 mol·L-1氯化钠溶液作为6B型肺炎球菌结合物中游离多糖测定的稀释液;NaDC/HCl沉淀法对蒽酮硫酸法测定多糖含量基本无影响;游离多糖对照品与载体蛋白TT混合物经建立的NaDC/HCl法沉淀后多糖及蛋白回收率分别为98.25％及0;游离糖添加试验回收率均在90％ ～100％;3批结合物游离糖含量测定值其试验内及试验间CV值均在10％以下.结论:本试验建立的NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法可有效分离6B型游离多糖与多糖蛋白结合物,并能够准确、稳定地测定结合物中的游离多糖含量.

目的 探讨以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)及白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)为载体的A、C、Y 、W135群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性.方法 将A、C、Y、W135群流脑多糖经溴化氰(CNBr)活化后,以1,6已二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为衍生剂制备相应的衍生物,分别与TT及DT在碳二亚胺[N-(3-Dimethylami-nopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]作用下结合,经Sepharose 4FF凝胶层析纯化后,加入冻干保护剂进行冻干,制备成A、C 、Y 、W135群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗.用两种蛋白载体疫苗分别按1及2.5 μg两个剂量(各型多糖的含量为1和2.5 μg)免疫小鼠,经腹部皮下注射,于0及14d各免疫1次,于首次免疫后第28天经静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清各型抗体水平.结果 1及2.5 μg两个剂量组的阳转率均高于80％,2.5μg免疫组的阳转率优于1μg免疫组;总体上来说,以TT为蛋白载体结合疫苗的阳转率高于以DT为载体的结合疫苗,对A和W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗较明显.结论 以TT及DT为载体制备的A、C、Y、W135群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗均具有良好的免疫原性,TT略优于DT.

目的 制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性.方法 在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间.通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性.以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino) pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质.通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性.将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性.结果 多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×105 g/mol降为1.175×105 g/mol.核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变.结合物的游离多糖质量分数为4.55％,游离载体蛋白质质量分数为1.08％.抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合.PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1～3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001).结论 制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答.

用N,N'-羰基二咪唑(CDI)作多A群脑膜炎球菌荚膜多糖(MenAps)的活化剂进行初步研究,以期开发一种新的多糖活化剂用于多糖蛋白结合物的制备.用A群脑膜炎球菌荚膜多糖作为原料,在水溶液条件下以CDI作为多糖活化剂进行活化;经活化的A群脑膜炎球菌荚膜多糖再与1,6-己二酰肼(ADH)衍生,得MenAps-ADH衍生物;衍生物与破伤风类毒素(TT)共价结合,形成MenAps-Tr结合物;检测衍生物和结合物的关键控制指标,并与《中国药典》三部(2015版)进行比较.当多糖:CDI的质量比为1∶1.5,1∶2时,获得的衍生物的衍化率分别为1.23％和1.76％;结合物的多糖含量、蛋白含量、游离多糖含量、游离蛋白含量均达到《中国药典》三部(2015版)的要求,MenAps-Tr结合物免疫的小鼠血清阳转率达到100％,几何平均抗体滴度(GMT)高,并与阴性对照组相比P =0.00423 (P ＜0.01)有显著差异.N,N'-羰基二咪唑(CDI)可在水相条件下活化多糖,并获得免疫原性良好的多糖蛋白结合物.

目的 观察长期血液透析(hemodialysis,HD)联合血液灌流(hemoperfusion,HP)治疗对维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者体内蛋白结合类毒素的清除效果及对生活质量的影响. 方法 选取心D患者36例,分为HD+HP组、HD组,每组各18例,HD+HP组HD治疗每周2次,HD+HP每周1次,HD组HD治疗每周3次,共36周.对比分析研究前后蛋白结合类毒素马尿酸(hippuric acid,HA)、硫酸吲哚酚(indoxyl sulphate,IS)、硫酸对甲酚(p-cresyl sulphate,PCS)的浓度变化及尿素氮清除指数(K t/V)变化.同时采用肾脏病生活质量简表(kidney disease and quality of life-shortform,KDQOL-SF1.3)进行生活质量评估. 结果 ①HA、PCS研究前、后比较,HD组无统计学差异(t=-0.328,P=0.747;t=-0.178,P=0.861);HD+HP组明显下降(t=2.221,P=0.040;t=2.207,P=0.041);研究结束时组间比较HD+HP组明显低于HD组(t=2.139,P=0.045;t=2.051,P=0.048);②IS研究前、后比较,HD组明显上升(Z=-2.298,P=0.035),HD+HP组无统计学差异(z=-0.970,P=0.332),研究结束时组间比较无明显差异(z=-1.485,P=0.137);③生活质量研究前、后比较,HD组躯体疼痛、精力维度得分较基线明显降低(t=2.136,P=0.049;t=2.947,P=0.009);HD+HP组症状与不适、肾病影响、精力维度得分较基线明显升高(t=-2.345,P=0.032;t=-2.467,P=0.025;t=-2.315,P=0.034).HD+HP组治疗后肾病影响、认知功能、睡眠质量、生理机能、躯体疼痛、总体健康、社会功能、精力明显好于HD组(t=-2.111,P=0.043;t=2.051,P=0.049;t=-2.062,P=0.047;t=2.241,P=0.032;t=-2.122,P=0.042;t=-2.374,P=0.024;t=-2.110,P=0.043;t=-2.560,P=0.015). 结论 长期使用HD+HP治疗对MHD患者体内蛋白结合毒素的清除效果优于HD治疗,并且可明显改善MHD患者的生活质量.