目的:探讨miRNA-4686（miR-4686）和蛋白质二硫键异构酶A4（PDIA4）在食管癌组织和细胞中的表达，以及miR-4686体外对食管癌细胞增殖和迁移能力的影响及可能机制。方法:采用miRWalk version 3在线网站预测到miR-4686与PDIA4 mRNA互补结合。利用从加州大学圣克鲁兹分校基因组（UCSC）数据库获得的miR-4686和PDIA4 mRNA的表达谱，分析食管癌组织和癌旁组织中miR-4686和PDIA4 mRNA相对表达量。从UCSC数据库获得miR-4686在人体细胞中的定位。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测食管癌细胞Eca109、TE-13、EC9706、KYSE-510与正常食管上皮细胞HET-1A中miR-4686和PDIA4 mRNA的相对表达量。选择miR-4686相对表达量最低的Eca109细胞进行后续研究。将Eca109细胞分为miR-4686组（转染miR-4686模拟物）和miR-NC组（转染miR-4686阴性对照序列模拟物）。通过克隆形成实验检测两组Eca109细胞增殖能力，划痕愈合实验检测Eca109细胞迁移能力，双萤光素酶报告基因实验验证miR-4686与PDIA4 mRNA的靶向关系；蛋白质印迹法检测PDIA4蛋白和PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果:与癌旁组织比较，食管癌组织中miR-4686呈低表达、PDIA4 mRNA呈高表达（均 P<0.01）。与正常食管上皮细胞HET-1A（0.98±0.15）比较，食管癌细胞Eca109（0.11±0.04）、TE-13（0.58±0.10）、EC9706（0.34±0.05）、KYSE-510（0.69±0.06）中miR-4686相对表达量均降低（均 P<0.05）。与miR-NC组比较，miR-4686组Eca109细胞miR-4686相对表达量升高（9.4±2.1比1.0±0.4， t＝3.88， P＝0.008），克隆形成数减少[（38±9）个比（114±18）个， t＝3.78， P＝0.009]，划痕愈合率降低[（27.13±0.91）%比（45.05±3.89）%， t＝4.48， P＝0.004]，PDIA4 mRNA相对表达量降低[1.0±0.5比6.3±0.9， t＝5.04， P＝0.002]。与野生型（WT）-PDIA4+miR-NC组比较，WT-PDIA4+miR-4686组Eca109细胞相对荧光素酶活性下降（0.31±0.08比0.99±0.08， t＝5.96， P<0.001）。与miR-NC组比较，miR-4686组Eca109细胞中PDIA4、p-PI3K、p-AKT、p-m-TOR蛋白表达均降低。 结论:食管癌组织中miR-4686呈低表达，PDIA4 mRNA呈高表达。miR-4686可能通过靶向调控PDIA4表达而抑制食管癌Eca109细胞增殖和迁移。

目的:研究转录激活因子6（ATF6）与需肌醇酶1-X-框结合蛋白1（IRE1-XBP1）在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤小鼠海马神经元（HT22）细胞中的交互作用。方法:复制OGD/R损伤HT22细胞模型，观察OGD/R后不同时间点（0、3、6、12、24 h）内质网应激（ERS）、细胞活性和凋亡的变化。将对数生长期的HT22细胞分为空白对照组、对照+ATF6激动剂AA147组、对照+IRE1抑制剂4μ8c组、OGD/R模型组、OGD/R+AA147组、OGD/R+4μ8c组（AA147组和4μ8c组于全程添加10 μmol/L AA147或16 μmol/L 4μ8c）。采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测各组HT22细胞ERS相关蛋白〔葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、磷酸化需肌醇酶1（p-IRE1）、磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（p-eIF2α）〕以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、活化caspase-3的表达；采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测ERS相关基因以及ATF6〔同型半胱氨酸内质网应激泛素样结构域1（Herpud1）、蛋白二硫键异构酶家族成员4（Pdia4）、Lin-12样抑制子/增强子（Sel1L）〕和剪接型X-框结合蛋白1〔XBP1s，包括DnaJ热休克蛋白成员B9（Erdj4）、Sec24相关基因家族成员D（Sec24d）、信号受体序列3（Ssr3）〕介导的转录反应相关基因的mRNA表达；采用细胞增殖与毒性检测试剂盒（CCK-8）检测细胞活性；采用免疫荧光法检测活化caspase-3表达。结果:与空白对照组比较，ERS相关蛋白p-IRE1和p-eIF2α的蛋白表达量分别在OGD/R 12 h、OGD/R 3 h升高（p-IRE1/β-actin：2.09±0.10比1.00±0.00，p-eIF2α/β-actin：1.39±0.11比1.00±0.00，均 P<0.01），ERS相关基因ATF6、XBP1s、非剪接型X-框结合蛋白1（XBP1u）、转录激活因子4（ATF4）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的mRNA表达量在OGD/R后不同时间点也明显升高，表明ERS在OGD/R作用的HT22细胞中被激活。与OGD/R模型组比较，OGD/R+AA147组p-IRE1蛋白表达量无改变，但XBP1s和XBP1u的mRNA表达量明显下降〔XBP1s（2 -ΔΔCt）：0.76（0.71，0.92）比1.13（1.03，1.29），XBP1u（2 -ΔΔCt）：0.29±0.05比0.52±0.04，均 P<0.01〕，而XBP1s介导的转录反应相关基因表达量无明显改变。与OGD/R模型组比较，在使用4μ8c后短链ATF6（sATF6）和GRP78的蛋白表达量无明显改变，ATF6介导的转录反应相关基因的mRNA也无明显改变。提示ATF6的激活能抑制XBP1s和XBP1u的mRNA表达，但ATF6与XBP1s介导的转录反应无交互作用。与空白对照组比较，HT22细胞活性在OGD/R 3 h时显著降低〔（44.64±5.12）%比（99.13±5.76）%， P<0.01〕，凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值和活化caspase-3/caspase-3比值分别在OGD/R 3 h和OGD/R 0 h显著升高（Bax/Bcl-2比值：6.15±1.65比1.00±0.00，活化caspase-3/caspase-3比值：17.48±2.75比1.00±0.00，均 P<0.01），表明凋亡在OGD/R作用的HT22细胞中被激活。与OGD/R模型组比较，OGD/R+AA147组细胞活性显著下降〔（36.52±17.78）%比（69.90±9.43）%， P<0.01〕，Bax/Bcl-2比值和活化caspase-3/caspase-3比值明显升高（Bax/Bcl-2比值：2.06±0.31比1.10±0.25，活化caspase-3/caspase-3比值：3.35±0.59比0.55±0.09，均 P<0.01）。 结论:在OGD/R损伤HT22细胞中，ATF6和XBP1s介导的转录反应无明显交互作用，但AA147激活的ATF6能抑制XBP1s和XBP1u的mRNA表达并促进应激HT22细胞中死亡的发生。

目的:探索巨噬细胞在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的作用、机制和治疗价值。方法:通过给予8周龄雄性Alms突变( foz/ foz)小鼠高脂饮食6、8和10周，给予8周龄雄性C57BL/6小鼠蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食7 d、3周和4周分别构建NASH小鼠模型，对照组小鼠分别给予普通饮食和MCD对照饮食。采用荧光定量聚合酶链反应方法检测NASH模型小鼠和对照组小鼠肝脏的 F4/80 mRNA水平，采用免疫荧光染色观察对照组小鼠和NASH模型小鼠肝脏中的巨噬细胞。lysM-Cre/DTR转基因小鼠予MCD饮食5周后，分为转基因实验组(给予白喉毒素清除巨噬细胞)和转基因对照组(给予磷酸盐缓冲液注射)。检测转基因实验组和转基因对照组小鼠肝脏中的甘油三酯水平和脂质过氧化物水平，并对小鼠的肝脏组织进行炎症评分。通过细胞因子分析实验和蛋白质印迹法分析巨噬细胞调节NASH中炎症的作用机制。通过AML-12肝细胞和RAW264.7巨噬细胞条件培养基与细胞共培养观察肝细胞和巨噬细胞的相互作用。通过氯膦酸脂质体清除野生型和NASH模型小鼠中的巨噬细胞，证实其在NASH预防中的价值。统计学方法采用独立样本 t检验。 结果:NASH模型 foz/ foz小鼠高脂饮食饲养6、8和10周时肝脏中的 F4/80 mRNA水平均高于对照组小鼠(1.49±0.19、1.70±0.15、1.93±0.04比1.05±0.22)，差异均有统计学意义( t＝3.06、4.92、7.92，均 P<0.05)；NASH模型小鼠MCD饮食饲养7 d和3周时肝脏中的 F4/80 mRNA水平均高于对照组小鼠(2.70±0.99和3.08±1.71比1.00±0.83)，差异均有统计学意义( t＝3.43、3.54，均 P<0.01)；免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，NASH模型小鼠MCD饲养4周时肝脏中F4/80 +诱导型一氧化氮合酶(iNOS) +的M1型巨噬细胞增多，F4/80 +CD206 +的M2型巨噬细胞明显减少。巨噬细胞清除后转基因实验组小鼠的炎症评分、肝脏甘油三酯和脂质过氧化物水平均低于转基因对照组[(0.69±0.32)分比(1.95±0.74)分、(43.97±13.24) g/mg比(63.09±14.85) g/mg、(24.84±6.21) nmol/mg比(37.91±8.91) nmol/mg]，差异均有统计学意义( t＝3.14、2.72、2.41，均 P<0.05)。细胞因子分析实验结果显示，巨噬细胞清除可显著降低血液中白细胞介素(IL)-12和巨噬细胞炎症蛋白-1α的蛋白质水平(差异倍数分别为-3.98、-2.74，均 P<0.05)。转基因实验组小鼠细胞核中CCAAT/增强子结合蛋白β蛋白质减少。体外研究发现RAW264.7巨噬细胞条件培养基可促进AML-12肝细胞中脂肪聚集；MCD培养基处理的AML-12肝细胞条件培养基可促进RAW264.7巨噬细胞向M1型极化。经氯膦酸脂质体处理后的野生型小鼠肝脏中的甘油三酯和脂质过氧化物的蛋白质表达水平均低于MCD诱导的NASH模型小鼠[(45.33±14.59) g/mg比(63.10±16.02) g/mg、(2.11±0.48) nmol/mg比(2.73±0.17) nmol/mg]，差异均有统计学意义( t＝2.84、2.73，均 P<0.05)。蛋白质印迹法结果显示，经氯膦酸脂质体处理后的NASH模型小鼠肝脏中的磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶、肌醇需求酶-1α、蛋白质二硫键异构酶、葡萄糖调节蛋白78、磷酸化真核起始因子2α的蛋白质相对表达量均低于未经氯膦酸脂质体处理的NASH模型小鼠(1.84±0.36比3.05±0.83、1.50±0.84比6.65±1.47、0.87±0.12比2.28±0.52、1.68±0.43比4.76±1.13、1.42±0.19比2.75±0.79)，差异均有统计学意义( t＝2.32、5.28、4.56、4.41、2.85，均 P<0.05)。 结论:NASH中巨噬细胞发生M1型极化，并与肝细胞相互作用促进炎症因子分泌、脂肪合成因子上调、氧化应激和内质网应激，引起NASH进展。巨噬细胞清除剂氯膦酸脂质体是预防NASH潜在的新途径。

目的:观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）高表达对高浓度4-羟基壬烯醛（4-HNE）诱导下人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）内质网（ER）氧化应激损伤的保护作用。方法:体外培养的对数生长期hRMEC分为正常组、单纯4-HNE处理组（单纯4-HNE组），空载质粒联合4-HNE处理组（Vec+4-HNE组）、PSF高表达联合4-HNE处理组（PSF+ 4-HNE组）。单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞培养基加入10 μmol/L 4-HNE，刺激12 h。其后，Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组应用转染试剂脂质体2000分别导入pcDNA空载体、pcDNA-PSF真核表达质粒，转染24 h。正常组细胞常规培养。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；2'，7'-二氯二氢荧光素双乙酸盐探针检测各组细胞内活性氧（ROS）表达水平。蛋白质免疫印迹法检测各组细胞内ER氧化物蛋白1（Ero-1）、蛋白质二硫键异构酶（PDI）、C/EBP同源转录因子（CHOP）、葡萄糖调节蛋白（GRP）78、蛋白激酶R样ER激酶（pERK）/磷酸化pERK（p-pERK）、真核起始因子（eIF）2α/磷酸化eIF（peIF）、活化转录因子4（ATF4）蛋白相对表达量。组间比较行单因素方差分析。结果:单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞凋亡率分别为（22.50±0.58）%、（26.93±0.55）%、（11.70±0.17）%；细胞内ROS表达量分别为0.23±0.03、1.60±0.06、0.50±0.06。三组间细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（ F=24.531， P<0.05）；Vec+4-HNE组ROS表达水平较单纯4-HNE组、PSF+4-HNE组显著升高，差异有统计学意义（ F=37.274， P<0.05）。正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞ER中Ero-1、PDI蛋白相对表达量分别为1.25±0.03、0.45±0.03、0.63±0.03、1.13±0.09和1.00±0.10、0.27±0.10、0.31±0.05、0.80±0.06；CHOP、GRP78蛋白相对表达量分别为0.55±0.06、1.13±0.09、0.90±0.06、0.48±0.04和0.48±0.04、1.25±0.03、1.03±0.09、0.50±0.06。4组Ero-1（ F=43.164）、PDI（ F=36.643）、CHOP（ F=42.855）、GRP78（ F=45.275）蛋白相对表达量比较，差异均有有统计学意义（ P<0.05）。4组细胞ER p-pERK/pERK（ F=35.755）、peIF2α/eIF（ F=38.643）、ATF4（ F=31.275）蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:PSF可抑制高浓度4-HNE诱导的细胞凋亡及ROS产生；其作用机制与恢复ER稳态平衡及下调pERK/eIF2α/ATF4通路的活化水平密切相关。

目的 通过生物信息技术分析GSE72224 基因芯片数据,比较衰老小鼠与青年小鼠B细胞基因差异,探索关键基因,为衰老机制研究及药物研发提供思路.方法 通过NCBI提供的GEO数据库下载GSE72224,利用生物信息方法筛选衰老与青年小鼠B细胞差异表达基因,然后对差异表达基因进行基因本体论(GO)功能富集分析和京都基因组百科全书(KEGG)信号通路分析,并且构建蛋白质相互作用网络获得关键基因和关键模块.结果 共筛选出 87 个表达基因,包括其中66 个下调基因及 21 个上调基因.差异表达基因主要参与B细胞活化、内质网及内质网蛋白加工通路等.通过构建蛋白质相互作用网络从而筛选出H2A组蛋白家族成员(H2af)x、Zeste基因增强子人类同源物(Ezh)2、蛋白二硫化物异构酶(Pdi)A4、H2B组家族成员b(Hist2h2bb)、白细胞介素(IL)-10、Sel1l、Dnajb9、泛素样含PHD和环指域(Uhrf)1 这 8 个关键基因.并且筛选出两个重要模块,模块中的基因主要也与内质网蛋白加工通路等有关.结论 H2afx、Ezh2、Pdia4、Hist2h2bb、IL-10、Sel1l、Dnajb9、Uhrf1 此 8 个关键基因,主要参与B细胞发育、DNA甲基化和内质网的蛋白质调控等过程.但是有关基因的上下游作用点还需深入研究.

蛋白质二硫键异构酶A3(PDIA3),也被称为ERp57,是一种58kD的葡萄糖调节蛋白,是属于PDI家族的硫醇氧化还原酶伴侣蛋白[1].该分子涉及多种细胞功能,包括新合成的蛋白质的折叠和主要组织相容性复合物Ⅰ(MHC-Ⅰ)的装配[2,3].在人类的卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、肺癌、胃癌和前列腺癌中都有PDIA3的表达[4-6].本研究对PIDA3在大肠癌组织中的表达情况及其在细胞内的定位进行初步探讨.

目的 探讨金匮肾气丸治疗肾阳虚证的可能作用机制.方法 60只Wistar大鼠随机分为正常组20只和造模组40只,将造模成功的38只大鼠再随机分为中药组和模型组各19只,中药组大鼠给予金匮肾气丸8.44g/(kg·d)灌胃,正常组和模型组大鼠给予生理盐水3 ml灌胃,每日1次,连续3周.分别取正常组、模型组和中药组大鼠的股骨髁松质骨,进行总蛋白的提取与制备;采用蛋白质双向凝胶电泳技术展示各组大鼠股骨踝松质骨蛋白质组图谱,应用PDQuest 8.0软件分析各组间差异表达蛋白点,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)初步鉴定差异表达蛋白点.结果 各组大鼠股骨髁松质骨双向凝胶电泳图谱的蛋白点数目均为552个;与正常组比较,模型组有23个差异表达的蛋白质;与模型组比较,中药组有16个差异表达的蛋白质.给予金匮肾气丸溶液后,肾阳虚模型大鼠股骨髁松质骨中原来表达上调的磷酸甘油酸激酶1及表达下调的14-3-3ζ蛋白、网钙蛋白3、原肌球蛋白异构体2α-3链、原肌球蛋白α-4链、原肌球蛋白异构体α-1链、40s核糖体蛋白sa、半乳糖凝集素1、线粒体ATP合成酶亚基α、膜联蛋白A1、GDP解离抑制因子1、Ⅰ型胶原α-1链、LOC683667蛋白、膜联蛋白A5、过氧化氧化还原蛋白2和蛋白质二硫键异构酶A3均出现表达趋势的反向调整.结论 金匮肾气丸对肾阳虚证的调节可能涉及股骨髁松质骨结构构成、物质转运、能量代谢和细胞增殖与凋亡等方面.

目的:探讨中等强度有氧运动对大鼠心房肌蛋白质组及其基因差异表达的影响,为运动心脏重塑和慢性心血管疾病康复研究提供研究依据.方法:20只雄性SD大鼠按照体重随机配对分为对照组、实验组(n=10),实验组大鼠每次按照速度24 m·min-1、持续训练40 min(负荷强度相当于60％ ～70％VO2max),每周训练6 d,持续训练4周中等强度有氧运动.应用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离心房肌蛋白质点,串联飞行时间质谱仪技术鉴定电泳结果中表达量上调≥5倍以上,下调至1/5以下的13个备选目标蛋白质点.并对其中6个目标蛋白质用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测其mRNA.结果:通过软件分析,实验组与对照组比较,其中表达量下调至20％以下的点8个,上调5倍及以上点有5个,质谱鉴定分析其中的13个蛋白质点,最终鉴定出8种蛋白质和一个分子量为54 KDa的未知蛋白,包括:丙酮酸脱氢酶E1α1、线粒体乌头酸水合酶、蛋白质二硫键异构酶A3、甲基丙二酸半醛脱氢酶[酰基]、线粒体二氢硫辛酸脱氢酶、异戊酰辅酶A脱氢酶、谷胱甘肽合成酶、丝裂素活化蛋白激酶3等.RT-PCR检测结果表明,与对照组相比,4周中等强度有氧运动后,大鼠心房肌中甲基丙二酸半醛脱氢酶的mRNA表达量降低(P<0.05),线粒体二氢硫辛酸脱氢酶、蛋白质二硫键异构酶A3、线粒体乌头酸水合酶、谷胱甘肽合成酶的mRNA表达量降低(P>0.05);异戊烯辅酶A脱氢酶的mRNA表达量增高(P>0.05),表明mRNA表达水平与质谱鉴定结果的变化不完全一致.结论:4周的中等强度有氧运动诱导大鼠心房肌蛋白质组发生显著变化,有13个明显变化的目标蛋白,多数为能量物质代谢酶,这些目标蛋白质的变化与其mRNA表达量的变化并不完全一致,表明中等强度运动可能影响这些目标蛋白质上游基因转录的调控,也可影响下游翻译、修饰等的调控,导致表达的差异变化.

背景:课题组前期研究发现鹿角胶小分子肽富含促进骨生长的肽链,对骨髓间充质干细胞具有良好的促增殖、促成骨化作用.目前对鹿角胶防治股骨头坏死的研究仅停留在物质基础及药效学研究方面,其作用机制及作用靶点尚未明确.目的:基于蛋白质组学初步探讨鹿角胶治疗股骨头坏死的作用机制.方法:SPF级雌性Wistar大鼠36只,随机分为空白组、模型组、鹿角胶组,后2组大鼠灌胃维甲酸70 mg/kg,每日1次,连续灌胃8周,建立股骨头坏死大鼠模型;空白组大鼠不做处理.造模8周后鹿角胶组大鼠给予鹿角胶0.35 g/kg,模型组、空白组予同体积0.9％氯化钠溶液,每天灌胃1次,连续给药8周.通过骨组织病理切片检验造模是否成功及鹿角胶对股骨头的修复效果.通过非标(Label-free)蛋白质组定量技术研究各组之间的差异蛋白情况,根据GO和KEGG数据库分析对差异蛋白的生物功能及参与的信号通路进行富集;采用蛋白质互作STRING Database构建靶点蛋白相互作用图.实验方案经山东省中医药研究院动物实验伦理委员会批准.结果 与结论:①骨组织病理切片结果显示,鹿角胶可有效修复股骨头坏死;②蛋白质组学共鉴定蛋白1457种,空白组与模型组、模型组与鹿角胶组共同差异蛋白共有353种,其中,在模型组升高或降低的差异蛋白,经过鹿角胶干预后明显回调的蛋白有97种;③鹿角胶治疗股骨头坏死的作用机制涉及到血液循环、能量代谢、炎症反应及免疫过程,利用差异蛋白质组学寻找的蛋白质二硫键异构酶(P4HB)、钙黏蛋白2(CDH2)、膜联蛋白A2(ANXA2)、枯草杆菌前蛋白转换酶/可信9型(PCSK9)、乳脂球-表皮生长因子8(MFGE8)、骨形态发生蛋白等可能是鹿角胶的重要靶点,鹿角胶可能通过调控转化生长因子β、糖酵解/糖异生、PI3K-Akt信号通路等治疗股骨头坏死.

目前恶性肿瘤已经成为威胁人类身体健康的主要疾病之一,致死率、致残率在逐年上升.蛋白质二硫异构酶A3(PDIA3)是PDI家族中重要的一员,是一种功能广泛的硫醇氧化还原酶,其在多种肿瘤中的表达含量升高,与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关.尽管大量研究表明,PDIA3在许多肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用,但目前尚无系统的报道PIDA3在消化系统肿瘤中的作用.因此,该文综述了PDIA3在4种消化系统肿瘤中的不同表达情况及临床意义,探讨其在不同癌症发展阶段或临床预后中的作用,进一步寻找有效的早期诊断和基因治疗的潜在靶点.这对提高肿瘤患者的生存率具有十分重要的意义.