目的:建立转座子突变文库，筛选高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKp)的新毒力基因。 方法:构建转座子突变文库，血清处理，通过转座子测序(transposon sequencing, Tn-seq)比较分析血清处理前后各基因突变株在文库中丰度变化，并对筛选出的基因进行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释和富集分析。结果:以处理后丰度低于初始丰度20%为界，共筛选出405个基因，其中351个基因在HS11286、NJST258_1、NTUH-K2044和RJF293等4株参考菌株中保守存在，占86.7%，10个基因为NTUH-K2044和RJF293两株高毒力株共有而低毒力株HS11286和NJST258_1缺失；荚膜多糖基因簇中基因如糖基转移酶基因 wzy、聚集蛋白基因 wzi、荚膜转运蛋白基因 wza等突变株在血清处理后不能检出，气杆菌素、沙门氏菌素等铁载体基因簇在各文库中的丰度变化不超过1倍；KEGG注释结果显示，注释最多的基因为参与氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢、碳水化合物代谢等。 结论:Tn-seq是功能基因筛选的可靠方法，本研究成功筛选出405个hvKp的候选新毒力基因，为后续深入研究hvKp的新毒力基因功能和调控机制提供实验依据。

目的:分析黏质沙雷菌携带KPC-2型碳青霉烯酶的相关质粒特征。方法:4株碳青霉烯类抗生素耐药的黏质沙雷菌来自2016年我院肝胆病区的4位患者，使用仪器BD Phenix-100鉴定菌株并测定最小抑菌浓度(MIC)，脉冲场凝胶电泳分析菌株之间的同源性，改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型，PCR及产物测序检测基因型，接合试验检测质粒的转移性，质粒全基因组测序后比对，并分析其特征，使用软件DNAMAN比对复制起始蛋白氨基酸序列，软件MEGA7.0 Neighobor-Joining法构建系统发育树。结果:4株黏质沙雷菌对碳青霉烯类抗生素均表现耐药，菌株具有同源性，Hodge试验为阳性，碳青霉烯酶基因型为 blaKPC-2，接合试验阳性；质粒为42 742 bp的环状DNA，具有incX6质粒的类似骨架和相似的复制起始蛋白氨基酸序列，并和incX6具有共同的节点； blaKPC-2处于由Tn3家族转座子、重组酶基因、△ISKpn6和ISkpn27等插入元件构成的耐药核心区。 结论:未知质粒类型为incX6-like， blaKPC-2位于质粒的△Tn6296转座子上；携带KPC-2的此类质粒的细菌应引起重视。

目的:分析一株同时产KPC-2和NDM-5碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐药基因特征。方法:肺炎克雷伯菌KPN-hnqyy分离自我院血液科一位患者的粪便标本，使用仪器BD Phenix-M50鉴定菌株并测定最小抑菌浓度；酶联免疫层析试验和PCR方法检测碳青霉烯酶基因型；接合试验检测相关质粒的转移性；PacBio和Illumina平台对菌株全基因组测序，并在BacWGSTdb数据库中检索菌株MLST分型、耐药基因和质粒类型，使用软件Easyfig_2.2.3比对基因组和开放读码框序列，BRIG v0.95生成可视化质粒圈图。结果:肺炎克雷伯菌KPN-hnqyy对碳青霉烯类抗生素耐药，MLST分型为ST11型， blaKPC-2和 blaNDM-5碳青霉烯酶基因阳性；接合子 blaKPC-2基因阳性， blaNDM-5阴性；全基因组测序显示菌株含有1个染色体和3个质粒；肺炎克雷伯菌KP69和KP19-2029等与本研究菌株染色体基因组相似性大于99.9%，且其各自携带的不同种类的质粒上含有相似的IncR和IncFⅠ耐药基因融合区， blaKPC-2基因位于此融合区中一个由Tn3-△Tn4401-Tn1721/Tn1722序列演化而来的两端插入IS26转座酶基因的结构中； blaNDM-5基因位于一种含有噬菌体插入片段特殊质粒的Ⅰ型转座子上，两端也插入了IS26转座酶基因。 结论:ST11型肺炎克雷伯菌携带 blaKPC-2的IncR和IncFⅡ耐药基因融合区与染色体基因组可能一起广泛存在，特殊质粒携带的 blaNDM-5基因可能是通过IS26转座元件介导的基因重组方式偶然获得；携带 blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌在中国广泛传播并能通过IS26转座元件获得其他碳青霉烯酶基因的能力应引起重视。

新麦草(Psathyrostachys juncea)被认为是赖草属植物的一个重要祖先物种.对新麦草中高度重复序列Cot-1 DNA文库克隆测序分析鉴定,结果表明新麦草Cot-1 DNA文库中的序列可以分为6种类型:反转座子、转座子、卫星DNA、抗病相关LZ-NBS-LRR、未能鉴定类型、反转座子LTR和LTR/Copia类型序列组合型,占比分别为49.5％、1.0％、28.7％、5.9％、13.9％和1.0％.进一步利用2种卫星DNA序列和5个反转座子序列为探针,对新麦草、赖草(Leymus secalinus)和 2个大赖草(L.racemosus)材料进行染色体荧光原位杂交,结果表明卫星DNA序列TaiI-family和pSc250-family杂交信号主要分布在染色体的端部,TaiI-family杂交信号数量分别为20、16、7和18,而卫星DNA序列pSc250-family在新麦草、赖草中的杂交信号数量分别为17和24,在2个大赖草材料均没有信号检出.反转座子序列在3个物种染色体上基本呈散布分布方式,而且在赖草属物种染色体分布呈现同质化倾向,其中克隆序列pPj-44和pPj-28在新麦草和赖草属物种间信号分布差异显著,分别提示在异源多倍化过程中存在序列扩张和收缩,克隆序列pPj-77仅在1个大赖草材料10个染色体杂交信号强度区别于其余染色体.研究结果表明,新麦草重复序列在赖草多倍体形成过程发生了快速进化并可能存在同质化扩散,同时赖草属不同物种基因组间重复序列组成可能存在显著差异.

[背景]沙门氏菌(Salmonella spp.)是重要的人畜共患病原菌,其毒力和耐药性的不断增强引起广泛关注.[目的]了解从通辽市一犊牛死亡病例中所分离牛源都柏林沙门氏菌的毒力及耐药性情况.[方法]以病死犊牛肺脏为材料,经细菌分离纯化及 16S rRNA基因测序,鉴定病原为沙门氏菌.采用动物试验、药敏试验和PCR方法对分离菌进行毒力、耐药性,以及毒力基因和耐药基因检测,并对其进行全基因组测序分析.[结果]分离菌具有较强毒力,对小鼠半数致死量为2.8×106 CFU/mL.分离菌为多重耐药菌,仅对多粘菌素B和噻孢霉素敏感,对强力霉素和恩诺沙星中度敏感.检测 13 种沙门氏菌常见毒力基因,检出率为 92.3%.对分离菌进行全基因组测序分析,该菌株为都柏林沙门氏菌,基因组大小为 4 965 370 bp,GC含量为 52.12%,同时携带 2 个质粒,大小分别为 79 524 bp(pTLS-1)和 45 301 bp(pTLS-2).分离菌中共携带 996 个毒力基因和24 个毒力岛;共携带 42 个耐药基因,其中 4 个为可水平转移基因,基因组中存在 9 个可移动遗传元件,包括插入序列和转座子等.[结论]分离牛源都柏林沙门氏菌菌株具有较强毒力且为多重耐药株,携带大量毒力基因及耐药基因.

目的 分析来自假单胞菌的IncpGRT1质粒的基因组结构和遗传特征,阐明其潜在的传播风险.方法 对临床分离菌株15420352进行分纯和保种后提取基因组DNA,随后进行全基因组测序.测序获得了质粒p420352-strA的完整序列,并对其进行质粒型别判断.对所有5个已测序的同型别质粒进行了骨架区和外源插入区的精细注释,其中包括本研究中测序的1个质粒p420352-strA和来自GenBank的4个质粒.主要通过RAST、Plasmidfinder、Blast、ResFinder和IS-finder等核定质粒的ORFs并筛查耐药毒力等相关的关键基因.结果 5个质粒被划分为新的IncpGRT1型质粒.它们均存在保守的IncpGRT1骨架标记,除主复制子repAIncpGRT1外,还筛查到这些质粒均获取了一个辅复制子.5个IncpGRT1质粒携带了至少3个不同的主要外源插入区:srp区域、msr区域、Tn5053家族转座子.这些质粒中共发现3个已知的涉及2类抗生素耐药和重金属抗性的基因:strA、strB、mer.并发现在这些质粒里携带了至少1种毒力因子msr和5种关键的转运蛋白srp、emrE、mod、phn及lpt.结论 IncpGRT1型质粒已经成为一些耐药基因及毒力基因在假单胞菌属中积累和传播的重要载体,并提高了菌株的环境适应性.

目的 获得瑞香狼毒Stellera chamaejasme转录组数据库代谢途径基因序列、SSR以及转座子等信息.方法 以瑞香狼毒根作为受试材料,采用二代测序方法中的Illumina HiSeq 2000进行转录组测序,并进行系统的生物信息学分析.结果 共获得26 785 872个Clean reads片段,拼接得到47 053条Unigenes,平均长度为419nt.将拼装所得到的Unigene序列利用BLAST工具分别与Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库进行比对,分别有11 138和24 744条Unigene在Nr和Swiss-Prot数据库中比对得到了注释信息,可归于36个GO分类,涉及119个KEGG标准代谢通路,进一步分析发现15条萜类生物合成途径的关键酶基因.利用MISA软件发现3 480个SSR,数量最高的SSR类型为单碱基重复,为1 986条,出现频率为57.07％,最少的是六碱基重复SSR,只有5条,出现频率仅为0.14％.利用RepeatMasker在线工具针对瑞香狼毒转录组序列进行转座子预测分析,结果共发现有1 497条转座子,其中E值＜1×10-5的序列有827条,包含22种类型转座子,数目最多的为LINE/L1类型(405条),占比为48.97％,占比最少的为DNA/Ginger、DNA/hAT、DNA/PIF-ISL2EU和LINE/Jockey以及LTR/Lenti类型分别只有1条.结论 对瑞香狼毒进行高通量测序,获得了大量基因序列信息以及SSR和转座子信息,为今后分离克隆瑞香狼毒中佛波酯等有效成分生物合成的关键酶基因以及开展相关分子机制研究提供了数据资源和理论基础.

目的 探讨耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌的转座子基因Tn2006、Tn2008分布及其同源性,为医院感染控制提供实验室依据.方法 收集91株对碳青霉烯类药物耐药的非重复鲍曼不动杆菌,PCR检测转座子基因Tn2006和Tn2008,并对扩增产物进行测序及BLAST分析;采用重复序列引物聚合酶链反应(REP-PCR)分析CRAB同源性;采用多位点序列分型(m-ultilocussequence typing,MLST)技术对23株CRAB进行同源性分析,利用BioNumerics软件分析最小生成树.结果 在检测的91株CRAB中,40株菌Tn2006基因阳性,Tn2008基因均为阴性;利用REP-PCR方法可将91株CRAB分为A、B、C、D、E、F和G 7个型别,菌株数分别为79株、4株、2株、2株、1株、2株和1株,A型又分为A1和A2两个亚型,分别为46株和33株,所有被检测医院均出现A型菌株;利用MLST分型方法可将23株CRAB分为8个序列型别(ST型),其中ST92型9株、ST195型5株、ST365型3株、ST138型2株、ST75型和ST381型各1株,发现2个新STs型,即STnl(1-15-3-2-2-56-3)和STn2(1-81-3-2-2-3-3).结论 本地区临床分离CRAB存在克隆流行,以A型为主,主要通过转座子Tn2006进行传播,ST92和ST195是本地区CRAB主要ST分型.

为了揭示F系和A+系的遗传差异以及解析F系的遗传特征,研究基于前期基因组Survey分析发现一个特异于银鲫F系大小为782 bp片段的基础,首先采用混合池筛选方法从银鲫F系BAC文库中筛选出一个包含该特异片段的BAC克隆(F782-BAC).鸟枪法测序结果表明,F782-BAC序列全长大小为172625 bp,富含转座子序列,包含1个具备完整结构的Tc l-like转座子,以及不具备完整结构的transposase-like、PIF/Harbinger、target-primed reversed transcription(TPRT)和transpon X-element等6个转座子.用地高辛标记F782-BAC质粒得到的DNA探针进行了银鲫F和A+系有丝分裂中期相的染色体荧光原位杂交,结果表明不论是在F系还是A+系的有丝分裂中期相中,3个阳性荧光信号皆清晰地定位于3条大小相同的近端着丝粒染色体短臂的近着丝粒位置.进一步开展了银鲫A+系相应同源的F782-BAC序列的差异鉴定和序列分析,揭示A+系缺失了大小为3395 bp的一段序列,且特异于银鲫F系大小为782 bp的片段正好位于其中,并由此筛选出可作为区分银鲫F系和A+系的SCAR标记.研究为银鲫的多倍化起源提供了进一步的染色体定位证据,鉴定的SCAR标记可为银鲫分子标记辅助育种提供新的遗传标记.

目的 对携带氨基糖苷类耐药基因aacC2的阴沟肠杆菌质粒pA1137全序进行分析并研究其耐药机制.方法 PCR实验检测相关菌株耐药基因,接合转移实验验证质粒pA1137是否具备可转移特性,抗生素敏感实验检测相关菌株耐药谱,采用全基因组测序分析质粒基因环境、移动元件,并研究其耐药机制.结果 阴沟肠杆菌A1137同时携带碳青霉烯酶耐药基因blaIMP-8和氨基糖苷类耐药基因aacC2和aacA4.blaIMP-8和aacA4基因均位于染色体上,而aacC2基因则位于pA1137质粒上.pA1137是大小为68.97 kb的IncFⅡ型质粒,GenBank登录号为MF190369.该质粒含有典型的多复制子结构且有完整的接合转移区,可通过接合转移方式进入受体菌EC600并表达相应的耐药谱.结论 IncFⅡ型质粒pA1137有一个外源插入区,是首次发现基于Tn5403转座子的aacC2-tmrB相关耐药区,可稳定遗传并介导阴沟肠杆菌A1137对氨基糖苷类抗生素耐药.