目的:建立转座子突变文库，筛选高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKp)的新毒力基因。 方法:构建转座子突变文库，血清处理，通过转座子测序(transposon sequencing, Tn-seq)比较分析血清处理前后各基因突变株在文库中丰度变化，并对筛选出的基因进行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释和富集分析。结果:以处理后丰度低于初始丰度20%为界，共筛选出405个基因，其中351个基因在HS11286、NJST258_1、NTUH-K2044和RJF293等4株参考菌株中保守存在，占86.7%，10个基因为NTUH-K2044和RJF293两株高毒力株共有而低毒力株HS11286和NJST258_1缺失；荚膜多糖基因簇中基因如糖基转移酶基因 wzy、聚集蛋白基因 wzi、荚膜转运蛋白基因 wza等突变株在血清处理后不能检出，气杆菌素、沙门氏菌素等铁载体基因簇在各文库中的丰度变化不超过1倍；KEGG注释结果显示，注释最多的基因为参与氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢、碳水化合物代谢等。 结论:Tn-seq是功能基因筛选的可靠方法，本研究成功筛选出405个hvKp的候选新毒力基因，为后续深入研究hvKp的新毒力基因功能和调控机制提供实验依据。

[背景]金黄色葡萄球菌是重要的致病菌,其中促凝聚是重要的致病机制之一,可能存在新的基因参与其中.[目的]通过采用血浆凝集降低方法筛选及鉴定促凝相关基因.[方法]利用转座子随机插入突变技术建立金黄色葡萄球菌转座子突变文库,采用动态比浊及试管凝集技术筛选凝集能力降低的突变株;应用抗性标记挽救法鉴定突变基因并应用生物信息学预测基因的功能.[结果]通过观察血浆凝集能力降低共计筛选到突变菌株82个.鉴定其中的76个突变菌株的转座子插入位点,涉及基因13个,包括报道的与促凝集有关基因4个(占筛选基因的30.8％).[结论]从金黄色葡萄球菌凝集能力降低筛选与促凝集可能有关的基因,为金黄色葡萄球菌促凝集基因的筛选提供了新策略,同时为了解该菌促凝集过程提供了候选基因.

为研究睡美人(Sleeping Beauty,SB)转座子系统在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾脏细胞(CIK)中介导的整合特性,构建了SB转座子和转座酶在两个质粒的二元反式(trans)转座子系统,以及转座子和转座酶元件在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子系统;通过转染CIK细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR分析了转染2d后及嘌呤霉素筛选4周后的细胞,测定DsRed转染效率和整合效率,并结合高效热不对称交互式PCR扩增获得SB转座子整合位点的序列.结果表明, SB二元转座子系统的整合效率远高于一元系统; SB转座子与转座酶比例为1:2时,外源基因DsRed的整合效率最高;SB转座子偏向于插入草鱼基因组TA序列处.研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在草鱼细胞中的整合效率并快速获得突变细胞, 同时为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础.

为了开发丙酮酸高产菌株,以大肠杆菌MG1655为出发菌株,通过基因敲除阻断副产物途径构建了产丙酮酸大肠杆菌工程菌KLPP.进一步利用pUT Mini-Tn5载体进行转座子随机突变,构建了含有7 197个单克隆的突变体文库.使用基于丙酮酸的二硝基苯肼显色法,建立了96孔板-酶标仪快速筛选方法,经过两轮的筛选,成功筛选到了6个突变体菌株,比KLPP丙酮酸产量提高了38％、31％、19％、28％、44％和14％.利用全基因组重测序确定了其转座子插入的位置,进而确定了可能影响丙酮酸产量的基因位点,为后续菌株改造工作奠定了基础.

[背景]南方根结线虫(Meloidogyne incognita)寄主范围广泛,能侵染茄科、豆科、葫芦科等蔬菜,对世界农业生产造成了严重危害,每年造成的损失可高达数百亿美元.蜡质芽胞杆菌(Bacillus cereus) AR156是一种革兰氏阳性杆状细菌,对于南方根结线虫引起的土传病害有较好的防治效果,并且已经完成了全基因组测序.[目的]了解AR156对南方根结线虫的生防机理,寻找与生防功能相关的基因,进行遗传功能基因的分析.[方法]构建蜡质芽胞杆菌AR156 miniTnl0随机插入突变体文库,通过对南方根结线虫致死率和温室防病试验进行筛选,找到与AR156生防能力相关的突变体,鉴定相关功能基因,并对产蛋白酶活性、定殖能力、生物膜形成和游动性等方面进行检测.[结果]与AR156野生型相比,转座子插入位点在M60家族肽酶的突变体BC41产蛋白酶活性下降,植物根围定殖能力减弱,生物膜形成能力和游动性受到影响,从而导致其防治南方根结线虫的能力降低.[结论]通过对生防相关功能基因的分析,初步明确M60家族肽酶在蜡质芽胞杆菌AR156防治南方根结线虫的过程中发挥重要作用.

菠萝泛菌(Pantoea ananatis)YJ76是从水稻“越富”品种中分离的优势内生菌,与宿主水稻互作时具有多种促生作用,其分泌的吲哚作为细菌种内及种间的信号分子参与调控多种生理生化行为.[目的]筛选获得与吲哚调控相关的突变株,鉴定突变位点并研究突变基因对菌株的生存适应性以及对宿主水稻定殖和促生的影响,为研究吲哚调控通路奠定基础.[方法]用双亲本接合法构建YJ76的mTn5转座子插入突变文库,以染色体步移TAIL-PCR技术鉴定突变基因,最后探究基因突变对菌体产生的影响.[结果]筛选到1株吲哚产量大幅上升的YJ76突变株M04,鉴定突变位点为一个长度195bp未报道过的新基因,将其命名为ipc(indole production control),基因突变后增强了YJ76对重金属、四环素和酸的抗性,也增强了菌体对宿主水稻定殖和促生的能力.[结论]吲哚产量上调的ipc突变株能够提高菌体生存适应性并增强其对宿主水稻定殖和促生的能力.

[背景]工业菌株的耐酸能力是发酵过程中的一大挑战.粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)作为肠杆菌科的一种细菌,可生成2,3-丁二醇、乙偶姻和灵菌红素等高附加值产品.然而目前对于粘质沙雷氏菌酸耐受能力的分子机制尚不清楚.[目的]通过对转录调控因子XrpA的挖掘以及对其功能的研究,探究粘质沙雷氏菌酸耐受能力的分子机制,为改善工业菌株耐酸能力提供新的策略.[方法]通过对粘质沙雷氏菌进行转座子插入突变,构建了一个Tn5G转座子插入突变文库,利用文库筛选了一株酸敏感型突变株,并对其进行测序鉴定;同时还对突变菌株中与耐酸相关关键基因的转录水平以及细胞膜通透性、细胞膜完整性和H+-ATPase的活性变化进行检测.[结果]发现了一个响应酸胁迫的转录调控因子BVG90_23400,其属于XRE超级家族转录调控因子,命名为XrpA.在酸性条件下,与野生型菌株(JNB5-1)相比,xrpA被阻断后导致了粘质沙雷氏菌多种表型的变化,其中包括生物量显著下降、H+-ATPase活性降低、细胞膜的通透性以及完整性受到破坏.[结论]XrpA影响粘质沙雷氏菌耐酸能力的分子机制是通过对细胞膜通透性、细胞膜完整性以及H+-ATPase活性的正向调节来维持细胞在酸性条件下的内环境稳态.同时,XrpA可以通过调节酸性应激反应基因的转录水平来影响细胞内环境稳态,从而调控粘质沙雷氏菌对低pH的耐受能力.

目的:利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sgRNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选.方法:构建PB-TRE-Cas9-NLS-IRES-hrGFP-Zeo载体,与PB-CAG-rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系;构建核受体基因sgRNA病毒文库,并感染可诱导表达Cas9的HeLa细胞系,筛选对顺铂具有抵抗性的克隆,并进行目的基因的测序鉴定.结果:挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株,在5个基因位点上可以进行高效编辑;感染sgRNA文库之后,挑选顺铂耐药的克隆,并鉴定出大部分克隆含有VDR sgRNA,经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变.结论:利用PiggyBac转座子系统,构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑,并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因.

[目的]在全基因组范围内鉴定十字花科黑腐病菌Xcc 8004中新的Ⅲ型效应物(type Ⅲsecreted effector,T3SE)基因.[方法]通过构建与AvrBsl59_445整合的Tn5转座子系统,进行文库筛选.在avrBsl缺失突变体背景下生成突变文库,在辣椒ECW-10R上进一步筛选.[结果]大规模HR测定筛选出7个具有明显过敏反应(hypersensitive response,HR)的克隆.通过质粒拯救和测序发现除了插入已知T3SE基因的3个突变体外,还鉴定了一个位于XC_0438和XC_0439之间且在Xcc 8004中未注释的新基因.结合生物信息学,我们将其命名为一个新的基因XC 0438a.易位实验证实XC 0438a信号区可引导报告蛋白AvrBs1的分泌和易位,并诱导辣椒ECW-10R产生HR反应.β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)活性测定,XC_0438a在基本培养基中诱导表达,并由关键调控蛋白HrpG和HrpX激活.然而,在我们的实验条件下,XC_0438a对Xcc的致病力没有显著的贡献.[结论]我们鉴定了一种新的依赖于Ⅲ型分泌系统的效应基因XC_0438a.

随着新的微生物资源不断被发现以及微生物基因组测序数据的积累和完善,目前研究重点和难点是如何从大量数据中快速发现和鉴定与微生物重要表型相关的功能基因,这就需要高通量的分析研究手段,主要涉及建库和筛选两个主要技术单元.其中,建库是指构建能够覆盖微生物全基因组的突变或干扰文库,所涉及的技术包括宏基因组、转座子插入突变、RNA干扰(RNA interference,RNAi)、反转录子文库重组工程(retron library recombineering,RLR)、CRISPR 抑制(CRISPRi)和CRISPR激活(CRISPRa)等.筛选则是通过某种胁迫压力来促使文库菌群的差异化生长,并结合高通量测序全面发掘与特定表型相关的功能基因,从而为后续研究提供有效信息.本文对功能基因组学研究中现有的高通量分析技术进行了梳理、总结和展望,以期为这类技术方法的拓展、优化以及应用提供参考.