目的:原核表达淋病奈瑟球菌MetQ蛋白，采用鼻腔免疫途径初步评估MetQ蛋白的免疫保护效果。方法:利用基因重组技术构建pCold TF-metQ- E.coli BL21表达菌株，并进行MetQ蛋白的表达纯化。将6 ~ 8周龄BALB/c雌性小鼠随机分两组，每组6只，MetQ组：MetQ蛋白+霍乱毒素B亚单位（CTB）佐剂等比例混匀后对小鼠进行鼻腔滴注，10 μg/只；磷酸盐缓冲液（PBS）组：鼻腔滴注等比例、等剂量的PBS + CTB佐剂。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测MetQ组末次免疫后3只小鼠的血清及阴道分泌物中的抗体效价。免疫印迹分析MetQ在不同淋病奈瑟球菌中的表达情况。间接ELISA分析MetQ抗血清与全菌抗原的结合能力。评估MetQ抗血清对淋病奈瑟球菌的杀菌活性以及对ME-180细胞的黏附抑制作用。计量资料以 ± s表示，不同处理组间比较采用 t检验。 结果:成功表达去除信号肽的MetQ蛋白。MetQ组小鼠经鼻腔免疫后血清能检测到特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgA抗体，抗体滴度分别达1 × 10 7、1 × 10 5、2 × 10 4、1 × 10 2，阴道分泌物能检测到特异性IgG、IgA抗体，抗体滴度分别达1 × 10 3和1 × 10 2。免疫印迹结果显示，MetQ蛋白在8株淋病奈瑟球菌中均有表达。间接ELISA结果显示，MetQ抗血清与淋病奈瑟球菌全菌抗原结合能力为20。血清杀菌力实验结果显示，与无血清对照组（100%）相比，MetQ抗血清的有效杀菌滴度可达1∶320（淋病奈瑟球菌存活率：46.33% ± 6.67%， t = 8.05， P = 0.001），MetQ抗血清稀释1∶160、1∶640时，淋病奈瑟球菌存活率分别为22.01% ± 6.80%（ t = 11.47， P <0.001）、84.55% ± 6.99%（ t = 2.21， P > 0.05）。黏附抑制实验结果显示，与无血清对照组（100%）相比，MetQ抗血清稀释1∶20、1∶40、1∶80能抑制淋病奈瑟球菌对ME-180细胞的黏附作用（淋病奈瑟球菌黏附率= 17.25%、28.23%、54.51%， t = 48.44、31.88、7.29，均 P<0.05）。 结论:MetQ蛋白在不同淋病奈瑟球菌中均有表达，经鼻腔免疫小鼠后能在血清及阴道分泌物中检测到高效价的特异性抗体。MetQ抗血清与淋病奈瑟球菌有较好的亲和性，并具有较好的血清杀菌活性及抗体黏附抑制作用，是一种有潜力的淋病奈瑟球菌疫苗候选蛋白。

目的:建立转座子突变文库，筛选高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKp)的新毒力基因。 方法:构建转座子突变文库，血清处理，通过转座子测序(transposon sequencing, Tn-seq)比较分析血清处理前后各基因突变株在文库中丰度变化，并对筛选出的基因进行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释和富集分析。结果:以处理后丰度低于初始丰度20%为界，共筛选出405个基因，其中351个基因在HS11286、NJST258_1、NTUH-K2044和RJF293等4株参考菌株中保守存在，占86.7%，10个基因为NTUH-K2044和RJF293两株高毒力株共有而低毒力株HS11286和NJST258_1缺失；荚膜多糖基因簇中基因如糖基转移酶基因 wzy、聚集蛋白基因 wzi、荚膜转运蛋白基因 wza等突变株在血清处理后不能检出，气杆菌素、沙门氏菌素等铁载体基因簇在各文库中的丰度变化不超过1倍；KEGG注释结果显示，注释最多的基因为参与氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢、碳水化合物代谢等。 结论:Tn-seq是功能基因筛选的可靠方法，本研究成功筛选出405个hvKp的候选新毒力基因，为后续深入研究hvKp的新毒力基因功能和调控机制提供实验依据。

目的:探索盐酸美金刚(memantine hydrochloride, MEM)促进中性粒细胞对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的杀菌作用并探索其分子机制。 方法:采用不同浓度的MEM与感染MRSA的中性粒细胞共孵育4 h后，取适量菌液涂LB平板培养、计数；收集共孵育后的中性粒细胞检测活性氧生成和中性粒细胞胞外诱捕网的释放情况。建立小鼠MRSA感染模型，给予或不给予MEM处理，收集血液、脾脏、肾脏进行菌落计数及血液中的降钙素原检测。MRSA感染小鼠后，腹腔注射MEM或PBS，记录48 h小鼠存活率，绘制生存曲线。结果:与未加MEM组相比，MEM处理后的混合培养液中MRSA数量显著减少，且在一定浓度范围内，MRSA的存活数随着MEM浓度的升高而减少。此外，MEM能显著促进中性粒细胞产生活性氧以及胞外诱捕网的形成。动物实验显示，MEM组小鼠血清降钙素原浓度显著降低，血液及脏器中的载菌量显著降低，48 h小鼠存活率较PBS组显著升高。结论:MEM能显著增强中性粒细胞对MRSA的杀菌作用，其机制可能是MEM促进了中性粒细胞活性氧和胞外诱捕网的产生。

目的:探究多西环素联合左氧氟沙星对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的体内外抗菌活性.方法:于宜春市人民医院收集临床分离的 8 株CRKP,体外采用微量肉汤稀释法测定多西环素和左氧氟沙星对 8 株CRKP的最小抑菌浓度(minimal inhibition con-centration,MIC),棋盘稀释法判断两药联用的抑菌效果,时间-杀菌曲线法进一步评价两药联合的杀菌作用.结晶紫染色半定量生物膜法测定两药联用对生物膜形成的抑制作用和消除作用.体内利用鼻腔滴注CRKP菌液建立小鼠肺部急性感染模型,记录小鼠精神状态及肺部组织荷菌量、血清炎性因子C反应蛋白(C-reac-tive protein,CRP)、白细胞介素(IL)-6 的水平和病理形态学改变等指标评估,分析多西环素联合左氧氟沙星对CRKP的体内抗菌活性.结果:多西环素对 8 株CRKP的MIC 为 4～256 ug·mL-1,左氧氟沙星对 8 株CRKP的MIC为16～256 ug·mL-1.棋盘法显示多西环素联合左氧氟沙星对8 株CRKP具有80%的协同或相加作用;时间-杀菌曲线显示,多西环素联合左氧氟沙星对CRKP2 和CRKP7 作用24h后使细菌数较初始细菌数降低≥2 lg CFU·mL-1,呈现抑菌或杀菌作用;结晶紫染色法结果表明,多西环素与左氧氟沙星联用对CRKP生物膜具有抑制和破坏作用;动物实验表明,与模型组相比,联合组小鼠精神状态良好,肺部组织荷菌量及CRP,IL-6 水平显著降低(P<0.001);HE染色结果表明,给药组较模型组肺泡结构清晰,炎性细胞减少,充血面积降低,差异均有统计学意义(P<0.001).结论:体外实验表明,多西环素联用左氧氟沙星对CRKP具有协同抗菌或杀菌作用,体内实验表明多西环素联用左氧氟沙星可降低炎性指标,有效治疗肺组织细菌感染,有较好的体内抗菌作用.

目的 探究多西环素联合利福平对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)体内外抗菌活性.方法 收集宜春市人民医院临床分离的非重复CRKP,测定多种常用抗菌药物对其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC).通过棋盘稀释法进行联合药敏试验,计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FIC)判定联合效果.体外时间-杀菌曲线观察联合杀菌作用.采用结晶紫染色法测定两药联用对生物膜形成的抑制作用及清除作用.鼻腔滴注法建立小鼠肺部肺炎克雷伯菌感染模型,检测鼠肺部细菌浓度变化、血清C-反应蛋白(CRP)、IL-6水平.HE染色观察肺组织病理形态学改变.结果 棋盘法显示多西环素联合利福平效果最好,两药联用时多西环素的MIC值从(4～256 μg/mL)下降到(2～8 μg/mL),利福平的MIC值从(16～256 μg/mL)下降到(2～16 μg/mL).时间-杀菌曲线显示,多西环素联合利福平对细菌作用24 h内,使细菌数较初始细菌数降低≥21gCFU/mL,呈现抑菌或杀菌作用.结晶紫染色法测定,联合组对细菌生物膜抑制生长和破坏作用较对照组差异性明显(P＜0.05).动物实验表明,联合组小鼠肺部组织细菌数、C-反应蛋白(CRP)、IL-6水平显著降低,感染情况明显改善,肺泡结构清晰,充血减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 体外实验表明,多西环素联用利福平对CRKP具有协同抗菌或杀菌作用,动物实验证实多西环素联用利福平可降低炎性指标,有效治疗肺组织细菌感染,有体内抗菌作用.此结果可供临床参考.

目的:表皮葡萄球菌是一种常引起院内感染的革兰阳性氏条件致病菌.抗生素的不合理使用导致其耐药性逐渐增高,药物再利用已成为难治性耐药菌感染治疗的研究热点.本研究拟探讨抗病毒性肝炎药物西咪匹韦对表皮葡萄球菌及其生物膜的体外抑制作用.方法:通过微量肉汤稀释实验检测西咪匹韦对表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC);采用结晶紫染色检测西咪匹韦对表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制作用;SYTO9/PI双荧光染色检测西咪匹韦对表皮葡萄球菌及其生物膜内活菌的杀菌作用;棋盘稀释实验检测西咪匹韦联用庆大霉素的抗菌活性,并通过绘制时间-抑菌曲线进一步验证其协同抗菌活性.结果:西咪匹韦对表皮葡萄球菌具有明显的抗菌活性,其对标准菌株和临床菌株的MIC和MBC分别为2～16 μg/mL和4～32 μg/mL.SYTO9/PI荧光染色进一步证明西咪匹韦对表皮葡萄球菌的杀菌作用.4 μg/mL的西咪匹韦可显著减少表皮葡萄球菌盖玻片上生物膜的形成并破坏生物膜的正常结构.MIC的西咪匹韦还可抑制TSB肉汤中导尿管表面表皮葡萄球菌的黏附作用,使黏附量从0.700±0.020减少到0.050±0.004(t=54.03,P<0.001),并可使马血清培养基中导尿管表面的黏附量从1.00±0.02减少到0.13±0.01(t=82.78,P<0.001).此外,西咪匹韦与庆大霉素联用还具有明显的协同抗菌作用,其协同抑菌指数为0.5.结论:西咪匹韦对表皮葡萄球菌具有显著的抗菌作用,且能有效抑制其生物膜的形成.

目的 考察薰衣草挥发油(essential oil of lavender,LEO)体外抑菌能力及对皮肤致敏性,为LEO体外抗菌应用提供依据.方法 采用纸片扩散法评价LEO对5种细菌体外抑菌效果,并测定其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC);通过外敷涂抹的方法观察LEO对豚鼠皮肤刺激性,评价其过敏反应程度以及过敏率;结合酶联免疫法检测二甲苯致敏以及涂抹LEO后的豚鼠血清和脾脏组织匀浆上清中免疫球蛋白A(immuneglobulin,IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)的水平,对LEO抑菌能力及皮肤外用致敏和致炎作用进行综合评价.结果 抑菌圈实验表明,LEO对表皮葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌这5种菌种均有抑菌效果,抑菌能力从强到弱依次为表皮葡萄球菌(8.25 mg/mL),大肠杆菌(15.00 mg/mL),白色念珠菌(16.31 mg/mL),金黄色葡萄球菌(18.00 mg/mL),痤疮丙酸杆菌(20.78 mg/mL);LEO外用涂抹不会引起豚鼠皮肤致敏和体内免疫球蛋白的异常反应;且与空白组比较,LEO外用涂抹对豚鼠脾脏重量差异无统计学意义(P＞0.05),对豚鼠血清及脾脏组织中的IgA、IgE、IgG水平影响差异无统计学意义(P＞0.05).结论 LEO对表皮葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌这5种常见致病菌有一定的抑菌作用,且外用涂抹安全,研究结果为LEO相关产品的开发以及在皮肤病领域的应用提供一定的参考借鉴.

目的 探究抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)及其不典型靶抗原在系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中的检测率及其临床意义.方法 选取2011年12月至2016年9月该院确诊的SLE患者共1128例作为研究对象,通过间接免疫荧光法(IIF)、免疫印迹法(WB)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测研究对象血清中典型与不典型ANCA水平,并分析ANCA及其不典型AN-CA与SLE临床症状及其他实验室检测结果的关系.结果 采用IIF与WB检测1128例SLE患者血清中ANCA,其在SLE中的阳性率为24.65％(278/1128),其中核周型(pANCA)阳性率为23.49％(265/1128),胞浆型阳性率为1.15％(13/1128).另随机选取121例pANCA阳性且抗髓过氧化物酶、抗蛋白酶-3阴性的SLE患者,采用ELISA进行其他6种相关不典型靶抗原确认试验.不典型靶抗原检出结果有24例抗乳铁蛋白(LF)抗体阳性,1例为LF与抗杀菌/通透性增强蛋白(BPI)抗体阳性,另1例有LF与弹性蛋白酶阳性同时检出,以及单独2例BPI阳性检出,不典型靶抗原阳性率为23.14％(28/121).结论 少数患者存在LF和BPI等非典型ANCA,此外,ANCA与SLE特定的临床表现(如皮肤血管炎等)及实验室检查指标有一定相关性,提示ANCA及其特异性靶抗原可能与SLE血管炎症的发病过程相关.

目的 利用中性粒细胞杀菌活性试验,检测毒力基因rmpA、rmpA2阳性和拉丝试验阳性的高毒力肺炎克雷伯菌抗中性粒细胞杀菌能力,验证该试验鉴定高毒力肺炎克雷伯菌的可行性.方法 收集浙江省2016年1月至2017年7月期间临床血流感染分离的150株非重复肺炎克雷伯菌.采用PCR检测碳青霉烯类抗生素耐药基因(blaKPC,blaNDM,blaIMP-1,blaIMP-2)、荚膜血清型(K1,K2,K5,K20,K54,K57)和毒力基因(rmpA,rmpA2,iucA,iroN).将拉丝试验阳性和毒力基因rmpA、rmpA2阳性的菌株定义为高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP),拉丝试验和毒力基因rmpA、rmpA2阴性的菌株定义为经典肺炎克雷伯菌(cKP).采用中性粒细胞杀菌活性试验检测肺炎克雷伯菌的毒力,细菌的存活率计算方式为:加中性粒细胞共孵育的实验组菌落形成单位(CFU)/不加中性粒细胞共孵育的对照组CFU.结果 150株肺炎克雷伯菌中检测到65株携带rmpA2毒力基因,占43.3％.在rmpA2阳性菌株中,rmpA、iroN、blaKPC和K2的检出率分别为73.8％、80.0％、75.4％和40.0％,拉丝试验阳性率为36.9％;中性粒细胞杀菌试验中,hvKP组菌株和cKP组菌株的存活率分别为0.866±0.056和0.368±0.058,两组存活率差异有统计学意义(P<0.001).结论 分离自浙江省携带rmpA、rmpA2毒力基因和拉丝试验阳性的hvKP经中性粒细胞处理后仍有非常高的存活率,中性粒细胞杀菌活性试验阳性,该试验是一个鉴定肺炎克雷伯菌毒力简单有效的方法.

目的 通过对2010-2016年间09CS针对13个型别的肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体滴度的分析,探讨调理吞噬杀菌试验(multiplexed opsonophagocytic killing assays,MOPA)的长期稳定性.方法 统计2010-2016年检测人肺炎链球菌质量控制血清(质控血清)09CS中针对1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F共13个血清型的OPKA滴度,分别计算2010、2011、2012、2013、2014-2016年09CS针对各个型别的OPKA滴度的GMT值及其95％可置信区间;统计09CS针对13个血清型的OPKA滴度在质量控制范围之内的比率;计算2010-2016年09CS针对13个血清型各型别的OPKA滴度CV值.结果 从OPKA滴度来看,2010年普遍较低,而2011年、2012年、2013年、2014-2016年这几年间的09CS针对13个血清型的滴度结果稳定.2011-2016年期间检测结果在质控血清滴度范围的比率:2010年最低值是4％,均值为30％;2011年最低值是65％,均值为80％;2012年最低值是73％,均值为85％;而2013年最低值为77％,均值为94％;2014-2016年最低值为71％,均值为90％.2010-2016年09CS针对13个血清型的OPKA滴度各型别CV:各年份的平均值分别为:125％、64％、47％、41％和39％.结论 充分证明了从2011年起本实验室建立的MOPA稳定性良好.