目的 建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用.方法 选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14 作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25 作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA.分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测.结果 该方法确定的捕获抗体AM14 包被浓度为 1.25 μg/mL,检测抗体D25 浓度为0.50 μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA).方法验证结果显示,线性范围为 1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为 87.41%～117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为 5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在 87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测.结论 成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点.

目的:探讨芍药苷对脓毒症心脏微血管内皮细胞（CMECs）通透性的影响及机制。方法:体外分离并原代培养大鼠CMECs细胞，待细胞进入对数生长期用于实验。采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）筛选出芍药苷的安全有效浓度10、20、40 μmol/L。将细胞分为空白对照组、脂多糖（LPS）组及低、中、高浓度芍药苷预处理组。空白对照组用完全培养基培养；LPS组在完全培养基中加入1 mg/L的LPS刺激细胞；芍药苷预处理各组分别于LPS刺激前4 h加入10、20、40 μmol/L芍药苷进行预处理。各组细胞于LPS刺激后继续培养24 h，采用辣根过氧化物酶（HRP）法检测大鼠CMECs细胞通透性；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清液中CXC趋化因子配体（CXCL1、CXCL2）水平；采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达；采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测细胞中磷酸化Src（p-Src）、血管内皮-钙黏蛋白（VE-cadherin）、磷酸化丝裂素活化蛋白激酶（p-MAPK）的蛋白表达。结果:与空白对照组相比，LPS组大鼠CMECs细胞通透性明显增加；经不同浓度芍药苷预处理后细胞通透性均有一定程度改善，以40 μmol/L芍药苷组改善最明显，与LPS组比较差异有统计学意义（ A值：1.61±0.07比2.13±0.06， P<0.01）。ELISA结果显示，空白对照组大鼠CMECs细胞上清液中有适量CXCL1、CXCL2分泌；但在LPS诱导下，细胞上清液中CXCL1、CXCL2分泌量明显增加；给予不同浓度芍药苷预处理后细胞上清液中CXCL1、CXCL2的分泌量均明显减少，其中40 μmol/L芍药苷对CXCL1的抑制作用最佳，20 μmol/L芍药苷对CXCL2的抑制作用最佳，与LPS组比较差异均有统计学意义〔CXCL1（ng/L）：337.51±68.04比829.86±65.06，CXCL2（ng/L）：4.48±0.11比9.41±0.70，均 P<0.01〕。RT-qPCR结果显示，大鼠CMECs细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达与ELISA结果一致，表现为LPS能够诱导大鼠CMECs细胞中CXCL1、CXCL2的mRNA表达增加；而不同浓度芍药苷预处理后能够明显降低CXCL1、CXCL2的mRNA表达，40 μmol/L芍药苷对CXCL1 mRNA表达的抑制效果最佳，20 μmol/L芍药苷对CXCL2 mRNA表达的抑制效果最佳，与LPS组比较差异均有统计学意义〔CXCL1 mRNA（2 -ΔΔCt）：0.543±0.004比0.812±0.089，CXCL2 mRNA（2 -ΔΔCt）：10.52±0.71比17.68±1.09，均 P<0.01〕。Western Blot结果显示，空白对照组大鼠CMECs细胞中有适量p-Src、VE-cadherin和p-MAPK蛋白表达；LPS刺激后大鼠CMECs细胞中p-Src、p-MAPK蛋白表达明显增加，而VE-cadherin蛋白表达明显下降；经不同浓度芍药苷预处理后，细胞中p-Src、p-MAPK蛋白表达有不同程度降低，但VE-cadherin蛋白表达则呈升高趋势，以40 μmol/L芍药苷组效果最佳，与LPS组比较差异均有统计学意义〔p-Src蛋白（p-Src/GAPDH）：1.02±0.09比1.29±0.05，p-MAPK蛋白（p-MAPK/GAPDH）：0.24±0.02比0.62±0.02，VE-cadherin蛋白（VE-cadherin/GAPDH）：0.64±0.03比0.31±0.02，均 P<0.01〕。 结论:芍药苷能够通过调节CMECs细胞中Src/VE-cadherin通路，抑制炎症相关蛋白及趋化因子的表达和分泌，改善LPS诱导的CMECs细胞通透性。

目的:制备兔抗长爪沙鼠免疫球蛋白G1（IgG1）和IgG2的特异性多克隆抗体，并用于蛋白质免疫印迹（WB）和ELISA检测。方法:利用质粒-大肠埃希菌系统分别高效表达密码子优化的长爪沙鼠免疫球蛋白IgG1和IgG2重链恒定域CH2和CH3重组蛋白，纯化后免疫新西兰大白兔，分离并纯化获得相应的兔多克隆抗体，用辣根过氧化物酶（HRP）标记后分别作为一抗应用于WB和作为二抗应用ELISA。结果:IgG1和IgG2重组蛋白在大肠埃希菌中可高效表达并都以包涵体形式存在，I相对分子质量分别为24 800和21 200，与预期相符。其纯化后作为免疫原可诱导兔产生相应的多克隆抗体，HRP标记后用于WB可以特异性地识别重组蛋白长爪沙鼠IgG1-CH23和IgG2-CH23，用于ELISA能检测柯萨奇病毒A16型感染长爪沙鼠后诱导产生的特异性IgG抗体。结论:成功制备了兔抗长爪沙鼠免疫球蛋白IgG1和IgG2的特异性多克隆抗体，为长爪沙鼠特异性抗体血清学检测提供了有效工具。

目的:观察摩腹法干预前后广泛性焦虑症（GAD）大鼠模型情感环路各核团组织的结构与功能变化，探讨摩腹法干预GAD的中枢调节机制。方法:将60只Wistar雄性大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组和摩腹组，每组20只。模型组和摩腹组均采用慢性情绪应激法建立GAD大鼠模型，并以高架十字迷宫实验对其进行评价。摩腹组大鼠建立GAD模型后给予摩腹干预，每天治疗1次，每次10 min，连续治疗14 d；模型组大鼠建立GAD模型后每天被束缚于实验台10 min，不予治疗，连续14 d；空白组大鼠不予任何干预。采用辣根过氧化物酶（HRP）逆行追踪标记技术检测各组大鼠情感环路核团组织的结构变化，采用液相色谱-质谱联用技术检测各组大鼠情感环路核团组织神经元代谢产物N-乙酰天冬氨酸（NAA）、谷氨酸、胆碱复合物（Cho）和肌酸的相对浓度变化。结果:与空白组相比，模型组大鼠情感环路中HRP标记细胞分布较少，情感环路活动较弱；模型组大鼠左侧海马组织中的NAA/肌酸比值明显升高（0.94±0.08比0.79±0.10， P<0.05），右侧海马组织中的谷氨酸/肌酸比值明显降低（0.95±0.10比1.12±0.13， P<0.01），左侧皮质组织中的NAA/肌酸和谷氨酸/肌酸比值均明显降低（1.04±0.05比1.41±0.23，1.21±0.04比1.57±0.11，均 P<0.01）。与模型组相比，摩腹组大鼠海马组织中有大量HRP聚集并向四周组织扩散；摩腹组左侧海马组织中的NAA/肌酸与谷氨酸/肌酸比值明显降低（0.74±0.21比0.94±0.08，0.92±0.20比1.21±0.12，均 P<0.01），右侧海马组织中的谷氨酸/肌酸比值（1.01±0.23比0.95±0.10）与左侧皮质组织中的NAA/肌酸比值（1.12±0.09比1.04±0.05）和谷氨酸/肌酸比值（1.22±0.12比1.21±0.04）均较模型组升高，差异均无统计学意义（均 P>0.05）。 结论:摩腹法能有效增强情感环路活动，改善情感环路中海马组织与皮质组织神经元代谢产物的相对浓度，提示摩腹法治疗GAD的作用机制可能与其调节情感环路的结构与功能密切相关。

目的:建立血浆中游离甲氧基肾上腺素类物质的化学发光免疫检测方法并对检测方法部分性能进行确认。方法:将待测样品（校准品、血浆或质控品）进行萃取、酰化，处理后的待测物分别与固相化甲氧基肾上腺素（MN）、甲氧基去甲肾上腺素（NMN）的特异性抗原竞争结合辣根过氧化物酶（HRP）标记的特异性抗体，通过免疫反应，形成固相化的抗原-抗体-HRP免疫反应复合物，HRP催化底物发光。用特异性、灵敏度、精密度、热加速稳定性和准确度进行性能确认。结果:建立的MN、NMN检测方法检测多种结构类似物均无明显的交叉反应；MN检测试剂的空白限、检出限、功能灵敏度分别为10.51、21.15、25.76 ng/L，NMN检测试剂分别为11.54、28.43、31.29 ng/L；MN、NMN检测试剂变异系数分别为2.41%~5.38%，1.61%~3.22%；2种检测试剂的热加速稳定性试验显示检测试剂在2~8 ℃可以稳定存放1年，且该方法量值结果可溯源至质谱。结论:本研究成功建立了检测血浆中游离MN、NMN的化学发光免疫检测方法。

目的:建立汉城病毒(Seoul virus, SEOV)L99株特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，验证其检测性能，为双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)疫苗研制、生产和检定过程中Ⅱ型病毒抗原含量检测提供有效手段。方法:小鼠体内诱生法制备L99病毒单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)腹水，Protein-A亲和层析纯化腹水抗体，SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度，间接ELISA法测定McAb效价，Western blot鉴定其特异性；叠加ELISA法对4株McAb进行抗体配对。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记单抗后，通过正交试验优化包被和标记抗体使用浓度，建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以Ⅱ型HFRS疫苗标准品作为定量标准，验证方法的检测限、线性范围、专属性、准确性、精密度；通过检测3批Ⅱ型病毒疫苗灭活原液验证方法适用性。结果:4株McAb腹水效价均>1∶10 6，抗体纯度均>98%；经Western blot鉴定，1D5、3A4、5B7特异识别Ⅱ型L99株出血热病毒核衣壳蛋白，2E3与Ⅰ型PS-6株出血热病毒存在交叉反应；经抗体配对筛选后，选择3A4为包被抗体，1D5为标记抗体；棋盘滴定法确定包被抗体工作浓度为20 μg/ml，HRP标记抗体工作浓度为1∶4 000。该方法对SEOV L99抗原最低检测限为0.078 1 μg/ml；线性范围为0.078 1~2.500 0 μg/ml， R2>0.99；专属性验证其对Ⅱ型HFRS疫苗具有检测特异性；抗原回收率在95.8%~108.7%之间，精密度验证变异系数<10%。用该方法检测3批Ⅱ型HFRS灭活疫苗原液结果均呈剂量依赖性。 结论:成功建立了SEOV L99株型特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，为地鼠肾双价肾综合征出血热疫苗生产及检定过程中，SEOV L99株病毒抗原含量测定提供了检测方法。

有效微生物(EM)复合菌剂可缓解新疆连年重茬种植与偏施化肥导致的辣椒土壤环境质量恶化、产量下降等问题.本研究以不施EM复合菌剂为对照(CK),研究施用EM复合菌剂对辣椒植株生长、产量、土壤养分含量、土壤酶活性和根际真核生物群落结构的影响.结果表明:与CK相比,施用EM复合菌剂的辣椒株高、茎粗、叶长、叶宽和根长分别增加22.6％、35.3％、33.3％、29.7％和15.1％,果宽、单个果重和产量分别提升5.3％、42.9％和74.7％.施用EM复合菌剂的土壤碱解氮在花期和成熟期分别提高10.2％和5.8％,速效磷分别提高10.4％和13.4％.施用EM复合菌剂的土壤蔗糖酶活性在苗期、花期和成熟期分别提高40.7％、14.6％和9.3％,脲酶活性分别提高7.9％、10.2％和11.5％,过氧化物酶活性在花期和成熟期分别提高16.8％和44.6％.施用EM复合菌剂还显著改变了辣椒根际真核生物群落的β多样性,其中,具有改良土壤、促进土壤养分循环功能的线蚓属和Sminthurides属种群的相对丰度较高,而致病微生物油壶菌属和不动壶菌属种群的相对丰度分别较CK降低了 98.0％和89.3％,轮枝孢属种群的相对丰度降为0.表明EM复合菌剂能够提高新疆地区辣椒土壤养分含量和酶活性,减少土壤致病真菌,从而达到促进辣椒生长、提高果实产量的效果.

目的 建立检测一种测定血清中抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)单克隆抗体浓度的间接酶联免疫吸附测定(ELISA)方法.方法 对TNF-α包被浓度及酶标抗体种类、存放稳定性和浓度等进行考察,确定关键试验参数.考察优化后方法的专属性、精密度与回收率、标准曲线与定量下限.结果 TNF-α包被浓度为400 ng·mL-1,选择Sigma辣根过氧化物酶标记羊抗人免疫球蛋白G,以1∶3.0×105倍进行稀释;稀释后的酶标抗体4℃保存3 d稳定性良好.同时确认了方法专属性良好,回收率为84.00％～106.82％,不同浓度样品精密度的变异系数均≤10％,方法线性良好,曲线方程为y=(-8.37 × 103-2.37 × 106)/[1+(x/29.80)106]+2.37 ×106(R2=0.999),定量下限:1 ng·mL-1,均符合要求.结论 本研究建立了一种准确、可靠的ELISA法测定血清中抗TNF-α单克隆抗体药物的浓度.

目的 研制检测基孔肯雅热免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗体的酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快检试剂盒,为流行病学调查及实验室诊断提供新的工具.方法 以基孔肯雅病毒特异性原核表达抗原pMal-chik23为诊断抗原,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗IgG二抗为显色抗体,正交实验对诊断抗原、待检血清、二抗工作浓度进行优化,并对包被、封闭、孵育及显色等反应条件进行系统优化,在临床大样品评估的基础上,确定ELISA检测的临界值.在此基础上,对ELISA反应的特异性、灵敏性及稳定性进行评估,研制组装检测基孔肯雅热IgG抗体的ELISA快检试剂盒.结果 经系统优化,研制、组装了检测基孔肯雅热IgG抗体的间接ELISA快检试剂盒,其最佳反应条件为:1.0 μg/mL包被抗原经碳酸盐缓冲液4 ℃包被24h,HBV封闭液37℃封闭4 h,待检样品1:101稀释后,100μL/孔,37℃反应40 min,磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline with tween 20,PBST)洗涤4次,HRP标记兔抗人IgG 1∶20 000、HRP标记羊抗鼠IgG 1∶10 000稀释后,100 μL/孔,37℃反应30 min,PBST洗涤5次,TMB显色液 100 μL,37 ℃显色 10 min,50 μL 20％H2SO4终止反应,双波长450/630 nm测定 A450 nm值.试剂盒性能评估结果表明,所研制试剂盒与所试阳性样品检测A450 nm值＞0.43,阴性样品检测A450nm值＜0.04,S/N比值＞10,与辛德毕斯、盖塔、罗斯河、登革等9种其他相近虫媒病毒均无交叉反应,并具较高稳定性,板内变异系数为0.76％～2.12％,板间变异系数为0.64％～1.85％,批间变异系数为0.83％～2.31％,均小于3％,4℃保存1年性能无明显下降.结论 研制了检测基孔肯雅热IgG抗体的间接ELISA快检试剂盒,具备良好的灵敏性、特异性与稳定性.

目的 探讨不同稀释液对混合酶标抗体稳定性的影响,筛选出一种适用于混合酶标抗体的稀释液,可同时保护辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)偶联二抗和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)偶联二抗鸡尾酒混合物的稳定性.方法 以Tris-HCl缓冲盐溶液为基础溶液,设置4种不同的稀释液配方(A、B、C、D),每种配方包含不同类型的稳定剂,如蛋白、金属离子、表面活性剂、抑菌剂等,采用不同的稀释液配置混合酶标抗体,在冷藏(2～8 ℃)和37 ℃条件下存储,通过ELISA、酶活测定及免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色法检测其稳定性.结果 D液配方[Tris(50mmol/L)+牛血清白蛋白(1.5％,g/100mL)+Tween-20(0.3％)+Proclin-950(0.1％,g/100 mL)+氯化钠(150 mmol/L)+L-Ascorbic Acid(1 mmol/L)+L-methionine(5 mmol/L)+L-histidine(5mmol/L)+酪蛋白酸钠(1％,g/100 mL)+氯化锌(0.1 mmol/L)+海藻糖(8％,g/100 mL)]保存试剂的稳定性最好,在37 ℃条件下保存10周,HRP偶联二抗和AP偶联二抗的工作液效价最高,HRP和AP的活性剩余比率分别为93.46％和96.07％,IHC结果无明显差异.结论 该配方稀释液可用于混合酶标抗体工作液的配置.