目的 解决法医检验工作中自然脱落的毛发、严重降解的骨骼及牙齿这类检材检验难度大且检出完整DNA分型的成功率低的问题.方法 应用一类特殊的DNA序列——逆转座子(retrotransponson,RE)进行检验鉴定,用作遗传分析的RE DNA片段长度多在60～125 bp,利用21个基因座组合的RE个体识别系统计算似然比(likelihood,LR),并计算亲缘关系鉴定中的累计非父排除率(combined paternity index,CPI).结果 本系统对无毛囊的发干、严重降解的生物检材有较高的检出成功率,LR值多在108～1012,完全能够达到同一认定的水平.计算CPI值后发现难以得出支持假设的结论,多个案例计算的CPI数值小于10 000.结论 21个基因座的RE系统可以用于个体识别鉴定,亲缘关系的鉴定仍需增加基因座.

近年来研究发现真核生物基因组中有许多重复序列参与基因表达的调控.在这些重复序列中,有一种广泛分布于基因组中的逆转座子LINE-1,目前发现其低甲基化对癌症的发生起着非常重要的作用,具体表现为影响基因的转录活性及整个基因组的稳定性等.本文主要阐述了LINE-1的低甲基化对常见癌症的影响以及LINE-1低甲基化与癌症预后的关系,这对认识癌症的发生与发展和对抗肿瘤药物的研发具有重要的价值.

[目的]利用CRISPR/Cas9技术对猪内源性逆转录病毒(PERV)进行编码区的大片段敲除,获得PERV敲除的阳性PK15单克隆细胞系.[方法]通过对巴马小型猪基因组进行高通量测序,获得PERV高度保守序列,再根据CRISPR/Cas9的构建原理,设计2个gRNA,并将其同时整合入含有PB转座子的可表达Cas9蛋白的载体中,即PB-CAG-2×gRNA-Cas9载体.然后以电转方式将打靶载体转入PK15细胞中,并通过药物(G418)筛选方法筛出单细胞克隆.通过PCR鉴定,挑出阳性克隆,并将其传代扩大获得细胞系.[结果]酶切、测序验证了载体PB-CAG-2×gRNA-Cas9的正确性,PCR结果显示7株单克隆细胞系均有约3600bp的PERV大片段敲除.[结论]构建了PERV敲除的基因打靶载体PB-CAG-2 × gRNA-Cas9,并利用该载体成功打靶获得了7株PERV大片段敲除的PK15细胞系.

目的 :探讨不同灵长类动物限制因子不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAM HD1)的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素(IFN)产生信号通路等作用,为灵长类动物SAM HD1的研究提供依据.方法 :构建稳定表达不同灵长类动物SAM HD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为阴性对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAM HD1蛋白的U937细胞系为实验组.经佛波酯(PMA)刺激分化成巨噬样细胞后,流式细胞术分析各组HIV-1病毒感染率.以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAM HD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48 h收获细胞,采用Western blotting法检测SAM HD1蛋白表达水平,免疫荧光检测法观察不同SAM HD1蛋白的细胞内定位.以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAM HD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率,代表SAM HD1对LINE-1转座子的活性.以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc和SAM HD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平.结果 :与阴性对照组比较,灵长类动物SAM HD1稳定表达的实验组HIV-1病毒感染率明显降低(P<0.01).与对照组比较,实验组灵长类动物SAMHD1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01).免疫荧光检测,灵长类动物SAMHD1蛋白均定位于细胞核中.与对照组比较,实验组GFP阳性细胞率明显降低,即SAMHD1对LINE-1转座子活性降低(P<0.05或P<0.01).与对照组比较,实验组灵长类动物HEK293T细胞中荧光素酶表达水平明显降低(P<0.05).结论 :不同灵长类动物SAM HD1蛋白具有抵抗HIV-1病毒感染、抑制逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生IFN的作用.

LINE-1 (long interspersed nuclear elements-1)是现今人体内唯一具有自主转座活性的逆转座子,广泛 分 布 于 基 因 组 中[1].宿 主 细 胞 对 LINE-1的 转 座 有 着 严 格 地 控 制,在 正 常 分 化 的 细 胞 中, LINE-1 的 启 动 子 为 高 度 甲 基 化 状 态,造 成 沉默[2,3].当机体对 LINE-1 的控制能力减弱时,基因组的稳定性会受到巨大威胁[4],进而引发基因缺陷性疾病甚至癌变.有研究表明在几乎所有的肿瘤细胞中 LINE-1 均为激活状态.了解机体对于 LINE-1 的调控机制,对于理解这些疾病的发生至关重要.

为了揭示转座子对旧世界猴基因组多样性和进化的影响,基于Repbase数据库和RepeatMasker比较了4种旧世界猴——东非狒狒Papio anubis、猕猴Macaca mulatta、绿猴Chlorocebus sabaeus和长鼻猴Nasalis larvatus基因组中转座子的特征,重点关注Alu家族的组成、插入/缺失多态性Alu位点和物种特有Alu插入.结果 显示,4个基因组中短散在重复序列拷贝数最丰富,平均分歧率最小,其中灵长目Primates特有的Alu逆转座子的拷贝数超过了100万个(长鼻猴除外).4个基因组中转座子的基本组成和分布与它们的进化关系相吻合,东非狒狒和猕猴的转座子特征相似,二者与绿猴、长鼻猴有较大差异.通过基因组的两两比较,鉴定了大量在4个基因组间具有插入/缺失多态性的Alu位点,以及7 882个各物种特有的Alu位点,95％以上的物种特有位点都属于AluY家族.研究结果揭示了Alu的转座活动对于旧世界猴动物基因组的进化及多样性具有重要影响.

近年来,按照药品研发并申报临床试验的细胞治疗产品大量涌现,其研发技术与评价体系处于快速发展阶段.基因转导系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等病毒载体和转座子、TALEN、CRISPR-Cas9等非病毒载体基因编辑系统等,广泛应用于不同种类细胞的改造.由于基因转导系统在细胞内表达、组装、转导、基因整合的作用机制复杂,对其人体应用的科学评价构成了挑战.结合近期细胞治疗产品临床试验申报资料审评和沟通交流过程中出现的问题,参考国内外相关技术指导原则,本文围绕基因转导系统中慢病毒和转座子的设计和安全性评估,提出现阶段的药学审评考虑点,供研发者和监管方讨论交流.

目的 检测逆转座子LINE-1在脑胶质瘤中的表达水平,探讨其异常激活与肿瘤病理特征和患者生存预后的关联;方法 收集30例脑胶质瘤组织,利用qPCR检测逆转座子LINE-1 ORF1的表达水平,并分析LINE-1表达水平与肿瘤病理分类的关系,利用Kaplan-Meirer生存曲线分析LINE-1异常活化与患者生存预后的关系;结果 与癌旁组织相比,脑胶质瘤组织中LINE-1的表达水平显著升高,同时在WHO分级Ⅲ-Ⅳ级肿瘤组织LINE-1的表达量明显高于Ⅰ-Ⅱ级,Ki-67高表达的脑胶质瘤组织LINE-1也有着更高的表达(P<0.05),与LINE-1低表达的脑胶质瘤患者相比,LINE-1高表达的脑胶质瘤患者生存期显著缩短.结论 逆转座子LINE-1在脑胶质瘤中存在异常活化,有潜力成为不良预后的分子标志物.

[目的]内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses,ERVs)是一类在宿主基因组中世代留存的有类似病毒结构的序列元件.本研究在通过前期小菜蛾Plutella xylostella精巢转录组分析发现一个小菜蛾内源性逆转录病毒元件PxERV的基础上,探究该逆转录病毒元件的序列特征及侵染活性,为探明内源性逆转录病毒对小菜蛾的影响奠定基础.[方法]利用生物信息学方法分析鉴定了PxERV在小菜蛾基因组上的序列及结构特点,并用基因克隆和测序得到PxERV的env基因序列;进一步通过MEGA6软件构建了昆虫env基因编码的氨基酸序列与核型多角体病毒包膜糖蛋白的系统发育树.利用qPCR技术检测了env基因在小菜蛾G88品系不同发育时期虫体和精巢中的表达模式及FZ品系成虫和G88品系的成虫和幼虫中env基因拷贝数的变化.利用CRISPR/Cas9介导小菜蛾G88品系中env基因突变,检测PxERV的独立复制活性.[结果]PxERV有LTR-pol-env-LTR结构,其env基因与果蝇Drosophila buzzatii逆转座子osvaldo和粉纹夜蛾Trichoplusia ni内源性逆转录病毒Ted的env基因进化关系较近.PxERV的env基因在小菜蛾G88品系雄成虫精巢中特异性高表达,env基因的拷贝数在小菜蛾FZ品系中的低于在G88品系中的,但在不同发育时期的G88品系中没有差异.G88品系多代自交,突变型env基因在小菜蛾基因组上不断减少,直至完全恢复野生型env基因.[结论]内源性逆转录病毒元件PxERV在小菜蛾世代间存在独立复制活性,但在小菜蛾发育过程中不会独立复制.这种病毒元件可能通过小菜蛾雄性生殖系统实现侵染活性,但侵染机理还需进一步探究.

目的:通过构建基因突变小鼠模型,研究小RNA 2'-O-甲基转移酶Henmt1在小鼠精子发生中的作用.方法:利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9)技术,构建Henmt1基因突变小鼠,通过计算机辅助精子分析、HE染色及免疫荧光检测等技术对小鼠表型进行分析.结果:成功构建Henmt1基因突变小鼠模型;生育力测试结果提示Henmt1基因突变雄鼠不育;Henmt1基因突变导致雄性小鼠精子发生阻滞;突变小鼠睾丸中逆转座子元件LINE 1表达上调.结论:Henmt1对雄性小鼠精子发生有重要调控作用.