长散布核元件-1（long interspersed nuclear element-1，LINE-1）是人类基因组中唯一自主转座的非末端重复序列逆转录转座子，能够复制并粘贴到基因组的新位点。为了确保进化成功，可遗传的新LINE-1插入物在携带遗传信息的生殖细胞和胚胎干细胞中积累。然而，早期胚胎发育中LINE-1抑制的减少可能会导致反转座子插入引起基因组突变，LINE-1 mRNA和蛋白质表达增加可能通过诱导胎儿卵母细胞消耗、DNA损伤与免疫炎症反应间接造成早期胚胎损伤乃至妊娠丢失。本文总结并分析了近年来关于LINE-1表观调控在配子发生及早期胚胎发育过程中的作用及其诱发早期自然流产的研究进展。

近年来研究发现真核生物基因组中有许多重复序列参与基因表达的调控.在这些重复序列中,有一种广泛分布于基因组中的逆转座子LINE-1,目前发现其低甲基化对癌症的发生起着非常重要的作用,具体表现为影响基因的转录活性及整个基因组的稳定性等.本文主要阐述了LINE-1的低甲基化对常见癌症的影响以及LINE-1低甲基化与癌症预后的关系,这对认识癌症的发生与发展和对抗肿瘤药物的研发具有重要的价值.

转座子是一类可以在染色体上或不同染色体间自由移动的 DNA.在高等生物中,处于活跃状态的转座子多为通过 RNA 中间体进行转座的逆转录转座子.由于逆转录转座子在细胞基因组中占有很高的比例,它的频繁转座能引起细胞基因组结构和功能的改变,导致癌症等严重基因疾病的发生,因此宿主细胞在长期的进化中形成了多种自我保护机制用以控制逆转录转座子活性.属于非编码小RNA的piRNA以其独特的机制在转录及转录后水平控制逆转录转座子RNA中间体的产生,抑制了逆转录转座过程的发生.本文总结了近年来piRNA控制转座子转座相关分子机制的研究进展,以期为转座子及基因调控方面的研究工作提供一些参考.

长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的DNA序列,因两端具有长末端重复序列而得名.大多数LTR反转录转座子能够感受外界环境的变化,具有转录激活特性和转座激活特性.该研究从毛竹(Phyllostachys edulis,Ph.edulis)基因组中克隆出一条完整的LTR反转录转座子,命名为PHRE6(Phyllostachys edulis retrotransposons 6),该转座子全长为5 620 bp,具有GAG和POL保守结构域.通过荧光定量PCR检测了PHRE6在DNA甲基化抑制剂和不同胁迫处理(包括辐照、高温、低温、高盐)的毛竹实生苗中转录水平的变化,结果表明,在DNA甲基化抑制剂处理后和高温(42 ℃)、低温(16℃、4 ℃)、高盐(100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl溶液)胁迫处理下PHRE6表达水平均有显著提高.以上结果说明,PHRE6是一个具有转录活性的反转录转座子,可能参与毛竹逆境响应过程.

[目的]利用CRISPR/Cas9技术对猪内源性逆转录病毒(PERV)进行编码区的大片段敲除,获得PERV敲除的阳性PK15单克隆细胞系.[方法]通过对巴马小型猪基因组进行高通量测序,获得PERV高度保守序列,再根据CRISPR/Cas9的构建原理,设计2个gRNA,并将其同时整合入含有PB转座子的可表达Cas9蛋白的载体中,即PB-CAG-2×gRNA-Cas9载体.然后以电转方式将打靶载体转入PK15细胞中,并通过药物(G418)筛选方法筛出单细胞克隆.通过PCR鉴定,挑出阳性克隆,并将其传代扩大获得细胞系.[结果]酶切、测序验证了载体PB-CAG-2×gRNA-Cas9的正确性,PCR结果显示7株单克隆细胞系均有约3600bp的PERV大片段敲除.[结论]构建了PERV敲除的基因打靶载体PB-CAG-2 × gRNA-Cas9,并利用该载体成功打靶获得了7株PERV大片段敲除的PK15细胞系.

长散在核重复序列1(LINE-1)属于逆转录转座子,至今仍在人类基因组中保留自主转座的活性,并在基因组中占有很高的比例,其频繁转座会引起基因组不稳定,导致严重的后果.通常宿主细胞运用多种机制对其转座进行严格控制,所以LINE-1在大多数体细胞中是无活性的,然而近年来有研究证实在神经元细胞中LINE-1可以表达并转座,插入基因组的不同位置,导致每个神经元细胞在基因水平上都是独特的.此外,LINE-1的转座可能在长期记忆等方面具有一定生理学意义,也有可能产生一些病理影响.希望本文能对全面了解LINE-1在神经系统中的情况提供一些线索.

为了在毛竹中开发更多的活性LTR反转录转座子,文中分析和鉴定了一个毛竹LTR反转录转座子(Ph-LTR2),系统分析了该转座子在逆境下的表达模式.Ph-LTR2转座子全长6 030 bp,属于Ty3-Gypsy家族中的Reina亚家族.LTR序列同源性为96.41％,插入时间约为61.92万年,在基因组中有5个拷贝.Ph-LTR2转座子结构域包括GAG(种属特异抗原,gag protein)蛋白域、PR(蛋白酶,Proteases)蛋白域、RT(反转录酶,Reverse transcriptases)蛋白域、RH (RNA酶H,Ribonuclease H)蛋白域、INT(整合酶,Integrase)蛋白域和CHR(染色质组织修饰域,Chromatin organization modifier)蛋白域.通过实时定量PCR检测了INT、RT和RH的表达模式,确定INT、RT和RH在毛竹叶、笋、根存在组织表达特异性.在高温、低温、甲基化抑制剂、辐照与高盐等胁迫下,Ph-L TR2转座子INT、RT和RH的转录水平均不同程度地提高了,具体来讲,INT、RT和RH在高温、低温、甲基化抑制剂处理后转录水平上调;在低剂量辐照处理和低浓度盐溶液处理后转录水平也上调,但随剂量和浓度的增加表达水平又下降,这些结果表明Ph-LTR2转座子的表达模式响应外界环境的变化,但具体机制尚不清楚.本研究结果为开发基于Ph-LTR2转座子标签奠定了一定的理论基础.

目的 :探讨不同灵长类动物限制因子不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAM HD1)的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素(IFN)产生信号通路等作用,为灵长类动物SAM HD1的研究提供依据.方法 :构建稳定表达不同灵长类动物SAM HD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为阴性对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAM HD1蛋白的U937细胞系为实验组.经佛波酯(PMA)刺激分化成巨噬样细胞后,流式细胞术分析各组HIV-1病毒感染率.以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAM HD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48 h收获细胞,采用Western blotting法检测SAM HD1蛋白表达水平,免疫荧光检测法观察不同SAM HD1蛋白的细胞内定位.以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAM HD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率,代表SAM HD1对LINE-1转座子的活性.以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc和SAM HD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平.结果 :与阴性对照组比较,灵长类动物SAM HD1稳定表达的实验组HIV-1病毒感染率明显降低(P<0.01).与对照组比较,实验组灵长类动物SAMHD1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01).免疫荧光检测,灵长类动物SAMHD1蛋白均定位于细胞核中.与对照组比较,实验组GFP阳性细胞率明显降低,即SAMHD1对LINE-1转座子活性降低(P<0.05或P<0.01).与对照组比较,实验组灵长类动物HEK293T细胞中荧光素酶表达水平明显降低(P<0.05).结论 :不同灵长类动物SAM HD1蛋白具有抵抗HIV-1病毒感染、抑制逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生IFN的作用.

近年来,按照药品研发并申报临床试验的细胞治疗产品大量涌现,其研发技术与评价体系处于快速发展阶段.基因转导系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等病毒载体和转座子、TALEN、CRISPR-Cas9等非病毒载体基因编辑系统等,广泛应用于不同种类细胞的改造.由于基因转导系统在细胞内表达、组装、转导、基因整合的作用机制复杂,对其人体应用的科学评价构成了挑战.结合近期细胞治疗产品临床试验申报资料审评和沟通交流过程中出现的问题,参考国内外相关技术指导原则,本文围绕基因转导系统中慢病毒和转座子的设计和安全性评估,提出现阶段的药学审评考虑点,供研发者和监管方讨论交流.

为深入研究大茎野生种Ty1-copia反转录转座子逆转录酶序列(RT,reverse transcriptase)的特点,本研究使用简并引物将Ty 1-copia RT序列克隆、测序,成功分离了60条Ty1-copia类RT序列,AT比例为46.0％～62.0％,长度为257～266bp,通过构建系统进化树分析,可将其分成6大类.将这些碱基序列翻译成氨基酸序列,通过ClustalX软件分析,发现存在上游TAFLHG、下游YVDDM以及中心SLYGLKQ保守结构域,并出现编码阅读框移码突变、终止密码子突变的现象.与其他禾本科物种的Ty1-copia RT序列一起构建系统进化树,结果发现可分成10类不同的进化谱系,60条大茎野生种Ty1-copia RT氨基酸序列中有12条序列归为Ⅰ类(Sre/Maximus)、有10条序列归为Ⅱ类(Retrofit/Ale)、有18条序列归为Ⅲ类(Ale)、有17条序列归为X类(Tork/TAR),仅有3条序列归为Ⅵ类(Tork/Angela);然而Bianca和Oryco/Ivana谱系未发现大茎野生种Ty1-copia RT序列,表明其与甘蔗杂交种、高粱的亲缘关系近.通过斑点杂交结果,可计算得到Ty1-copia RT序列在其基因组中拷贝数为6.75×103.FISH结果显示,Ty1-copia RT序列是弥散分布在染色体上,其中部分染色体端粒上的信号比较强.这些结果将有助于今后大茎野生种生物多样性研究、基因组研究,提供一定的参考依据.