目的:建立高效的人肠三叶因子（ITF）重组表达及纯化策略，观察重组人ITF（rhITF）对烧伤小鼠肠黏膜损伤与修复的作用并探讨其机制。方法:采用实验研究方法。采用新型酵母表达载体pGAPZαA和酵母菌X33重组表达ITF，并通过金属螯合亲和层析与阴、阳离子交换层析法纯化蛋白，行非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及蛋白质印迹法鉴定rhITF。rhITF与胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液按体积比1∶1混合，分别作用0.5、1.0、1.5、2.0 h和1.0、2.0、4.0 h后行非还原SDS-PAGE，分析rhITF的稳定性。按随机数字表法将105只6~8周龄BALB/c雄性小鼠分为假伤组（30只）、单纯烧伤组（45只）、烧伤+rhITF组（30只）。将单纯烧伤组和烧伤+rhITF组小鼠背部造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤，假伤组小鼠模拟致假伤，烧伤+rhITF组小鼠伤后灌胃1 mg/kg rhITF，其余2组小鼠伤后给予等量生理盐水。伤后24 h，取15只单纯烧伤组小鼠，制备烧伤血清，用于细胞实验。伤后3、5、7 d，每组各取10只小鼠处死后取小肠组织，苏木精-伊红染色观察肠黏膜病理变化，分光光度法和酶联免疫吸附测定法测定肠组织二胺氧化酶（DAO）及乳酸脱氢酶（LDH）活性。取3批人结直肠腺癌HT-29细胞，分为阴性对照组、25 μg/mL rhITF组、50 μg/mL rhITF组（样本数为3），正常对照组、烧伤血清组、烧伤血清+rhITF组（样本数为3），CK869抑制剂组、CK666抑制剂组和溶剂对照组（样本数为2），分别进行相应处理，Transwell实验观察培养12 h后细胞移行。另取2批HT-29细胞，每批细胞均分为正常对照组、烧伤血清组和烧伤血清+rhITF组（样本数均为6），培养24 h后，蛋白质印迹法检测细胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1（Rac1）及肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合亚基1B（ARPC1B）蛋白表达，活化磁珠下拉实验检测细胞Rac1活性。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、SNK检验。结果:每升发酵液获得rhITF 82.35 mg，蛋白纯度高达98%，且具有良好的抗原特异性。rhITF在胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液中较稳定，与胰蛋白酶溶液作用2.0 h后仍有45%残余，与胃蛋白酶溶液作用4.0 h后仍有90%残余。假伤组小鼠伤后各时间点肠黏膜未见充血、水肿，单纯烧伤组小鼠伤后各时间点肠黏膜主要病理表现为充血、水肿、糜烂及出血。烧伤+rhITF组小鼠伤后3、5 d肠黏膜主要以充血、水肿为主，伤后7 d肠黏膜水肿和充血减轻。与单纯烧伤组比较，假伤组、烧伤+rhITF组小鼠伤后3、5、7 d肠组织DAO和LDH活性显著升高（ P<0.05或 P<0.01）。培养12 h后，25 μg/mL rhITF组细胞移行数为（58±12）个，显著多于阴性对照组的（16±5）个（ P<0.01），显著少于50 μg/mL rhITF组的（123±9）个（ P<0.05）。培养12 h后，烧伤血清组细胞移行数为（60±13）个，显著少于正常对照组的（143±11）个和烧伤血清+rhITF组的（138±8）个（ P<0.05）。培养12 h后，溶剂对照组细胞移行数为（155±9）个，明显多于CK666抑制剂组的（33±5）个、CK869抑制剂组的（28±5）个（ P<0.01）。培养24 h后，烧伤血清组细胞AMPK、Rac1蛋白表达量与正常对照组、烧伤血清+rhITF组相近（ P>0.05），p-AMPK蛋白表达量明显高于正常对照组、烧伤血清+rhITF组（ P<0.05或 P<0.01），ARPC1B蛋白表达量明显低于正常对照组、烧伤血清+rhITF组（ P<0.05）。培养24 h后，烧伤血清组细胞Rac1活性明显低于正常对照组、烧伤血清+rhITF组（ P<0.05或 P<0.01）。 结论:本研究获得的rhITF具有较高的纯度和超强的稳定性，能耐受极端pH和蛋白酶水解，减轻烧伤小鼠肠黏膜损伤。rhITF能通过抑制AMPK磷酸化维持Rac1-Arp2/3活性，促进肠上皮细胞移行，加速肠黏膜修复。

[目的]通过分子伴侣共表达增强毕赤酵母中异源蛋白酶K的分泌水平,并对其的羊毛无氯剥鳞作用机制进行解析,旨在提高蛋白酶K的表达量并为高效酶法剥鳞技术的应用奠定基础.[方法]利用毕赤酵母表达系统对tprK基因进行异源表达,首次分析了影响蛋白质折叠和质量控制的分子伴侣Ssa1、Erj5、Sil1、Hac1、Kar2、Lhs1 和Ydj1 分别过表达对TPRK的表达量和酶活力的作用,并对TPRK处理的羊毛纤维效果进行分析.[结果]TPRK在毕赤酵母GS115 中表达,其最适反应条件为 65℃、pH 9.0,且具有良好的热稳定性和pH稳定性.过表达ssa1、hac1、erj5 和sil1 基因的重组菌株酶活分别提升了 36.8%、20.0%、17.7%和 14.8%.5 L发酵罐进行高密度发酵,诱导 72 h后,TPRK的酶活达到 77 471.99 U/mL.在羊毛水解应用中TPRK可水解羊毛鳞片内层使鳞片逐渐剥落,起到剥鳞效果,并且最适水解条件为:TPRK添加量为 300 U/mL、反应温度 55℃、pH 9.0 和反应时间 2 h.[结论]过表达分子伴侣Ssa1 能够有效提升TPRK的表达量,利用该TPRK处理羊毛纤维,可有效去除羊毛鳞片层,而对羊毛核心皮质层造成的损伤较小.

目的 探讨阿萨希毛孢子菌与西弗射盾子囊霉的实验室鉴定与体外抗真菌药敏特点,为临床用药、准确鉴定和流行病学研究提供依据.方法 收集2017年1月-2022年9月广东省人民医院临床分离的2种少见酵母样真菌,其中阿萨希毛孢子菌54株,西弗射盾子囊霉23株,复苏后进行形态学鉴定、生化鉴定和质谱鉴定,同时采用FUNGUS-3 MIC法测定5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的最小抑菌浓度(MIC).结果 阿萨希毛孢子菌主要感染65岁以上人群(46.30％),感染部位以创面感染(27.78％)与尿路感染为主(22.22％),主要分布于外科(35.19％)和内科(35.19％);而西弗射盾子囊霉感染患者主要以18～40岁(39.13％)和41～65岁(47.83％)两个年龄段为主,感染部位以耳道为主(78.26％),分布于耳鼻喉外科病区(60.87％)和耳聋专科门诊(26.09％);在形态学鉴定方面,2种真菌菌落均为白色凸起,呈镶嵌生长,其中阿萨希毛孢子菌生长速度快于西弗射盾子囊霉,菌落革兰染色可见关节孢子、关节菌丝、真假菌丝及芽生孢子,而西弗射盾子囊霉可见分枝分隔菌丝和单细胞、卵圆形的芽生孢子.在生化鉴定方面,阿萨希毛孢子菌尿素酶阳性,可水解七叶苷,同化多种糖类化合物,而西弗射盾子囊霉尿素酶阴性、不水解七叶苷,但可同化多种碳水化合物.微生物质谱对阿萨希毛孢子菌和西弗射盾子囊霉的鉴定率分别为96.30％和91.30％,具有良好鉴定效果;在体外药敏结果方面,两种真菌对5-氟胞嘧啶均表现出高MIC值,其中54株(100％)阿萨希毛孢子菌MIC值均≥4 μg/mL,23株(100％)西弗射盾子囊霉MIC值均≥4 μg/mL;同时也需警惕2种真菌对氟康唑出现高MIC值的情况,其中7株(12.97％)阿萨希毛孢子菌MIC值均≥4 μg/mL,16株(69.56％)西弗念珠菌MIC值≥16 μg/mL;两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑则整体上表现出较低的MIC值(≤2 μg/mL),表现出较好的体外活性.结论 阿萨希毛孢子菌和西弗射盾子囊霉的实验室鉴定与体外药敏结果具有不同特点,对其实现准确鉴定和进行抗真菌药敏试验,对临床用药、实验室鉴定和流行病学的研究具有重要意义.

[目的]为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492 的生物学功能.[方法]对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492 主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达.利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能.[结果]几丁质酶AO-492 有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18 家族结构域,并含有糖苷水解酶 18 家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构.系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492 分子量约为 59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应.ReAO-Z492 最适温度为 40℃,最适pH为 7.0;Mg2+对其酶活有促进作用,而Ag+、Cu2+、Fe3+和Zn2+有抑制作用.ReAO-Z492 对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性.[结论]少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用.

[目的]Heavy metal ATPase(HMA)基因家族广泛参与植物对金属元素的吸收和转运,系统鉴定番茄HMA基因家族成员及其特征,并研究其在应对镉胁迫过程中的功能,为解析番茄重金属转运机制及番茄低镉积累种质创新提供理论依据.[方法]通过生物信息学鉴定番茄HMA基因家族成员,并分析其系统进化树、蛋白理化性质、基因结构、顺式作用元件、基因表达模式等,通过酵母功能互补试验研究SlHMA1 的镉转运活性.[结果]番茄基因组中存在 8 个SlHMAs,分属 2 个亚组.在基因结构方面,各SlHMAs间及与拟南芥和水稻的同源基因之间都存在显著差异.SlHMAs成员启动子区域含有较多逆境响应相关的顺式作用元件,RT-qPCR结果也揭示大多数SlHMAs表达对镉胁迫有不同程度的组织特异性响应.酵母功能互补试验表明SlHMA1 蛋白具有镉转运活性,进化分析表明HMA1广泛存在于植物界,且其ATP水解酶活性相关的氨基酸保守基序DKTGT也在植物界高度保守.[结论]番茄SlHMAs具有HMA家族基因的典型特征,同时也存在功能多样性.SlHMAs及其氨基酸保守基序DKTGT与金属离子转运及镉胁迫响应密切相关,在低镉作物育种方面具有重要应用潜力.

氨肽酶A(aminopeptidase A,Pep A)能特异性地水解N末端为谷氨酸(glutamic acid,Glu)或天冬氨酸(aspartic acid,Asp)的肽链,提高蛋白质的水溶性和食物的风味,在食品工业和肉类加工中具有一定的应用前景.本研究采用全基因合成的方式获得了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis)IL1403 氨肽酶A(Lactococcus lactis-Pep A,Lc-Pep A)的编码基因,将该基因克隆并导入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(His4),在毕赤酵母中实现了Lc-Pep A的高效分泌表达,表达产物经鉴定和纯化制备后,进行了生物学特性的分析.结果表明,Lc-Pep A具有较强的底物特异性,对 2 种底物谷氨酸对硝基苯胺(glutamic acid-p-nitroaniline,Glu-pNA)和天冬氨酸对硝基苯胺(aspartic acid-p-nitroaniline,Asp-pNA)具有相似的催化活力和酶动力学参数.Lc-Pep A是一种金属蛋白酶,最适反应温度为 60℃,最适pH为 8.0,具有较宽的热稳定性和酸碱稳定性.金属离子Co2+、Mn2+及Zn2+等对酶活力具有不同程度的激活作用,而Ni2+和Cu2+对酶活力具有强烈的抑制作用.Lc-Pep A 对常规蛋白酶抑制剂不敏感,但能被金属蛋白酶抑制剂、EDTA 及二硫键还原剂抑制.这些研究为Lc-Pep A的生产和指导该酶的应用打下了坚实的基础.

圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)是一种能够天然合成多种类胡萝卜素和油脂的非模式酵母.该菌能够利用各种廉价原料,耐受甚至同化利用多种有毒木质纤维素水解副产物.目前,该酵母被广泛用于微生物油脂、萜烯类化合物、各种高价值酶、糖醇和聚酮化合物的生产研究.鉴于其广阔的工业应用前景,研究人员对其开展了多维度的理论和技术的探索,包括基因组、转录组、蛋白组、遗传操作平台等.本文着重阐述近年来圆红冬孢酵母的代谢工程和天然产物合成的研究进展,并展望其细胞工厂构建中面临的挑战和可能的应对决策.

[目的]揭示光臀八齿小蠹Ips nitidus共生微生物群落组成和功能特征.[方法]对来自中国西北部青海省麦秀自然保护区的光臀八齿小蠹进行肠道和其他组织共生真菌和细菌宏基因组学和相关性网络分析,比较光臀八齿小蠹肠道和其他组织共生真菌及细菌群落组成,分析微生物群落间的相互关系,并采用非冗余蛋白序列比对方法注释共生微生物功能基因.[结果]共发现光臀八齿小蠹肠道和其他组织共生微生物3 520种,真菌和细菌的物种数最高,分别占全部物种数的23.21％和69.01％,平均相对丰度分别为9.69％和13.79％.其他组织中共生真菌白粉菌目(Erysiphales)相对丰度和物种多样性较肠道中的高,而其他组织中酵母目(Saccharomycetales)相对丰度和物种多样性较肠道中的低;其他组织中长喙壳类真菌(ophiostomatoid fungi)多样性(6属16种)较在肠道中的(5属13种)高,在其他组织和肠道中的平均相对丰度分别为0.016％和0.013％.其他组织中肠杆菌目(Enterobacterales)相对丰度和物种多样性高于肠道中的.肠杆菌属Enterobacter、白粉菌属Erysiphe、丛枝菌根属Rhizophagus和沃尔巴克氏菌属Wolbachia均为肠道和其他组织的核心菌属.真菌和细菌的某些群落在肠道和其他组织间表现出相反的相互关系,表明光臀八齿小蠹共生菌间可能存在复杂的相互作用.分别鉴定到共生真菌和细菌功能基因7 010和6 483个,细菌中异源性物质生物降解和代谢相关功能基因数量远高于真菌的;mRNA监测通路、丙酸代谢和泛素介导的蛋白质水解等11条通路在肠道中较在其他组织中具有更多的差异基因;对于柠檬烯降解和甾醇合成相关功能基因的注释结果表明,细菌对柠檬烯较真菌具有明显的降解能力,而真菌在甾醇生物合成中较细菌发挥更重要的促进作用;74个长喙壳类真菌功能基因主要参与到氧化磷酸化、代谢通路和氨基酸代谢,且长喙壳类真菌在其他组织中多样性更高,主要分布于Ophiostoma等.[结论]光臀八齿小蠹肠道和其他组织中共生微生物的群落组成和多样性以及功能上存在一定的差异性,肠杆菌属、白粉菌属、丛枝菌根属和沃尔巴克氏菌属是光臀八齿小蠹共生微生物群落中最重要的核心菌群,可能在群落构建中发挥着重要的作用.

实验研究了添加不同水平酵母水解物(Yeast hydrolysate,YHY)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生长性能、消化、抗氧化和非特异性免疫能力的影响.实验选用300尾平均体重为(6.43±0.55)g的个体,随机分为5组,分别饲喂在基础饲料中添加0(对照组)、0.5％、1％、2％和4％YHY的饲料,每组3个重复,养殖密度为20尾/缸.为期8周的实验结束后,测定克氏原螯虾生长指标、胃和肝胰腺消化酶活性、肝胰腺抗氧化性能、血清生化指标和免疫酶活性.结果表明:(1)饲料中添加1％—4％YHY对该虾生长指标有促进作用.其中,2％添加组的存活率(SR)、最终体重(FBW)、最终体长(FBL)和肝胰腺指数(HSI)达最大值且显著高于对照组(P＜0.05),增重率(WGR)和特定生长率(SGR)在1％添加组达到最大值且显著高于其余各组(P＜0.05);(2)1％YHY添加组的全虾粗蛋白质含量显著高于其他组(P＜0.05),而肌肉粗蛋白和粗脂肪含量在2％添加组达到最大值;(3)与对照组相比,2％—4％YHY添加组的胃和肝胰脏消化酶活性显著提高(P＜0.05);(4)2％YHY添加组的肝胰腺抗氧化酶(过氧化氢酶,CAT;总超氧化物歧化酶,T-SOD;总抗氧化能力,T-AOC)和免疫酶(碱性磷酸酶,AKP;酸性磷酸酶,ACP)的活性达到最大值、丙二醛(MDA)的含量达到最小值,且与对照组相比均有显著差异(P＜0.05);(5)2％YHY添加组该虾血清中总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量显著高于其他组(P＜0.05),1％和2％YHY添加组谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性显著低于其他各组(P＜0.05).结果表明,饲料中添加2％的酵母水解物可显著提高克氏原螯虾的消化、生长及肌肉粗蛋白和粗脂肪含量,并显著改善其抗氧化和非特异性免疫能力.

纤维素乙醇作为一种清洁可再生的绿色能源,具有良好的应用前景.然而酿酒酵母利用木质纤维素原料生产乙醇的发酵过程易受多种抑制物胁迫的影响,因此提高其胁迫耐受性具有重要意义.本研究在细胞内设计了一种氧化还原敏感型基因元件,通过生物传感器Yap1 感应胞内氧化还原状态,以调控抗胁迫基因智能表达.首先,分析了Yap1 调控的天然内源启动子PTRR1、PTRX2 和PMET16 对木质纤维素水解液中典型抑制物的响应强度.其次,根据不同胁迫种类组合相应启动子与抗胁迫的效益基因,构建氧化还原敏感型基因元件提高了酿酒酵母的胁迫耐受性.最后,将表现较好的基因元件GP-CTT和GP-ADH串联整合到一起构建了双基因元件系统,在 5-HMF和H2O2 双重胁迫下细胞的死亡率与野生型相比下降了 69.6%.相较于单基因元件GP-CTT,双基因元件整合菌株的比生长速率、葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率分别提高了64.2%、60.1%和 58.9%,重组菌株过氧化氢酶的酶活力提高了 40.2%.本研究通过理性设计氧化还原敏感型基因元件的遗传回路,强化胞内关键抗氧化酶和醛降解途径,系统地提高了酿酒酵母的胁迫耐受性,为动态地提高酵母鲁棒性提供了新的见解.