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亲环素D对棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡机制的初步研究
编辑人员丨1周前
目的:探讨亲环素D(CypD)对棕榈酸诱导的小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞凋亡的影响及机制。方法:在MIN6细胞中建立CypD过表达稳转细胞系与CypD敲低稳转细胞系,将细胞分为对照组(未转染病毒)、OE-ctrl组[转染过表达对照病毒未用棕榈酸(PA)处理]、OE-ctrl+PA组、OE-CypD组(转染CypD过表达病毒未用PA处理)、OE-CypD+PA组、KD-ctrl组(转染敲低对照病毒未用PA处理)、KD-ctrl+PA组、KD-CypD组(转染CypD敲低病毒未用PA处理)、KD-CypD+PA组,每组3个复孔。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,实时荧光定量聚合酶链反应与Western blot法检测各组CypD的mRNA及蛋白表达量。Western blot法检测凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bax)、B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bcl-2)、半胱氨酸依赖的天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3、细胞色素c(Cyt-c)、凋亡酶激活因子1(Apaf-1)]的表达。共聚焦显微镜检测细胞内钙离子荧光。两组间比较采用 t检验,多组间比较采用单因素方差分析。 结果:与对照组相比,随着PA浓度上升,MIN6细胞凋亡率显著升高( P<0.01),CypD mRNA(分别为1.00±0.04和1.88±0.02)和CypD蛋白表达量(分别为0.049±0.004和0.577±0.006)均明显升高,差异具有统计学意义( P<0.01)。与OE-ctrl+PA组比较,OE-CypD+PA组细胞凋亡率升高[分别为(31.33±2.72)%和(24.95±0.94)%, P<0.05],细胞内钙离子荧光信号增加(分别为27.62±0.74和24.61±0.15, P<0.01),凋亡相关蛋白Bax、Caspase3、Cyt-c、Apaf-1水平升高(均 P<0.01),细胞存活蛋白Bcl-2水平降低( P<0.01)。与KD-ctrl+PA组比较,KD-CypD+PA组细胞凋亡率降低[分别为(22.87±0.34)%和(26.91±0.93)%, P<0.05],细胞内钙离子荧光信号减少(分别为23.26±0.65和27.82±0.86, P<0.01),凋亡蛋白Bax、Caspase3、线粒体相关凋亡蛋白Cyt-c、Apaf-1水平降低(均 P<0.01),Bcl-2水平升高( P<0.01)。 结论:CypD加重PA诱导的MIN6细胞脂毒性损伤,可能与线粒体功能障碍有关。敲低CypD对脂毒性下的MIN6细胞有保护作用。
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编辑人员丨1周前
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甘草酸苷对幼鼠癫痫持续状态模型的保护机制研究
编辑人员丨1周前
目的:研究甘草酸苷对幼鼠癫痫持续状态(SE)模型的保护机制。方法:年幼SD大鼠采用腹腔注射氯化锂和匹罗卡品制作SE大鼠模型,分为5组:对照组、SE组、SE+低剂量甘草酸苷组、SE+中剂量甘草酸苷组和 SE+高剂量甘草酸苷组,腹腔内注入不同剂量的甘草酸苷(20 mg/kg、40 mg/kg和60 mg/kg)。注射后6 h、12 h和24 h眶内采血,检测各组大鼠血清和(或)海马组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化c-Jun氨基酸末端激酶(p-JNK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的表达水平;流式细胞仪测定海马组织中细胞内钙离子水平。结果:甘草酸苷可以有效减少SE发作后血清和海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 的释放水平,注射甘草酸苷后,与SE组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组血清炎症因子表达水平均有不同程度的下调,差异有统计学意义( P<0.01);高剂量组TNF-α表达水平随时间的推移有下降趋势,但差异无统计学意义( P=0. 070);中剂量组注射甘草酸苷后6 h、12 h和24 h,血清IL-1β和IL-6水平随时间推移明显下降( P=0.030, 0.012);而在低剂量组,随时间的推移TNF-α和IL-6水平呈升高趋势,但差异无统计学意义( P=0.235,0.229),IL-1β 呈明显升高趋势( P=0.034)。同时甘草酸苷还可抑制海马组织细胞内Ca 2+的上调( P<0.05);中、高剂量甘草酸苷还能有效下调SE导致的海马组织中HMGB、RAGE、p-ERK/ERK和p-JNK/JNK 比值异常升高( P<0.05)。 结论:甘草酸苷可以通过抑制HMGB1/RAGE、ERK和JNK信号通路对SE大鼠模型发挥保护作用。
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编辑人员丨1周前
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1,25(OH) 2D 3对柯萨奇病毒B3诱导小鼠心肌炎症反应的影响及机制
编辑人员丨1周前
目的:探讨1,25二羟维生素D 3[1,25(OH) 2D 3]对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导小鼠心肌炎症反应的影响及机制。 方法:将雄性野生型(WT)小鼠和1α羟化酶基因敲除[1(OH)ase -/-]小鼠分为WT组、WT+CVB3组、1(OH)ase -/-+CVB3组和1(OH)ase -/-+CVB3+VD 3组,每组8只。实时荧光定量PCR测定促炎症因子白细胞介素(IL)1β、IL-6、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA水平;HE染色观察心肌组织病理学改变;TUNEL染色及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡;Fluo-4/AM荧光探针检测心肌细胞内的钙离子含量;Western印迹法检测钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)及内质网应激相关葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达水平。 结果:与WT组相比,WT+CVB3组小鼠心肌中促炎症因子IL-1β(14.88±3.32比1.03±0.02, P=0.009)、IL-6(7.00±1.09比1.81±0.18, P=0.005)、IFN-γ(4.70±1.11比1.34±0.34, P=0.006)、TNF-α(17.20±3.22比1.02±0.12, P<0.001)mRNA水平均升高,炎症细胞浸润增多,心肌细胞凋亡率增加(16.66%±1.09%比7.85%±1.12%, P=0.012),心肌细胞胞质中游离Ca 2+增加(2.98±1.05比0.96±0.10, P=0.006),磷酸化CaMKⅡ(pCaMKⅡ)(1.97±0.34比1.00±0, P<0.001)、GRP78(1.78±0.19比1.00±0, P=0.005)及CHOP(1.62±0.09比1.00±0, P=0.002)蛋白表达增加;上述心肌细胞损伤指标在1,25(OH) 2D 3缺乏的1(OH)ase -/-+ CVB3组更显著;而在给予1,25(OH) 2D 3补充的1(OH)ase -/-+CVB3+VD3组,上述心肌细胞损伤指标均改善(均 P<0.05);此外,CaMKⅡ特异性抑制剂可同样降低CVB3感染小鼠的心肌损伤和细胞凋亡率。 结论:1,25(OH) 2D 3缺乏可通过CaMKⅡ过度活化加重小鼠心肌炎症反应。
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编辑人员丨1周前
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丹曲林对心肌缺血再灌注小鼠室性心律失常易感性的影响及其电生理机制:离体实验
编辑人员丨1周前
目的:评价丹曲林对心肌缺血再灌注小鼠室性心律失常易感性的影响及其电生理机制。方法:SPF级健康雄性C57BL/6小鼠20只,6~8周龄,体重21~25 g,制备Langendorff离体心脏灌注模型。取离体灌注模型制备成功的心脏20个,采用随机数字表法分为对照组和丹曲林组,每组10个。采用停止灌流30 min后恢复灌流的方法建立全心缺血再灌注损伤模型。丹曲林组于再灌注时灌注含20 μmol/L丹曲林钠的Krebs液5 min。再灌注10 min时,通过程序电刺激诱发室性心律失常,记录室性心律失常成功诱发情况和持续时间。于停灌前和再灌注20 min时测定心室有效不应期(ERP)及左心室中段外膜心肌细胞动作电位时程(APD 50和APD 90)。再灌注30~60 min时采用光学标测技术检测心肌细胞内钙离子浓度变化,记录钙瞬变交替发生情况及舒张期细胞内钙离子浓度自发升高(SCaE)幅度。 结果:与对照组比较,丹曲林组室性心律失常诱发率降低,持续时间缩短,再灌注20 min时心室ERP、APD 50和APD 90延长,钙瞬变交替发生率及SCaE幅度降低( P<0.05)。 结论:丹曲林可降低心肌缺血再灌注小鼠室性心律失常的易感性,其电生理机制可能与降低心肌细胞传导性和兴奋性、延长复极时程以及恢复胞内钙离子稳态有关。
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编辑人员丨1周前
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过量氟暴露对体内外星形胶质细胞及其胶质纤维酸性蛋白表达的影响
编辑人员丨1周前
目的:探讨过量氟暴露对体内外星形胶质细胞及其胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法:(1)体内实验:选择24只SPF级SD大鼠,雌雄各半,按性别、体重采用随机数字表法分为对照组和染氟组,每组12只,分别饮用自来水配制的< 1 mg/L和50 mg/L氟化钠溶液,饲养6个月。实验结束后采用免疫荧光法、免疫组织化学法和蛋白质免疫印迹法检测大鼠脑组织GFAP蛋白表达水平。(2)体外实验:分离成年(6月龄)大鼠大脑皮质星形胶质细胞进行原代培养(4 mmol/L氟化钠溶液培养24 h),采用免疫荧光法鉴定星形胶质细胞,实时荧光定量PCR法和蛋白质免疫印迹法分别检测GFAP mRNA及蛋白表达水平,流式细胞术检测星形胶质细胞凋亡情况及钙离子含量。结果:(1)体内实验:免疫荧光法、免疫组织化学法、蛋白质免疫印迹法检测结果均显示,染氟组大鼠脑组织GFAP蛋白表达水平高于对照组(0.440 ± 0.200比0.250 ± 0.120, t =-5.93, P = 0.027;0.270 ± 0.020比0.240 ± 0.050, t =-4.87, P = 0.040;1.017 ± 0.001比0.486 ± 0.006, t =-52.48, P = 0.001)。(2)体外实验:免疫荧光法鉴定结果显示,GFAP阳性,原代培养细胞鉴定为星形胶质细胞;实时荧光定量PCR法检测结果显示,染氟组GFAP mRNA表达水平高于对照组(2.780 ± 0.120比0.134 ± 0.005, t =-37.84, P = 0.001);蛋白质免疫印迹法检测结果显示,染氟组GFAP蛋白表达水平高于对照组(2.76 ± 0.10比1.38 ± 0.05, t =-20.44, P = 0.002);流式细胞术检测结果显示,染氟组细胞凋亡率高于对照组(%:55.0 ± 1.0比3.5 ± 0.6, t =-10.28, P = 0.009),钙离子含量低于对照组(%:54 ± 9比72 ± 13, t = 4.64, P = 0.043)。 结论:过量氟暴露可造成体内外星形胶质细胞GFAP表达增加,细胞凋亡增多,并影响钙信号转导通路。
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编辑人员丨1周前
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3xTg-AD小鼠海马突触可塑性与钙离子跨膜流动特征
编辑人员丨1周前
目的:观察3xTg-AD小鼠海马突触可塑性与钙离子跨膜流动特征。方法:根据基因型不同,将6月龄小鼠分为APP/PS1/tau三转基因AD(3xTg-AD)模型小鼠和野生型(WT)对照组小鼠两组,每组13只。每组随机选取6只小鼠进行在体电生理记录,给予测试刺激记录其海马CA1区场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)、配对脉冲刺激记录双脉冲易化(paired-pulse facilitation,PPF)、高频刺激(high frequency stimulation,HFS)诱导长时程增强(long-term potentiation,LTP)。每组剩余的7只小鼠采用非损伤微测技术(non-invasive micro-test technology,NMT),检测海马CA1区脑片神经元的跨膜钙内流和钙外排情况。3xTg-AD小鼠在电生理和NMT实验中各损失1只,最终入组电生理实验5只,NMT实验6只。采用SPSS 18.0对所有数据进行统计学分析,两组间比较使用两独立样本 t检验。 结果:(1)在体电生理实验中,给予测试刺激后30 min内,3xTg-AD小鼠和WT小鼠的fEPSP斜率均比较稳定,其平均fEPSP斜率分别为[(97.8±2.3)%]和[(92.6±12.6)%],两组之间差异无统计学意义( t=0.91, P>0.05);给予配对脉冲刺激后,3xTg-AD小鼠和WT小鼠的PPF值分别为(1.58±0.69)和(1.74±0.17),两组间差异无统计学意义( t=0.50, P>0.05);给予HFS后30 min和60 min,3xTg-AD小鼠的LTP值分别为[(104.9±10.9)%]和[(98.0±10.8)%],明显低于WT小鼠的[(156.5±21.3)%]( t=4.43, P<0.01)和[(162.5±19.7)%]( t=5.92, P<0.01)。(2)在NMT实验中,3xTg-AD小鼠海马CA1区神经元谷氨酸诱导的标准化跨膜Ca 2+内流平均流速和峰值流速分别为[(-2 166.0±425.0)%]和[(-3 539.6±1 270.9)%],远高于WT小鼠的[(-735.3±262.9)%]( t=6.81, P<0.01)和[(-917.3±271.7)%]( t=4.89, P<0.01);而低钙溶液引起的3xTg-AD小鼠标准化Ca 2+外排平均流速和峰值流速分别为[(1 451.6±297.1)%]和[(1 968.7±227.3)%],显著低于WT对照组小鼠的[(2 579.3±810.9)%]( t=2.92, P<0.05)和[(3 420.4±954.8)%]( t=3.31, P<0.01)。 结论:6月龄3xTg-AD小鼠出现的海马突触可塑性损伤可能与钙内流增加和钙外排减少所导致的海马神经元胞内Ca 2+超载密切相关。
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编辑人员丨1周前
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钙库操纵的钙离子通道抑制剂对百草枯致肝肾损伤的作用
编辑人员丨1周前
目的:探讨钙库操纵的钙离子通道(store-operated calcium entry, SOCE)抑制剂SKF96365对百草枯(paraquat, PQ)致肝肾损伤的作用。方法:体外培养A549细胞,分为对照组(DMSO组、SKF 2 μmol/L组,SKF 10 μmol/L组),PQ组(PQ+DMSO组、PQ+SKF 2 μmol/L组,PQ+SKF 10 μmol/L组)。采用荧光素酶报告基因技术检测A549细胞活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)激活水平变化。构建PQ中毒的小鼠模型,分为对照组、SKF组、PQ组、PQ+SKF组。PQ组按照50 mg/kg腹腔注射PQ;SKF组按照10 mg/kg每天腹腔注射SKF96365,共注射3 d。PQ+SKF组按照50 mg/kg腹腔注射PQ一次,按照10 mg/kg每天腹腔注射SKF96365,共注射3 d。第4天处死小鼠取肝肾组织,苏木精-伊红(H&E)染色观察肝脏、肾脏组织病理学变化,TUNEL染色观察肝肾组织凋亡情况。正态分布计量资料多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD- t检验。 结果:荧光素酶报告基因技术检测结果显示PQ组NFAT明显被激活,给予SKF96365预处理后,NFAT激活明显下降,且具有剂量依赖性。HE染色提示PQ染毒组肝脏、肾脏组织轮廓结构不清、细胞肿胀,大量炎性细胞浸润;PQ+SKF组肝脏细胞肿胀减轻,炎性细胞浸润明显减少。TUNEL染色提示PQ染毒组肝脏、肾脏组织凋亡细胞增加,PQ+SKF组凋亡明显减少。结论:SOCE抑制剂SKF96365能够明显减轻PQ引起的肝脏、肾脏损伤。
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编辑人员丨1周前
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一种动态观察大鼠胰腺腺泡细胞Ca 2+浓度的流式检测方法
编辑人员丨1周前
目的:探索一种简便的动态检测胰腺腺泡细胞内钙离子浓度的方法。方法:无菌采集大鼠胰腺,去除脂肪和淋巴组织,37 ℃预热的胶原酶消化胰腺组织,分离大鼠胰腺腺泡细胞。加入钙离子荧光探针Fluo-3/AM负载腺泡细胞,流式细胞仪动态监测腺泡细胞内钙离子浓度变化。结果:对照组腺泡细胞处于静息状态,钙离子荧光强度稳定,8只大鼠胰腺腺泡细胞内钙离子浓度随时间变化趋势一致,平均荧光强度值为307.75±36.45( n=8);刺激组加入牛磺胆酸钠后腺泡细胞钙离子荧光强度升高,第27.76秒达峰值,检测结果稳定。 结论:流式细胞仪为腺泡细胞钙离子浓度和细胞功能研究、及后续急性胰腺炎发病机制的研究提供另一简便易行的方法。
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编辑人员丨1周前
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慢性淋巴细胞白血病细胞损害CD8 +T细胞的线粒体代谢功能影响CAR-T细胞效能的体外试验研究
编辑人员丨1周前
目的:通过体外试验探究慢性淋巴细胞白血病细胞损害CD8 +T细胞的线粒体代谢功能影响嵌合抗原受体的T淋巴细胞(chimeric antigen receptors modified T cells,CAR-T)的效能。 方法:将培养得到的CAR-T细胞和CD8 +T细胞作为正常组,感染组为加入慢性淋巴细胞白血病细胞进行侵染的CAR-T细胞和CD8 +T细胞。采用FACScan流式细胞仪检测CAR-T细胞的凋亡情况;Western blot检测细胞凋亡相关的蛋白Bcl-2、cleaved-caspase-3和Bax的相对表达量;酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-10的变化;使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度;化学发光发检测细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平,分光光度计检测线粒体丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量;荧光探针法检测胞内钙离子浓度的变化,实时荧光定量PCR检测线粒体DNA表达水平的变化。 结果:正常组CAR-T细胞凋亡率显著低于感染组CAR-T细胞凋亡率,差异有统计学意义[(4.58±0.16)%比(7.06±0.74)%, χ2=5.674, P<0.05]。感染组的Bax和cleaved-PARP表达量明显高于正常组,Bcl-2表达量明显低于正常组,差异具有统计学意义[(3.51±0.01)%比(1.07±0.01)%,(2.34±0.05)%比(1.36±0.04)%,(0.66±0.02)%比(1.17±0.02)%, χ2值分别为298.838,26.509和31.231, P值均<0.05]。感染组的IL-6、TNF-α表达量较正常组明显升高,IL-10表达量较正常组明显降低,组间差异具有统计学意义[(87.69±21.07)ng/L比(43.25±5.36)ng/L,(65.12±15.75)ng/L比(33.14±5.23)ng/L,(16.02±1.69)ng/L比(24.33±2.33)ng/L, t值分别为3.54,3.338和4.988, P值均<0.05]。感染组的ATP和总钙离子浓度低于正常组,差异具有统计学意义[(0.15±0.03)μmol/g比(0.32±0.06)μmol/g,(12.46±2.74)μmol/L比(25.97±3.49)μmol/L, t值分别为4.389和5.274, P值均<0.05]。感染组的MDA含量高于正常组,GSH含量低于正常组,差异具有统计学意义[(1.84±0.23)μmol/L比(1.34±0.21)μmol/L,1.07±0.17)pg/mg比(5.23±0.36)pg/mg, t值分别为2.781和18.098, P值均<0.05]。感染组CD8 +T细胞线粒体基因蛋白的表达量明显低于正常组,差异具有统计学意义[(0.62±0.03)%比(1.01±0.06)%, χ2=10.070, P<0.05]。 结论:离体状态下慢性淋巴细胞白血病细胞通过损害CD8 +T细胞的线粒体代谢功能促进CAR-T细胞的凋亡。
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编辑人员丨1周前
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T型钙通道在肿瘤中的研究进展
编辑人员丨1周前
在非兴奋型细胞中,电压门控性T型钙通道可通过激活、失活及缓慢灭活状态调控细胞内外钙离子浓度和膜电位。上述特性使得T型钙离子通道参与了多种肿瘤细胞的生物学特性的调控,包括细胞的增殖、分化、凋亡及侵袭、转移等。通过药物或基因方法抑制T型钙通道活性,可改变细胞相应通道电流和细胞内外离子分布,进而调控肿瘤细胞的生物学特性。本文对肿瘤进展过程中T型钙离子通道的电生理变化进行综述,以望为肿瘤发生发展的机制研究与治疗提供科学依据。
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编辑人员丨1周前
