WUSCHEL-Related Homeobox(WOX)家族是植物特有的一类转录因子,在干细胞维持和器官形态建成等发育过程中发挥重要的调控作用.兰科珍稀名贵中药植物铁皮石斛(Dendrobium catenatum)具有独特的附生生活方式和生长发育特性,对其WOX家族基因功能探究有助于进一步了解铁皮石斛发育的保守性和特异性.本研究对铁皮石斛 WOX 家族基因(DcWOX)进行了系统进化、组织表达模式、异源表达功能检测等分析.结果显示,铁皮石斛WOX家族基因可分为 3 个进化支,具有显著差异的组织表达谱;在转基因拟南芥中,DcWOX4过表达导致植株显著矮小,叶缘羽状深裂,花期推迟 2 周;DcWOX9过表达导致植株矮化,叶缘锯齿状,开花推迟 1 周,强表型植株雌雄蕊均不育;DcWOX11 过表达导致叶缘向下卷曲;DcWOX4/9/11 过表达拟南芥叶片形态建成异常与TCP家族基因和CUC家族基因的下调以及KNOX家族基因的上调有关;花期推迟与FT、SOC1和CO等早花基因的下调有关.因此,本研究表明铁皮石斛WOX家族基因在调控植株形态建成、叶发育、开花时间和育性等方面具有重要功能,进一步拓展了对 WOX 家族基因的功能了解,为深入探讨兰科植物进化与发育的保守性和独特性提供参考.

转化酶抑制子(Invertase Inhibitor,InvInh)能调控转化酶的活性,在植物的蔗糖代谢过程中具有重要作用.本研究旨在从珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中克隆InvInh家族基因,并对其进行定量表达以及生物信息学分析.结果显示:从铁皮石斛叶中克隆到3个InvInh基因,分别命名为DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3,分别编码176、177和188个氨基酸.生物信息学分析表明,DoInvInh蛋白都具有1个信号肽、2个跨膜结构以及PMEI蛋白的保守结构域.DoInvInh蛋白的氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点和SP位点.荧光定量PCR分析发现,在根、茎、叶和花中都能检测到3个DoInvInh基因表达.DoInvInh2和DoInvInh3基因在根中表达量最低,而在花中表达量最高.DoInvInh1和DoInvInh3基因在铁皮石斛不同生长年限茎中的表达模式相似,都是在1年生茎中表达量最高,2年生茎中次之,在3年生茎中表达量最低.DoInvInh2基因在2年生茎中基因表达量最高.DoInvInh1和DoInvInh3基因表达量与CIN酶活性都呈显著负相关,推测这2个基因可能在调节茎中CIN酶活性中起作用.

该研究借助RACE技术克隆了铁皮石斛己糖转运蛋白(hexose transporter,HT)基因DoHT1,对其序列特征进行生物信息分析,并采用定量PCR分析基因表达模式.结果表明,DoHT1基因(GenBank注册号KU160469)cDNA全长1 586 bp,ORF长1 536 bp,编码1条由511个氨基酸组成的多肽,56.18 kDa,等电点9.08.DoHT1蛋白含有糖转运蛋白协助扩散超家族保守结构域(22 ～ 483)、糖转运基序1(139～164)、糖转运基序2(338 ～355)和功能基序;无信号肽,含11个跨膜域,预测定位在质膜,与多种植物HTs蛋白有较高的一致性(54.7％ ～80.7％),隶属于MST(单糖转运蛋白)分支,与小兰屿蝴蝶兰亲缘关系最近.DoHT1基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛叶中显著最高,茎中次为,分别为根中的19.36,1.82倍.该研究获得DoHT1基因全长及分子特征,为进一步研究其在铁皮石斛糖代谢调控中的作用奠定基础.

目的 克隆浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.肌动蛋白(Actin)基因,并进行生物信息学分析.方法 提取浙贝母根、茎、叶、花、鳞茎总RNA,设计合成简并引物.以叶片总RNA为模板,通过RT-PCR和Ta克隆技术克隆Actin基因保守区序列片段.以该基因为内参基因,对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因进行组织特异性表达分析.结果 经RT-PCR扩增和Ta克隆,得到1段基因序列(463 bp).浙贝母Actin基因与岷江百合、郁金香、虎眼万年青、铁皮石斛、柿子、光皮桦、玉米相似度较高(84％～98％),其氨基酸序列与阿帝露茅膏菜、甘蓝型油菜、香草兰、岷江百合、麻疯树、枸杞、红海榄的同源性均在89％以上,并且其Actin蛋白与百脉根、岷江百合、郁金香亲缘关系较近.HMGR基因在该植物各部位表达有显著差异,依次为鳞茎＞花＞叶＞茎＞根.结论 首次从浙贝母中克隆出Actin基因(命名为FtActin),可为其有效利用奠定基础.

目的 探讨"以广南者为佳"的广西铁皮石斛种源的主要来源,建立广西铁皮石斛HPLC特征图谱分析方法.方法 采用Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液(梯度洗脱);检测波长为340 nm;柱温为35℃;流速为1.0 mL/min.结果 12批广西铁皮石斛可分为2类,其中第Ⅰ类10批样品(产于广西丹霞地貌),标示出10个共有峰,相似度为0. 856~0.970;第Ⅱ类2批(产于石灰岩地貌),共标示出9个共有峰,此2批石斛与第Ⅰ类共有模式的相似度分别为0.422、0.332.在选取的保留时间范围内,对照药材、福建丹霞种、浙江种、云南种与广西种第Ⅰ类铁皮石斛共有模式比较,相似度分别为0.575、0.158、0.397、0.757.结论 广西容县、桂平等广西丹霞地貌原生的铁皮兰为"以广南者为佳"之广西铁皮石斛的代表性承载主体,且与云南广南等地的种源相似度较高,但与广东、福建等地丹霞地貌种、浙江本地种存在一定差异.建议《中国药典》采用的铁皮石斛对照药材应充分考虑这种不同道地种源之间的差异.

目的 克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛蛋白磷酸酶(protein phosphatase,PP)DoPP2C1基因,并进行生物信息学和表达模式分析.方法 采用实时定量PCR(qRT-PCR)和RACE技术获基因全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助qRT-PCR检测基因表达模式.结果 分离到DoPP2C1基因(GenBank注册号KJ995533),cDNA全长1 221 bp,编码1条由285个氨基酸组成的多肽,相对分子质量31 080,等电点6.18;推定的DoPP2C1氨基酸序列具有植物PP2C蛋白家族保守的1个PP2C结构域(27-285);该蛋白预测无信号肽或跨膜域,定位在细胞质;DoPP2C1蛋白与多种植物PP2C蛋白一致性较高(56.3％～73.7％),与水稻OsPP2C62、高粱XP_002462907、大麦BAK00362和乌拉尔图小麦EMS47641蛋白等亲缘关系近,聚在PP2C分子进化树的F1分支;DoPP2C1基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛根和茎中表达量较高,分别为叶中的7.57倍和1.79倍.结论 获得DoPP2C1基因分子特征,为深入研究该基因在铁皮石斛生长发育、逆境生理以及次级代谢调控中的生物学功能奠定基础.

目的 克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析.方法 采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况.结果 克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(GenBank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸.DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232.DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低.不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关.结论 克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长cDNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础.

铁皮石斛是一种兰科石斛属药用植物,其干燥茎为名贵中药铁皮石斛,具有益胃生津、滋阴清热的功效.铁皮石斛自然资源濒临枯竭,依赖人工种植生产药材,目前种植面积已经超过10万亩,年产量万吨以上.优良品种是保障中药品质的前提,种质资源是选育优良品种的基础.本文归纳了现有主要铁皮石斛品种的特点,对铁皮石斛种质资源和遗传育种的研究进展进行了综述,期望能够为这两个方面的深入研究提供科学依据.

为了探索人工栽培白及的适宜条件,该研究以湖北省十堰市野生白及为对象,采用同源克隆和3′RACE技术,从白及(Bletilla striata)中获得与热激蛋白合成有关的BsHsp17.3基因,并分析BsHsp17.3基因对不同胁迫的响应.结果表明:BsHsp17.3基因开放阅读框长度为453 bp,编码150个氨基酸;蛋白的分子量为17.42 kD,等电点为6.33.进化树分析表明BsHSP17.3蛋白与同为兰科的铁皮石斛进化关系较近,同在一分支上.半定量RT-PCR分析显示BsHsp17.3基因在白及根、叶、鳞茎及花组织中的表达具有特异性,且BsHsp17.3基因在叶中的表达量较高,在鳞茎及花中不表达.实时荧光定量PCR检测显示BsHsp17.3对非生物胁迫高温、低温具有明显应答反应,20％PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达,推测该基因在白及防止倒苗过程中可能发挥一定作用.

运用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和巢式PCR技术克隆出铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因(Thiore-doxin like 2,DoTrxL2).序列分析表明DoTrxL2基因开放阅读框(ORF)长度为639 bp,编码213个氨基酸,编码产物含有一个硫氧还蛋白家族保守的CXXC功能结构域,通过两个半胱氨酸的双硫键得失电子,起到氧化还原作用.分子进化分析显示,DoTrxL2同小兰屿蝴蝶兰、石刁柏亲缘关系较近.qRT-PCR分析显示,DoTrxL2在铁皮石斛原球茎不同发育时期及不同组织中均有表达差异,其中在原球茎形成早期表达量较高,表明该基因对原球茎形成有着促进作用;而在种子和花中表达量高,表明该基因对植物组织的生殖发育具有重要调控作用.