目的:探讨铁皮石斛叶发酵液对酒精性肝炎（AH）小鼠的干预效果及机制。方法:选取70只6~8周龄近交品系C57BL/6J雄性小鼠，按随机数字表法分为正常组（NG）、模型组（MG）、液体饲料对照组（CG）、水飞蓟宾组（SI）及铁皮石斛叶发酵液低剂量组（DL）、中剂量组（DM）、高剂量组（DH），每组10只。NG组给予普通饲料喂养，CG组给予对照饲料（LB酒精液体对照饲料），SI组给予LB酒精液体饲料及水飞蓟宾灌胃，DL、DM和DH组分别给予LB酒精液体饲料及25%、50%、100%浓度的铁皮石斛叶发酵液灌胃。LB酒精液体饲料喂养8周建立AH模型。第8周取小鼠眼球血，检测丙氨酸转氨酶（ALT）、甘油三酯（TG）、转铁蛋白（TRF）、白细胞介素（IL）-6、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）等含量；并取肝组织行HE、油红O、普鲁士蓝和免疫荧光ROS染色；肝组织匀浆检测谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量；PCR及Western 印迹法检测腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、AMPKβ1、磷酸化AMPKβ1（p-AMPKβ1）、抑癌基因p53（p53）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GXP4）的mRNA及蛋白相对表达量，以分析铁皮石斛叶发酵液对AH小鼠的干预效果及机制。结果:与MG组相比，DL、DM、DH组小鼠血清ALT和TG均降低［ALT分别为（45.94±19.85）、（45.73±22.62）、（41.68±7.13）比（75.51±17.76）U/L；TG分别为（0.90±0.23）、（0.69±0.22）、（0.41±0.20）比（1.28±0.19）mmol/L，均 P<0.05］；IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ均降低（均 P<0.05）；DM、DH组小鼠血清TRF、IL-10均升高（均 P<0.05）。与模型组相比，DL、DM、DH组小鼠肝组织MDA均降低［分别为（0.41±0.05）、（0.40±0.03）、（0.43±0.14）比（0.64±0.06）μmol/g］，GSH均升高（均 P<0.05）。与模型组相比，DL、DM、DH组小鼠肝组织AMPK（分别为1.36±0.11、1.61±0.17、1.68±0.11比0.80±0.12）、SLC7A11（分别为0.91±0.12、0.97±0.12、0.99±0.13比0.60±0.14）、GPX4（分别为0.51±0.11、0.63±0.17、0.83±0.15比0.42±0.14）的mRNA表达量均增加（均 P<0.05）。与模型组相比，DL、DM、DH组小鼠肝组织AMPKβ1、p-AMPKβ1、SLC7A11和GPX4的蛋白相对表达量均增加，p53蛋白相对表达量降低（均 P<0.05）。与模型组相比，DL、DM、DH组小鼠肝组织脂肪变性、小叶内炎症程度减轻，肝组织铁染色、ROS染色变浅。 结论:铁皮石斛叶发酵液可减轻小鼠AH的严重程度，其机制可能与上调AMPK抑制p53/SLC7A11/GPX4介导的铁死亡通路有关。

目的 探讨铁皮石斛叶发酵液对小鼠酒精性肝炎的干预机制.方法 将70只健康雄性6～8周C57BL/6J小鼠随机分为正常组,模型组,液体饲料对照组,水飞蓟宾组,铁皮石斛叶发酵液低剂量组、中剂量组及高剂量组,共7组,每组各10只.正常组小鼠喂养普通饲料,其他各组小鼠采用Lieber-DeCarli经典法液体饲料饲养8周,诱导小鼠酒精性肝炎模型.造模期间,铁皮石斛叶发酵液低、中、高剂量组小鼠饮用威门石斛水,其余各组小鼠饮用纯净水;正常组、模型组、液体饲料对照组每日给予生理盐水灌胃,水飞蓟宾组给予水飞蓟宾0.25 mL/10 g,铁皮石斛叶发酵液低、中、高剂量组分别给予0.125 mL/10 g、0.250 mL/10 g、0.375 mL/10 g铁皮石斛叶发酵液灌胃,1次/d.第8周水合氯醛腹腔注射麻醉,眼球取血,分离血清采用生化方法检测AST、ALT水平;HE染色和油红O染色观察小鼠肝组织病理学以及脂质积累情况.Luminex多因子检测小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α及CCL2水平;实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫荧光方法检测小鼠肝组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、GSDMD-N端、IL-18和IL-1β的蛋白表达.计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验.结果 与正常组比较,模型组小鼠血清AST、ALT、IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2水平均显著升高(P值均<0.05).与模型组相比,铁皮石斛叶发酵液高剂量组小鼠血清AST、ALT、IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2均明显降低(P值均<0.05).HE染色结果显示,模型组小鼠肝小叶结构紊乱,有大量的脂肪变性空泡及细胞坏死;与模型组比较,铁皮石斛叶发酵液高剂量组小鼠肝组织病理损伤减轻,大部分肝小叶结构完整,仅少量炎性细胞浸润.油红O染色结果显示,模型组小鼠肝脏出现大脂滴和小脂滴积聚,肝脂肪含量显著增加;与模型组比较,铁皮石斛叶发酵液高剂量组小鼠肝组织脂肪变性明显减轻,多以小脂滴散在存在.肝组织免疫荧光结果显示,模型组小鼠肝细胞胞质中GSDMD阳性染色面积比较正常组显著增加(P<0.001);铁皮石斛叶发酵液高剂量组小鼠肝细胞胞质中GSDMD阳性染色面积比与模型组比较显著下降(P<0.001).实时荧光定量PCR和Western Blot检测结果显示,与正常组比较,模型组小鼠肝组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、GSDMD-N端、IL-18和IL-1β蛋白表达水平显著增加(P值均<0.05);与模型组相比,铁皮石斛叶发酵液高剂量组NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、GSDMD-N端、IL-18和IL-1β蛋白表达水平明显降低(P值均<0.05).与模型组相比,铁皮石斛叶发酵液高剂量组Caspase-1和Caspase-11蛋白表达水平均明显降低(P值均<0.05),其中Caspase-1蛋白相对表达量为1.757,较模型组下降26.6%,Caspase-11蛋白相对表达量为0.455,较模型组下降70.3%;Caspase-11较Caspase-1下降幅度更大.结论 铁皮石斛叶发酵液可减轻小鼠酒精性肝炎,其机制可能与抑制Caspase-11介导的非经典细胞焦亡通路有关.

目的 探讨铁皮石斛叶发酵液对酒精性肝炎(AH)小鼠的干预效果及机制.方法 选取70只6～8周龄近交品系C57BL/6J雄性小鼠,按随机数字表法分为正常组(NG)、模型组(MG)、液体饲料对照组(CG)、水飞蓟宾组(SI)及铁皮石斛叶发酵液低剂量组(DL)、中剂量组(DM)、高剂量组(DH),每组10只.NG组给予普通饲料喂养,CG组给予对照饲料(LB酒精液体对照饲料),SI组给予LB酒精液体饲料及水飞蓟宾灌胃,DL、DM和DH组分别给予LB酒精液体饲料及25％、50％、100％浓度的铁皮石斛叶发酵液灌胃.LB酒精液体饲料喂养8周建立AH模型.第8周取小鼠眼球血,检测丙氨酸转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、转铁蛋白(TRF)、白细胞介素(IL)-6、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)等含量;并取肝组织行HE、油红O、普鲁士蓝和免疫荧光ROS染色;肝组织匀浆检测谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量;PCR及Western印迹法检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、AMPKβ1、磷酸化AMPKβ1(p-AMPKβ1)、抑癌基因p53(p53)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GXP4)的mRNA及蛋白相对表达量,以分析铁皮石斛叶发酵液对AH小鼠的干预效果及机制.结果 与MG组相比,DL、DM、DH组小鼠血清ALT和TG均降低[ALT分别为(45.94±19.85)、(45.73±22.62)、(41.68±7.13)比(75.51±17.76)U/L;TG 分别为(0.90±0.23)、(0.69±0.22)、(0.41±0.20)比(1.28±0.19)mmol/L,均P＜0.05];IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-y 均降低(均P＜0.05);DM、DH组小鼠血清TRF、IL-10均升高(均P＜0.05).与模型组相比,DL、DM、DH组小鼠肝组织MDA均降低[分别为(0.41±0.05)、(0.40±0.03)、(0.43±0.14)比(0.64±0.06)μmol/g],GSH均升高(均P＜0.05).与模型组相比,DL、DM、DH组小鼠肝组织AMPK(分别为1.36±0.11、1.61±0.17、1.68±0.11比0.80±0.12)、SLC7A11(分别为0.91±0.12、0.97±0.12、0.99±0.13 比0.60±0.14)、GPX4(分别为0.51±0.11、0.63±0.17、0.83±0.15 比0.42±0.14)的 mRNA表达量均增加(均P＜0.05).与模型组相比,DL、DM、DH组小鼠肝组织AMPKβ1、p-AMPKβ1、SLC7A11和GPX4的蛋白相对表达量均增加,p53蛋白相对表达量降低(均P＜0.05).与模型组相比,DL、DM、DH组小鼠肝组织脂肪变性、小叶内炎症程度减轻,肝组织铁染色、ROS染色变浅.结论 铁皮石斛叶发酵液可减轻小鼠AH的严重程度,其机制可能与上调AMPK抑制p53/SLC7A11/GPX4介导的铁死亡通路有关.

目的 克隆金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)基因,并进行生物信息学及接茵前后差异表达分析.方法 采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得DnHMGR2基因cDNA全长;生物信息学分析编码蛋白的理化特性、结构域等特征;用DNASTAR、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建分析;借助实时定量PCR技术检测基因接菌前后表达模式.结果 从金钗石斛中分离得到一个HMGR基因,命名为DnHM GR2(GenBank注册号KX825920).DnHMGR2基因cDNA全长2 095 bp,编码一条由562个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为59.68×103,等电点6.18.DnHM GR2蛋白具有植物HMGR酶的典型结构域和结合基序.DnHMGR2与多种植物HMGR基因高度同源,与铁皮石斛的亲缘关系最近.DnHM GR2基因具有组织表达特异性,在金钗石斛叶、茎中的表达量较高,为根中的2.59和1.60倍;但接菌后各器官的表达量表现为茎＞叶＞根.结论 首次克隆得到金钗石斛中HMGR基因的全长cDNA,为进一步解析该基因在金钗石斛萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用,及茵根真菌对石斛碱生物合成调控机制奠定了基础.

转化酶抑制子(Invertase Inhibitor,InvInh)能调控转化酶的活性,在植物的蔗糖代谢过程中具有重要作用.本研究旨在从珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中克隆InvInh家族基因,并对其进行定量表达以及生物信息学分析.结果显示:从铁皮石斛叶中克隆到3个InvInh基因,分别命名为DoInvInh1、DoInvInh2和DoInvInh3,分别编码176、177和188个氨基酸.生物信息学分析表明,DoInvInh蛋白都具有1个信号肽、2个跨膜结构以及PMEI蛋白的保守结构域.DoInvInh蛋白的氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点和SP位点.荧光定量PCR分析发现,在根、茎、叶和花中都能检测到3个DoInvInh基因表达.DoInvInh2和DoInvInh3基因在根中表达量最低,而在花中表达量最高.DoInvInh1和DoInvInh3基因在铁皮石斛不同生长年限茎中的表达模式相似,都是在1年生茎中表达量最高,2年生茎中次之,在3年生茎中表达量最低.DoInvInh2基因在2年生茎中基因表达量最高.DoInvInh1和DoInvInh3基因表达量与CIN酶活性都呈显著负相关,推测这2个基因可能在调节茎中CIN酶活性中起作用.

类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK)通过感应钙信号,在植物生长发育、逆境生理等生命活动中发挥重要作用.本研究利用RACE技术首次从珍稀药用铁皮石斛中克隆到4个CIPK基因cDNA全长,DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4 (GenBank 注册号KT957557、KT957558、KT957559和KT957560),编码蛋白分别含473、449、451、440个氨基酸,分子质量依次为53.50、50.93、51.50、50.16 kDa,等电点7,99、9.25、8.81、9.11;与多种植物CIPKs蛋白一致性在70％～90％、69％～80％、78％～93％、66％～82％之间;各含1个蛋白激酶的保守结构域(分别为第21～275、14～268、16～271、12～266位氨基酸)、1个CIPK家族特有的NAF/FISL结构域(335～391、313～370、310～369、305～362)和多个功能基元;4个蛋白均无信号肽或跨膜域,预测主要分布在质膜、内质网等亚细胞水平,与拟南芥AtCIPK24三维结构类似;DoCIPK1、DoCIPK3分别隶属于拟南芥和水稻CIPKs分子进化树的E、A类群,DoCIPK2和DoCIPK4属于C类群;DoCIPK1基因在石斛叶和茎中的相对表达量无显著差异,根中表达量为叶中的0.35倍;DoCIPK3转录本在茎和根中的丰度分别为叶中3.36倍和3.47倍;DoCIPK2与DoCIPK4的表达模式相似,二者在叶和茎中的相对表达量无显著差异,根中表达量分别为叶中的2.08倍和7.86倍.DoCIPK1、DoCIPK2、DoCIPK3和DoCIPK4基因克隆、生物信息特征及表达特性为下一步研究基因在铁皮石斛生理适应中的分子功能奠定基础.

该研究借助RACE技术克隆了铁皮石斛己糖转运蛋白(hexose transporter,HT)基因DoHT1,对其序列特征进行生物信息分析,并采用定量PCR分析基因表达模式.结果表明,DoHT1基因(GenBank注册号KU160469)cDNA全长1 586 bp,ORF长1 536 bp,编码1条由511个氨基酸组成的多肽,56.18 kDa,等电点9.08.DoHT1蛋白含有糖转运蛋白协助扩散超家族保守结构域(22 ～ 483)、糖转运基序1(139～164)、糖转运基序2(338 ～355)和功能基序;无信号肽,含11个跨膜域,预测定位在质膜,与多种植物HTs蛋白有较高的一致性(54.7％ ～80.7％),隶属于MST(单糖转运蛋白)分支,与小兰屿蝴蝶兰亲缘关系最近.DoHT1基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛叶中显著最高,茎中次为,分别为根中的19.36,1.82倍.该研究获得DoHT1基因全长及分子特征,为进一步研究其在铁皮石斛糖代谢调控中的作用奠定基础.

目的:对2个道地种源(丹霞种、云南广南种)铁皮石斛中的黄酮苷成分进行提取分离、纯化及结构鉴定,为确认铁皮石斛的共性黄酮苷成分提供实验依据.方法:①采用70％乙醇提取两个产地铁皮石斛叶的总黄酮成分,依次采用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取粗提物,运用大孔吸附树脂AB-8,LH-20型羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)以及ODS柱色谱对水饱和正丁醇萃取部位进行分离纯化,通过化合物的理化性质结合HPLC,ESI-MSn,1H-NMR,13C-NMR等现代波谱学方法鉴定黄酮苷结构.②利用HPLC分析比较不同道地种源(丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种)铁皮石斛的黄酮苷共有成分.结果:从2个产地铁皮石斛叶中共分离得到了5个黄酮苷化合物,经鉴定为芦丁,新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ,佛莱心苷,异佛菜心苷.4个不同道地种源(丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种)铁皮石斛茎中均能检出新西兰牡荆苷Ⅱ,新西兰牡荆苷Ⅰ特征峰,其中新西兰牡荆苷Ⅱ丰度相对较大,而佛莱心苷、异佛莱心苷在云南广南种、广西铁皮兰种中出峰明显,芦丁则在丹霞种中尤为突出.结论:新西兰牡荆苷Ⅱ为铁皮石斛不同道地种源(丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种)的共性黄酮苷成分,可作为铁皮石斛特征图谱的参照物.

目的 优选大孔吸附树脂纯化铁皮石斛叶总黄酮的工艺条件.方法 采用静态吸附-解吸方法,以吸附量和解吸率为指标,优选大孔吸附树脂型号;采用单因素试验分别考察上样浓度、上样体积、洗脱剂及其用量,以铁皮石斛叶总黄酮的纯度为指标,优选大孔吸附树脂纯化铁皮石斛叶总黄酮的最佳工艺条件.结果 ADS-17型大孔吸附树脂对铁皮石斛叶总黄酮的纯化效果最优,最优纯化工艺条件为上样液总黄酮浓度0.7 mg.mL-1,上样体积30mL,洗脱剂为50％乙醇,洗脱剂用量为7 BV.总黄酮的纯度为(18.07±-0.42)％,回收率为(39.91±0.30)％.结论 ADS-17型大孔吸附树脂在所确定的工艺条件下能有效分离纯化铁皮石斛叶中的总黄酮成分,黄酮纯度提升17倍左右.

以铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)('TP35')经自然突变的白绿杂色突变体('TP-MA')和太空诱变的绿黄杂色突变体('TP-MG')为材料,研究不同光照强度(0、50、100 μmol·m-2· s-1)处理后,植株叶片的叶绿体超微结构、光合色素含量以及叶绿素荧光动力学参数的变化规律,并阐明叶色突变体与正常植株光合特性的差异.结果 显示,'TP-MA'和'TP-MG'的叶绿体形态均发生了一定程度的缺失,且叶绿体分布不均匀、无规则,基粒片层结构不完整且排列疏松,基本与其表型性状相一致.'TP-MA'光合色素的含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSⅡ及Fv'/Fm'等显著低于'TP35',但非光化学淬灭系数(NPQ和qP)则相对较高;'TP-MG'的光合色素含量及叶绿素荧光参数均低于'TP35',但差异不显著,且对较强的光照(100 μmol·m-2·s-1)条件具有一定的适应性.研究结果表明不同光强处理后,铁皮石斛叶色突变体的叶绿体结构和光合生理指标均发生了不同程度的变化,且对植株的叶绿素含量及荧光参数产生一定影响,过低和过高的光照强度均不利于植株的正常生长.