目的 构建表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Omicron BA.1变异株S1蛋白的真核表达载体,在CHO-K1细胞中进行表达,评价其免疫原性,并对佐剂和抗原剂量进行研究.方法 构建重组质粒UCOE-Omi-S1,转染至CHO-K1工程细胞中进行表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blot法实验鉴定重组S1蛋白.将BALB/c小鼠随机分为12组,即 PBS组,无佐剂组(高、中、低剂量组),铝盐佐剂对照组,MF59佐剂对照组,铝盐佐剂实验组(高、中、低剂量组),MF59佐剂实验组(高、中、低剂量组),将按照分组要求配比的溶液经小鼠肌内注射3次,间隔14天,每2周尾静脉采血,末次免疫30天后取血分离血清,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清抗体水平,并和SARS-CoV-2原型株的假病毒和SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株的假病毒进行假病毒中和实验.结果 目的蛋白在CHO-K1工程细胞表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为70kDa处可见1条特异性蛋白表达条带,经Western blot法鉴定为Omi-S1蛋白.铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果优于无佐剂组,铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果相差不大,但MF59佐剂起效快;高、中、低剂量组的免疫诱导效果在第8周相差不大,但高剂量组起效快.假病毒中和实验表明,MF59佐剂实验组针对Omicron变异株的中和抗体水平高于铝盐佐剂组.结论 本研究所构建的Omicron S1重组蛋白免疫原性良好,在小鼠体内产生了良好的体液免疫应答,并诱导高水平的对抗SARS-CoV-2假病毒的中和抗体,对佐剂和抗原剂量初步研究,结果显示,10μg以下抗原剂量搭配MF59佐剂可获得较好的免疫效果.本研究为SARS-CoV-2变异株的重组蛋白疫苗的研制提供了实验基础.

目的:探讨提前给予脂多糖(LPS)对支气管哮喘(哮喘)预防的作用及相关免疫机制，为哮喘的预防和治疗提供理论依据。方法:提前用LPS处理BALB/c背景6～8周小鼠，然后用卵清蛋白(OVA)联合铝佐剂诱导小鼠哮喘模型，阴性对照组用无菌生理盐水，分为以下4组：LPS给药1次组(LPS1组)，LPS给药2次组(LPS2组)，阴性对照组(NS组)，OVA组。通过肺功能检测气道阻力、肺组织病理染色、支气管肺泡灌洗液分类细胞计数、酶联免疫吸附试验测Th2型细胞因子及白细胞介素6(IL-6)、IL-10，流式细胞术测肺组织调节性T细胞(Treg)比例等方法探索LPS对哮喘有无预防作用。结果:LPS预处理小鼠在OVA诱导后，肺组织苏木精-伊红染色、过碘酸-希夫染色提示炎症减轻，炎细胞浸润减少，肺组织匀浆IL-5、IL-6、IL-13降低，LPS2组IL-10及Treg比例增高，与OVA组比较差异有统计学意义。结论:LPS通过减少Th2型细胞因子及刺激Treg细胞增殖减轻OVA诱导的哮喘炎症反应。

目的:探讨新疆野生荒漠肉苁蓉粗多糖（WCDCP）对卵清白蛋白（OVA）诱导小鼠免疫应答的影响。方法:将42只ICR小鼠按随机数字表法分为7组（每组6只）：9 g/L NaCl组（空白对照组）、WCDCP组（400 μg WCDCP）、OVA组（10 μg OVA）、低剂量WCDCP/OVA组（100 μg WCDCP+10 μg OVA）、中剂量WCDCP/OVA组（400 μg WCDCP+10 μg OVA）、高剂量WCDCP /OVA组（800 μg WCDCP+10 μg OVA）、铝佐剂/OVA组（阳性对照组，200 μg铝佐剂+10 μg OVA）。采用两点注射于小鼠后腿肌内进行免疫，共免疫2次，初次免疫后间隔2周加强免疫1次。分别于初次免疫后7、14、21、28 d称量小鼠体质量，观察小鼠体质量和生长状态变化，并采用间接酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清IgG抗体及抗体分型水平。初次免疫后21 d，采用噻唑蓝法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖水平，流式细胞术检测小鼠脾脏和淋巴结中的T细胞亚群比例。结果:初次免疫后7 d，高剂量WCDCP/OVA组的血清IgG抗体水平（0.597 6±0.110 7）明显高于OVA组（0.254 4±0.074 8）（ P<0.05）。初次免疫后28 d，高剂量WCDCP/OVA组的血清IgG、IgG1和IgG2a抗体水平均高于OVA组（0.972 3±0.243 8比0.389 2±0.077 4，1.156 0±0.088 4比0.612 6±0.059 7，1.648 0±0.103 9比0.557 2±0.181 5），差异均具有统计学意义（ P<0.05， P<0.001， P<0.001）。高剂量WCDCP对刀豆蛋白A和脂多糖诱导的脾脏细胞增殖均具有明显的促进作用（ P<0.001， P<0.05）。高剂量WCDCP/OVA组小鼠脾脏中的CD3 +CD8 + T和CD3 +CD4 + T细胞比例明显高于OVA组[（10.83±0.44）%比（6.76 ± 0.58）%，（28.17 ± 1.67）%比（19.17±2.73）%]，差异均具有统计学意义（ P<0.01， P<0.05）。WCDCP对小鼠体质量（均 P>0.05）和生长无影响。 结论:WCDCP可增强OVA抗原的体液免疫反应和细胞免疫反应，且对小鼠生长无不良反应，是一种安全有效的候选疫苗佐剂。

目的:初步评价自主构建的结核多组分重组蛋白疫苗EPRHP014免疫原性和保护效果，为研制结核新疫苗、有效防控结核病提供科学基础。方法:选择结核分枝杆菌全长蛋白抗原3种（EsxH、Rv2628和HspX）和经表位预测和优化的表位优势蛋白抗原2种（nPPE18和nPstS1），共5种组分构建蛋白抗原组合物EPRHP014，包括融合表达纯化的多组分蛋白抗原（EPRHP014f）和分别表达纯化单个蛋白构成多组分混合蛋白抗原（EPRHP014m）。EPRHP014f和EPRHP014m分别辅以铝佐剂制备多组分蛋白疫苗，采用卡介苗（BCG）作对照。皮下注射免疫BALB/c小鼠后，采用ELISA法检测血清特异性抗体效价，采用ELISpot和Luminex技术检测多种细胞因子分泌情况，采用结核分枝杆菌体外生长抑制试验观察其免疫保护作用。结果采用 t检验或秩和检验进行统计分析。 结果:EPRHP014m和EPRHP014f免疫小鼠后均能诱导产生高效价的IgG抗体及其亚型IgG1和IgG2a，抗体效价与BCG免疫组小鼠差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014f组诱导产生的分泌IFN-γ和IL-4的斑点形成细胞（SFC）数量均高于EPRHP014m组和BCG组（ P<0.05），而EPRHP014m组和BCG组的IFN-γ和IL-4的SFC数量差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014m组诱导分泌的GM-CSF、IL-12p70均高于BCG组（ P<0.05），而IL-6和IL-10分泌水平与BCG组的差异无统计学意义（ P>0.05）；EPRHP014f组和BCG组的IL-6、IL-10、IL-12和GM-CSF分泌水平差异无统计学意义（ P>0.05）。EPRHP014m组、EPRHP014f组和BCG组具有明显的体外抑菌作用，差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:EPRHP014f和EPRHP014m免疫后均能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，且有较强的体外抑制结核分枝杆菌生长的能力，显示抗原组合物EPRHP014具有良好的结核疫苗研发和应用价值。

目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

目的:初步评价新型结核融合型多组分蛋白候选疫苗EPDPA015f和混合型多组分蛋白候选疫苗EPDPA015m的免疫原性和有效性，为研制结核疫苗提供新的抗原组合。方法:将构建和表达的EPDPA015f和EPDPA015m蛋白与铝佐剂混合，采用皮下多点的方式对6周龄BALB/c小鼠进行3次免疫，间隔为10 d，每次50 μg/只。末次免疫10 d后采集血液和脾脏样本。采用酶联免疫吸附试验、多重微球技术、酶联免疫斑点法检测血清抗体滴度、细胞因子分泌水平；采用体外结核分枝杆菌生长抑制试验检测小鼠脾细胞体外抑制结核分枝杆菌生长的能力。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 t检验。 结果:EPDPA015f和EPDPA015m均可诱导产生多种高水平的细胞因子和较高滴度的IgG抗体。与佐剂组相比，EPDPA015f组诱导产生Th1(IL-2、TNF-α、IFN-γ)、Th2(IL-4、IL-6、IL-10)、Th17(IL-17)型细胞因子及其他促炎细胞因子(GM-CSF、IL-12)的差异有统计学意义( P均<0.05)；EPDPA015f组诱导产生的IgG抗体滴度高达1∶4×10 6。体外结核分枝杆菌生长抑制试验结果显示，PBS组、佐剂组、EPDPA015f组和EPDPA015m组的菌落数(lgCFU)分别为3.46±0.11、3.51±0.06、2.98±0.09和3.19±0.08；其中EPDPA015f组的菌落数最少，与其他组比较差异均有统计学意义( P<0.001, P<0.001和 P<0.01)。 结论:EPDPA015f引起较为全面且高水平的细胞免疫和体液免疫应答，并表现出较优的体外分枝杆菌抑制能力，具有作为预防型疫苗或加强型疫苗的潜力。

目的:对比呼吸道合胞病毒(RSV)融合前F蛋白(PreF)和融合后F蛋白(PostF)的免疫原性差异。方法:通过SDS-PAGE及Western blot鉴定PreF和PostF的表达，使用Octet仪器检测F蛋白与特异性抗体的亲和力，用PreF和PostF免疫小鼠，检测免疫血清的结合抗体与中和抗体差异。结果:PreF经改造后以稳定的三聚体形式存在，与单抗D25、8897、AM14、Palivizumab以及Motavizumab均具有很高的亲和力，但PostF缺乏表位?构象，并呈现单体构象，与D25、8897、AM14并无明显结合。PreF和PostF免疫小鼠的研究发现，AS01佐剂比铝佐剂更能诱导出高滴度结合抗体和针对RSV Long株的中和抗体。PreF与PostF免疫后诱导的结合抗体与PreF的结合能力相当，PostF免疫后诱导的结合抗体与PostF的结合水平显著高于PreF。结论:PreF拥有更多的抗体结合表位，改造后稳定的PreF三聚体重组蛋白能够诱导更强的中和抗体。同时，AS01佐剂免疫效果优于铝佐剂。因此，基于PreF稳定的三聚体结构改造及佐剂的研发对于RSV疫苗的发展至关重要。

目的 探讨川芎嗪对铝致认知功能障碍大鼠学习记忆功能的影响及机制.方法 按随机数字表法将60只Wistar雄性大鼠分为空白对照组、模型组、低剂量川芎嗪组、高剂量川芎嗪组和吡拉西坦组,每组12只.空白对照组大鼠不做任何处理;模型组、低剂量川芎嗪组、高剂量川芎嗪组和吡拉西坦组大鼠首先使用100 mg·kg-1的三氯化铝溶液每日灌胃制备铝中毒模型;造模成功后,吡拉西坦组大鼠用吡拉西坦按400 mg·kg-1剂量灌胃,低剂量川芎嗪组和高剂量川芎嗪组大鼠分别给予100、200 mg·kg-1川芎嗪灌胃,空白对照组和模型组大鼠每日灌胃同体积的生理盐水;5组大鼠均每日灌胃1次,连续灌胃30 d.干预30 d后,应用Morris水迷宫实验评估各组大鼠的学习、记忆功能;待完成水迷宫实验后,应用200 g·L-1水合氯醛对大鼠实施麻醉后,迅速断头取脑组织,应用免疫组织化学染色法观察5组大鼠海马CA1区中电压依赖性钙通道α1E亚基(CACNA1E)、钙调蛋白(CALM)、脑源性神经营养因子(BDNF)表达情况,Western blot法检测5组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM和BDNF蛋白相对表达量,实时荧光定量聚合酶链反应检测5组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM和BDNF mRNA相对表达量.结果 Morris水迷宫实验第1天,模型组、吡拉西坦组、低剂量川芎嗪组和高剂量川芎嗪组大鼠的潜伏期显著高于空白对照组(P＜0.05);吡拉西坦组、低剂量川芎嗪组、高剂量川芎嗪组、模型组大鼠的潜伏期比较差异无统计学意义(P＞0.05).Morris水迷宫实验第3天,模型组、吡拉西坦组、低剂量川芎嗪组和高剂量川芎嗪组大鼠的潜伏期显著高于空白对照组,吡拉西坦组和高剂量川芎嗪组大鼠的潜伏期显著低于模型组和低剂量川芎嗪组(P＜0.05);低剂量川芎嗪组与模型组大鼠的潜伏期比较差异无统计学意义(P＞0.05).Morris水迷宫实验第5天,模型组、吡拉西坦组、低剂量川芎嗪组和高剂量川芎嗪组大鼠的潜伏期显著高于空白对照组,吡拉西坦组和高剂量川芎嗪组大鼠的潜伏期显著低于模型组和低剂量川芎嗪组(P＜0.05);低剂量川芎嗪组与模型组大鼠的潜伏期比较差异无统计学意义(P＞0.05).Morris水迷宫实验第3、5天,吡拉西坦组与高剂量川芎嗪组大鼠的潜伏期比较差异无统计学意义(P＞0.05).模型组、吡拉西坦组、低剂量川芎嗪组和高剂量川芎嗪组大鼠的穿越平台次数显著低于空白对照组,吡拉西坦组和高剂量川芎嗪组大鼠的穿越平台次数显著高于模型组和低剂量川芎嗪组(P＜0.05);低剂量川芎嗪组与模型组大鼠的穿越平台次数比较差异无统计学意义(P＞0.05);吡拉西坦组和高剂量川芎嗪组大鼠的穿越平台次数比较差异无统计学意义(P＞0.05).在显微镜下可见海马CA1区呈棕黄色的CACNA1E、CALM、BDNF阳性细胞表达.模型组、吡拉西坦组、低剂量川芎嗪组和高剂量川芎嗪组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM、BDNF蛋白表达强度显著低于空白对照组,吡拉西坦组和高剂量川芎嗪组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM、B DNF蛋白表达强度显著高于模型组和低剂量川芎嗪组(P＜0.05);低剂量川芎嗪组与模型组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM、BDNF蛋白表达强度比较差异无统计学意义(P＞0.05);吡拉西坦组与高剂量川芎嗪组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM、BDNF蛋白表达强度比较差异无统计学意义(P＞0.05).模型组、吡拉西坦组、低剂量川芎嗪组和高剂量川芎嗪组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM、BDNF蛋白和mRNA相对表达量显著低于空白对照组,吡拉西坦组和高剂量川芎嗪组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM、BDNF蛋白和mRNA相对表达量显著高于模型组和低剂量川芎嗪组(P＜0.05);低剂量川芎嗪组与模型组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM、BDNF蛋白和mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05);吡拉西坦组与高剂量川芎嗪组大鼠海马CA1区CACNA1E、CALM、BDNF蛋白和mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 川芎嗪对铝诱导的大鼠认知损伤有明显的保护作用,可显著提高大鼠的学习记忆功能,其机制可能与川芎嗪诱导大鼠脑内CANA1E、CALM及BDNF表达上调有关.

目的 探讨苏黄止咳胶囊中白花前胡甲素对咳嗽变异性哮喘(CVA)的影响.方法 将大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组(0.5 mg/kg)、苏黄止咳胶囊组(7 g/kg)和白花前胡甲素低、中、高剂量组(15、30、60 mg/kg),采用腹腔注射致敏剂(1 mg/mL卵清蛋白和 10 mg/mL氢氧化铝)和雾化吸入 1%卵清蛋白的方法构建CVA大鼠模型,第 14 天起灌胃给予相应剂量药物,给药 14d后,HE、Masson和PAS染色观察肺组织病理变化,血细胞分析仪检测大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞数,ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5、IL-13、MUC5AC水平.采用脂多糖(LPS)诱导建立RAW264.7 细胞炎症模型,分别以 4、8、16 μmol/L白花前胡甲素和 0.25 mg/mL苏黄止咳胶囊处理,Griess法检测细胞中NO水平,荧光显微镜下观察细胞中ROS表达.RT-qPCR法检测肺组织和细胞中 IL-6、IL-1β、COX-2、iNOS、PPAR-γ mRNA 表达,Western blot 法检测肺组织和细胞中 p-P65、P65、p-IκBα、IκBα、NLRP3、caspase-1(p20)、IL-1β蛋白表达.结果 体内实验结果表明,白花前胡甲素能减少CVA大鼠咳嗽次数(P＜0.01),延长咳嗽潜伏期(P＜0.05,P＜0.01),减少BALF中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数(P＜0.05,P＜0.01),降低BALF中IL-4、IL-5、IL-13、MUC5AC水平(P＜0.01)和肺组织中IL-6、IL-1β、COX-2、iNOS mRNA表达(P＜0.05,P＜0.01),降低 P65、IκBα 蛋白磷酸化及 NLRP3、caspase-1(p20)、IL-1β 蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01).体外实验结果表明,白花前胡甲素能抑制LPS诱导的RAW264.7 细胞中NO的释放,降低细胞中ROS水平(P＜0.01);降低细胞中IL-1β、COX-2、iNOS mRNA表达(P＜0.05,P＜0.01),升高PPAR-γ mRNA表达(P＜0.05),降低P65、IκBα蛋白磷酸化和NLRP3 蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01).结论 白花前胡甲素可能是通过抑制NF-κB信号通路活化并降低NLRP3 炎症小体的表达,发挥抗炎和止咳作用,从而改善咳嗽变异性哮喘,是苏黄止咳胶囊的主要止咳功效成分之一.

目的 原核可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,纯化后免疫小鼠,检测其免疫原性,为SARS-CoV-2候选疫苗的制备提供新的思路.方法 扩增SARS-CoV-2 RBD蛋白基因片段,酶切后与pNCMO2表达载体连接,构建重组表达质粒pNC-RBD.将重组原核表达质粒转化入短小芽孢杆菌感受态细胞,扩大培养并降温诱导蛋白表达.利用亲和层析纯化目的蛋白,经氢氧化铝佐剂吸附后经背部皮下免疫雌性BALB/c小鼠,以仅免疫铝佐剂为对照,每组10只.ELISA法检测体液免疫效果,体外增殖试验测定细胞免疫效果,ELISA法测定多种细胞因子的体外分泌,流式细胞术测定细胞分型.结果 重组表达质粒pNC-RBD经菌落PCR及测序证明构建正确.重组蛋白相对分子质量约22 000,可分泌表达.纯化后重组蛋白纯度达95％以上.免疫小鼠后血清结合抗体和中和抗体效价分别可达1∶10000和1∶750左右,均显著高于佐剂组(t分别为2.845和2.528,P均＜0.01);体外可刺激淋巴细胞增殖,并促进IL-1β及IFNγ的分泌;细胞分型试验结果表明促进了CD4+和CD8+T细胞淋巴细胞增殖.结论 成功可溶性表达了SARS-CoV-2 RBD蛋白,其免疫原性良好,为以RBD蛋白为基础研制SARS-CoV-2基因工程疫苗奠定了基础.