目的:探讨核小体装配蛋白1样1(NAP1L1)对鼻咽癌细胞增殖能力的影响及其机制。方法:选取2017年1月到2021年1月新乡市中心医院收集的60例鼻咽癌组织和癌旁组织作为研究对象，采用免疫组织化学分析癌旁组织和鼻咽癌组织NAP1L1蛋白表达水平。采用NAP1L1短发卡RNA(shRNA)慢病毒感染低分化鼻咽癌细胞SUNE-1，建立对照组和NAP1L1 KD组细胞系，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、克隆形成实验和体外移植瘤实验分析NAP1L1对鼻咽癌细胞增殖的影响。采用流式细胞术分析两组细胞周期水平；采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分析肿瘤组织和癌旁组织中周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)和细胞周期素D1(CCND1) mRNA和蛋白表达水平。组间计量数据比较采用 t检验。 结果:NAP1L1蛋白主要表达于细胞核中。定量结果显示，癌旁组织NAP1L1蛋白表达强度(31.64±7.01)明显低于鼻咽癌组织NAP1L1蛋白表达强度(91.80±15.18)，差异有统计学意义( t＝27.87， P<0.05)。对照组细胞48 h和72 h吸光度( A)值(1.08±0.08、1.89±0.11)明显高于NAP1L1 KD组细胞48 h和72 h A值(0.79±0.08、1.31±0.05)，差异有统计学意义( t＝6.328、11.570， P<0.05)。克隆形成实验结果显示，对照组细胞克隆形成数量(109.50±14.45)明显高于NAP1L1 KD组细胞克隆形成数量(66.33±7.69)，差异有统计学意义( t＝6.462， P<0.05)。接种30 d后对照组细胞在裸鼠成瘤体积和重量[(1 072.90±114.87) mm3、(4.96±0.52) g]显著高于NAP1L1 KD组细胞[(855.90±55.54) mm 3、(3.27±0.23) g]，差异有统计学意义( t＝5.387、9.425， P<0.05)对照组细胞G 0/G 1期比例[(55.03±3.09)%]明显低于NAP1L1 KD组细胞[(74.88±2.16)%]，差异有统计学意义( t＝12.890， P<0.05)。对照组细胞G 2/M期比例[(5.61±0.63)%]明显低于NAP1L1 KD组细胞[(14.01±1.03)%]，差异有统计学意义( t＝17.080， P<0.05)。对照组细胞S期比例[(30.27±1.79)%]明显高于NAP1L1 KD组细胞[(11.44±2.34)%]，差异有统计学意义( t＝15.650， P<0.05)。对照组细胞CDK4、CDK6和CCND1蛋白表达水平(1.23±0.06、1.03±0.09、0.88±0.05)明显高于NAP1L1 KD组细胞(0.41±0.07、0.60±0.05、0.30±0.05)，差异有统计学意义( t＝21.330、10.560、19.980， P<0.05)。 结论:NAP1L1在鼻咽癌组织中呈高表达，通过调节与肿瘤细胞周期相关蛋白的表达水平，调节细胞周期变化，进而影响肿瘤细胞恶性增殖的能力。

目的:探讨去泛素化酶22(USP22)在食管癌组织中表达水平，分析UPS22对食管癌细胞增殖、上皮-间充质转化、侵袭和转移的影响。方法:选取2021年1月到2022年1月河南省人民医院收治的67例食管癌组织和癌旁组织作为研究对象，采用组织化学分析食管癌和癌旁组织USP22表达水平。采用短发卡RNA(shRNA)技术在人食管癌细胞系SUNE-1中建立USP22敲降细胞系，并建立对照细胞系，分别命名为对照组和USP22 KD组。采用噻唑蓝(MTT)法检测两组细胞的增殖能力；采用蛋白质免疫印迹法检测两组细胞上皮-间充质转化能力；采用Transwell分析两组细胞的侵袭能力；采用异体移植瘤实验分析两组细胞的增殖和转移能力。组间比较采用 t检验。 结果:癌旁组织中USP22表达水平(1.73±0.77)明显低于食管癌组织中USP22蛋白表达水平(2.72±0.52)，差异有统计学意义( t＝8.694， P<0.05)。对照组细胞48 h吸光度值(2.02±0.12)明显高于USP22 KD组细胞(1.57±0.16)，差异有统计学意义( t＝6.031， P<0.05)。对照组细胞在裸鼠体内生长15 d后肿瘤体积(1 219.43±169.61)明显大于USP22 KD组细胞(911.71±146.17)，差异有统计学意义( t＝3.636， P<0.05)。USP22 KD组细胞上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平(1.39±0.14)明显高于对照组细胞(0.52±0.14)，差异有统计学意义( t＝11.531， P<0.05)；对照组细胞间质标志物波形蛋白(Vimentin)和Slug表达水平(1.22±0.11、1.16±0.13)明显高于USP22 KD组细胞(0.51±0.11、0.39±0.09)，差异有统计学意义( t＝12.010、13.171， P<0.05)。对照组细胞侵袭数量[(100.14±15.59)个]明显高于USP22 KD组细胞侵袭数量[(48.86±9.84)个]，差异有统计学意义( t＝7.359， P<0.05)。对照组细胞在裸鼠体内转移数量[(15.29±2.29)个]明显高于USP22 KD组细胞[(6.86±2.27)个]，差异有统计学意义( t＝6.921， P<0.05)。对照组细胞增强子结合蛋白4(AP4) mRNA表达水平(1.25±0.14)明显高于USP22 KD组细胞(0.40±0.13)，差异有统计学意义( t＝11.550， P<0.05)。 结论:USP22蛋白在食管癌组织中呈高表达，通过调节激活AP4转录水平，促进食管癌细胞上皮-间充质转化和转移等细胞生物学特性。

目的 探讨微小RNA-498(miR-498)过表达对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化(EMT)的影响及其机制.方法 体外传代培养人永生化鼻咽上皮细胞系NP69及人鼻咽癌细胞系CNE-2Z、CNE-1、HNE-1、SUNE-1,采用RT-qPCR法检测各细胞miR-498表达,选择miR-498表达最低的鼻咽癌细胞进行后续实验.取传3代、对数生长期、生长状态良好的鼻咽癌细胞,随机分为miR-498 mimics组和NC mimics组,分别转染miR-498 mimics、NC mimics.转染6 h更换新鲜培养基继续培养24 h,收集细胞.采用CCK-8法检测细胞增殖活性,采用平板克隆形成实验检测集落形成能力,采用Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移能力,采用Western blotting法检测EMT相关上皮型钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(Fibronectin)以及高迁移率族蛋白A2(HMGA2)表达.结果 CNE-1、HNE-1、CNE-2Z、SUNE-1细胞miR-498相对表达量均低于NP69细胞(P均<0.05).以CNE-2Z细胞miR-498相对表达量最低,故选择该细胞系进行后续实验.经验证,miR-498 mimics组miR-498相对表达量高于NC mimics组(P<0.05).miR-498 mimics组培养0、24、48、72 h细胞增殖活性均低于NC mimics组(P均<0.05);miR-498 mimics组集落形成能力以及细胞侵袭和迁移能力均低于NC mimics组(P均<0.05);miR-498 mimics组Vimentin、Fibronectin、HMGA2蛋白相对表达量均低于NC mimics组,E-cadherin蛋白相对表达量高于NC mimics组(P均<0.05).结论 鼻咽癌细胞miR-498低表达;miR-498过表达则能抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及EMT,其机制可能与靶向调控HMGA2表达有关.

目的:探讨白头翁皂苷 A对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响及分子机制.方法:体外培养人鼻咽上皮细胞 NP69 和鼻咽癌细胞系(HK-1、HONE1、CNE2、SUNE1、C666-1),实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测细胞中circ-0001742 表达水平;将C666-1 细胞分为 si-circ-0001742 组、si-NC组、对照组、白头翁皂苷 A-L、M、H 组、白头翁皂苷 A-H+pcDNA-circ-0001742 组;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell检测细胞迁移数,克隆形成实验检测细胞克隆数,蛋白质印迹法检测蛋白表达.结果:鼻咽癌细胞(HK-1、HONE1、CNE2、SUNE1、C666-1)中 circ-0001742 表达水平升高(均P<0.05).沉默 circ-0001742 后,C666-1 细胞增殖抑制率、细胞凋亡率以及活化的半胱天冬氨酸蛋白酶 3(Cleaved caspase-3)表达水平升高,C666-1 细胞迁移和克隆细胞数减少(均P<0.05).不同浓度白头翁皂苷 A处理后,C666-1 细胞增殖抑制率、细胞凋亡率以及 Cleaved caspase-3 表达水平升高,C666-1 细胞迁移和克隆细胞数减少,circ-0001742 表达水平降低,呈浓度依赖性(均P<0.05).circ-0001742 过表达可逆转白头翁皂苷 A对C666-1 细胞的抑制作用.结论:白头翁皂苷 A 通过下调 circ-0001742 抑制鼻咽癌C666-1 细胞恶性生物学行为.

目的 比较DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs+/+)和DNA-PKcs-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)X射线诱导γ H2AX焦点形成的定量分析,并对鼻咽癌SUNE-1细胞进行X射线致DNA DSB动态变化.方法 采用蛋白印迹检测DNA-PKcs蛋白表达情况,细胞免疫荧光检测X射线5 Gy诱导的γ H2AX焦点形成,通过ImageJ软件分析γ H2AX焦点形成数量的差异.结果 DNA-PKcs在DNA-PKcs-/-和DNA-PKcs+/+MEF细胞中分别表达缺失和正常.应用γ H2AX焦点/细胞和γ H2AX焦点/mm2分析方法动态分析X射线诱导的DNA-PKcs+/+、DNA-PKcs-/-MEF细胞和SUNE-1细胞DSB形成的总体趋势一致;照后0.5~1.0 h大量γ H2AX焦点形成,DNA-PKcs+/+MEF细胞于照后6.0 h完成修复,DNA-PKcs-/-MEF和SUNE-1细胞X射线后于照后24.0 h完成修复.γ H2AX焦点/细胞的峰值出现在照后1.0 h,γ H2AX焦点/mm2的峰值则出现在照后0.5 h.对于DNA-PKcs+/+和DNA-PKcs-/-MEF细胞,γ H2AX焦点/细胞在照后0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h的不同,而γ H2AX焦点/mm2在照后3.0、6.0、12.0 h不同.结论 利用细胞免疫荧光动态检测照后致γ H2AX焦点/细胞或γ H2AX焦点/mm2的分析方法为动态定量研究DSB损伤及修复提供了新的思路.

目的:探讨KISS1及其受体基因KISS1-R在ERK1/2磷酸化通路中调节鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的分子机制.方法:采用实时荧光定量PCR以及蛋白免疫印迹技术,检测KISS1、KISS1-R基因、黏着斑激酶(FAK)的表达;验证ERK1/2信号通路的磷酸化激活,EZR蛋白的表达与鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的关系.构建过表达KISS1及KISS1-R基因载体,通过划痕实验及Transwell实验分析过表达KISS1(SUNE-KISS1)及KISS1-R(SUNE-1R)基因对SUNE-1-5-8F鼻咽癌细胞系的迁移能力的影响.通过蛋白免疫印迹技术,检测在过表达KISS1及KISS1-R基因后,磷酸化FAK(p-FAK)和磷酸化ERK(p-ERK)以及EZR蛋白的表达水平.通过阻断ERK1/2通路的磷酸化激活,验证KISS1及KISS1-R基因对鼻咽癌细胞迁移能力的影响,以及对细胞转移相关蛋白p-FAK、EZR表达量的影响.最后,通过siRNA抑制KISS1基因表达,进一步验证KISS1基因对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的调控作用.结果:实时荧光定量PCR实验发现,KISS1基因在SUNE-1-6-10B细胞中表达量相对于SUNE-1-5-8F细胞中较高.蛋白免疫印迹分析发现,KISS1及KISS1-R的蛋白表达量,以及p-FAK的表达量与鼻咽癌细胞转移能力呈负相关;EZR与鼻咽癌细胞转移能力呈正相关关系.划痕及Transwell实验分析发现,过表达KISS1及KISS1-R基因均能够有效抑制SUNE-1-5-8F细胞的迁移和侵袭能力.蛋白免疫印迹分析发现,过表达KISS1及KISS1-R基因能增加p-FAK及p-ERK1/2的蛋白表达量,抑制EZR蛋白的表达.加入ERK1/2通路特异性的阻断剂PD98059后,由过表达KISS1及KISS1-R基因引起的细胞迁移和侵袭的抑制状态被阻断.同时,由过表达KISS1及KISS1-R引起的p-FAK与p-ERK1/2的上调,EZR的下调均被恢复.通过siRNA的干扰,抑制了KISS1基因表达,从而引起SUNE-1-5-8F细胞的迁移和侵袭能力的增加.结论:过表达KISS1基因可以显著抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力;同时,通过siRNA干扰KISS1基因的表达,能够增加鼻咽癌细胞的迁移能力.KISS1及KISS1-R基因通过磷酸化激活ERK1/2通路,进一步激活p-FAK并抑制EZR表达,从而抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力.

目的 探讨miR-135b-5p对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、转移的影响及其可能的机制.方法 使用Lipo-fectamine -2000将miR-135b-5p siRNA转染至SUNE-1细胞,并将NC siRNA转染至SUNE-1细胞中作为对照组.实时定量PCR检测NP69、CNE-1、SUNE-1、C666-1细胞系及鼻咽癌组织中miR-135b-5p及TIMP3的表达水平.双荧光素酶报告基因检测miR-135b-5p及TIMP3的调控关系,免疫蛋白印迹实验检测TIMP3蛋白的表达含量,CCK-8实验检验SUNE-1细胞的增殖能力,Transwell实验检验SUNE-1细胞的迁移及侵袭能力.miR-135b-5p的表达与鼻咽癌(NPC)患者的临床病理学参数之间的关联.结果 miR-135b-5p在CNE-1、SUNE-1、C666-1细胞系及鼻咽癌组织中表达含量均上升,并且在SUNE-1细胞系中其的表达水平最低;双荧光素酶报告基因结果显示:抑制miR-135b-5p表达可显著增高SUNE-1细胞中TIMP3的荧光素酶活性;抑制miR-135b-5p表达后,TIMP3蛋白的表达相应上调,同时削弱了SUNE-1细胞增殖、迁移、侵袭能力.同时收集整理NPC患者相关临床资料进行对比分析,结果发现miR-135b-5p的表达与NPC的病理分期相关以及淋巴结转移情况呈正相关.结论 抑制miR-135b-5p的表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并靶向上调TIMP3的表达.

目的 探索不同转移习性人鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞外泌体的表达情况,为进一步研究鼻咽癌的诊断和治疗新方法提供一定的理论基础.方法 在2018年5月-2019年6月期间,用Exosome提取试剂盒从SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69培养上清液分离出外泌体,使用透射电镜进行观察验证外泌体形态,BCA试剂盒测定外泌体蛋白的浓度,蛋白质印迹法(Westernblotting)法进行外泌体特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1的检测.结果 3种鼻咽癌细胞系和正常鼻咽上皮细胞上清液中均分离出泡状物,在透射电镜下呈椭圆形或者圆形的泡状物.SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69细胞系外泌体蛋白浓度分别为0.778、0.635、0.788、0.576 μg/μ.L;且所有细胞系来源的外泌体经检测均表达特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1.结论 3种鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞均产生外泌体.

目的 探讨长链非编码(Lnc)RNA NEAT1通过靶向调控miR-331对鼻咽癌细胞辐射敏感性的影响.方法 选取2018年1月至2019年1月手术切除鼻咽癌组织及对应的癌旁组织的患者48例样本,qRT-PCR检测Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌及相应的癌旁组织、不同的鼻咽癌细胞系中的表达情况;构建Lnc RNA NEAT1沉默细胞系SUNE-1-siNEAT1及阴性对照SUNE-1-siNC,并以SUNE-1作为空白对照;电离辐射后,采用MTT实验、Transwell、免疫荧光标记检测Lnc RNA NEAT1对SUNE-1细胞辐射敏感性、侵袭能力及DNA损伤修复的影响;使用生物信息学网站starBase预测NEAT1可互补结合的微小RNA(microRNA,miRNA),再经双荧光基因报告验证Lnc RNA NEAT1与miR-331的靶向关系.结果 qRT-PCR结果显示,鼻咽癌组织中Lnc RNA NEAT1的表达水平高于癌旁正常组织,且差异有统计学意义(P<0.05),Lnc RNA NEAT1在SUNE-1细胞中表达量最高,与其他细胞株相比差异均具有统计学意义(P<0.05);成功构建Lnc RNA NEAT1沉默细胞系后,与SUNE-1组和SUNE-1-siNC组相比,SUNE-1-siNEAT1组细胞辐射后OD492nm值明显下降,细胞侵袭数量明显减少,γH2AX荧光强度明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05),SUNE-1组与SUNE-1-siNC组相比,差异无统计学意义(P>0.05);starBase网站预测结果显示,Lnc RNA NEAT1与miR-331存在互补结合位点,双荧光基因报告结果显示Lnc RNA NEAT1与miR-331可靶向结合.qRT-PCR证实LncRNA NEAT1负向调控miR-331的表达.结论 lnc RNA NEAT1在鼻咽癌中呈高表达,沉默Lnc RNA NEAT1表达可能通过上调miR-331水平抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭能力,增加鼻咽癌细胞辐射敏感性.

目的:探讨Ig样结构域2黏附分子(adhesion molecule with Ig like domain 2,AMIGO2)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞增殖中的作用及其机制.方法:选用2017年9月至11月福建省肿瘤医院收集的10例NPC组织和10例正常鼻咽黏膜上皮组织标本,以及NPC细胞系CNE-1、CNE-2、SUNE-1、6-10B、C666-1和人永生化鼻咽黏膜上皮细胞株NP69,用qPCR法检测NPC组织和细胞中AMIGO2 mRNA的表达.构建慢病毒载体干扰AMIGO2表达,用qPCR法验证其干扰效率;用CCK-8法、克隆形成及流式细胞术检测干扰AMIGO2表达对NPC细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响,用Westem blotting检测干扰AMIGO2表达对NPC细胞增殖及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关标志蛋白表达的影响.结果:AMIGO2在NPC组织和CNE-2和SUNE-1细胞中高表达(均P＜0.01).慢病毒AMIGO2感染后,CNE-2和SUNE-1细胞的AMIGO2干扰效率均达50％以上.干扰AMIGO2表达,显著降低CNE-2和SUNE-1细胞增殖及克隆形成能力(均P＜0.01)、明显提高细胞的凋亡率(均P＜0.01);降低SUNE-1细胞中PI3K、AKT和mTOR磷酸化蛋白的表达水平(均P＜0.01)、下调survivin和PCNA蛋白的表达水平(均P＜0.01).结论:AMIGO2通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进NPC细胞增殖并抑制其凋亡,提示AMIGO2可能是NPC治疗的潜在靶点.