目的:探讨黏附侵袭性大肠埃希菌( E. coli)LF82菌株对UC小鼠肠道屏障结构和功能的影响。 方法:将24只清洁级C57BL/6小鼠分为菌株UC组、UC组和健康对照组，每组8只。采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠UC模型，造模前1周，给予菌株UC组小鼠1×10 9 CFU E． coli LF82菌株灌胃，使菌株定植。通过疾病活动指数(DAI)、结肠大体形态损伤评分、结肠黏膜损伤指数(CMDI)、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性、组织病理学表现等比较 E. coli LF82对UC小鼠结肠炎症的作用。通过透射电子显微镜和直接免疫荧光染色法观察3组小鼠结肠组织超微结构和细胞骨架F-肌动蛋白的变化，采用过碘酸希夫反应(PAS)染色和天狼星红染色评估结肠黏液分泌能力和纤维化程度。采用 t检验、最小显著差异法、重复测量方差分析和单因素方差分析进行统计学分析。 结果:菌株UC组小鼠造模第4、5、6、7天DAI评分均高于UC组[分别为(2.53±0.38)分比(2.01±0.53)分、(3.02±0.62)分比(2.67±0.24)分、(3.13±0.61)分比(2.20±0.24)分、(3.27±0.28)分比(2.20±0.69)分]，差异均有统计学意义( t＝3.37、2.25、9.56、10.24， P均<0.05)。菌株UC组小鼠结肠的大体形态损伤评分高于UC组[(6.17±1.94)分比(2.83±0.98)分]，差异有统计学意义( t＝－3.75， P<0.05)。菌株UC组小鼠CMDI和结肠黏膜MPO活性均高于UC组[(16.80±2.79)分比(11.80±3.11)分、(729.3±77.5) U/mg比(594.4±31.9) U/mg]，差异均有统计学意义( t＝－2.83；均值差值为134.82，95% CI 72.12～197.51； P均<0.05)。透射电子显微镜下结果显示，菌株 E. coli LF82可侵入小鼠肠上皮下，引起结肠组织进一步损伤，使结肠骨架蛋白F-肌动蛋白分布状况发生改变。PAS染色结果显示，菌株UC组和UC组PAS阳性细胞百分比低于健康对照组[(32.40±8.02)%、(41.90±8.99)%比(57.70±11.52)%]，差异有统计学意义( F＝17.63， P<0.01)，菌株UC组PAS阳性细胞百分比低于UC组，差异有统计学意义(均值差值为－9.50，95% CI －18.33～－0.67， P<0.05)。天狼星红染色结果显示，菌株UC组结肠黏膜绒毛上皮部分被破坏，胶原纤维增生严重；菌株UC组和UC组胶原纤维面积比高于健康对照组[(51.83±5.78)%、(37.11±5.59)%比(15.41±2.25)%]，差异有统计学意义( F＝86.72， P<0.01)；菌株UC组胶原纤维面积比高于UC组，差异有统计学意义(均值差值为14.83，95% CI 8.91～20.76， P<0.05)。 结论:E． coli LF82可加重DSS诱导的UC小鼠结肠炎症，导致结肠超微结构和细胞骨架发生改变，还可降低小鼠结肠黏液分泌能力，增加结肠组织纤维化程度。

目的 探讨ST3Gal合成的α2,3-唾液酸残基修饰对肠道致病菌黏附和侵袭肠上皮细胞的影响.方法 通过促分化技术获得分化的结肠上皮细胞株(HT-29-Gal),再通过腺病毒转染技术,获得ST3Gal过表达细胞株(ST3Gal/HT-29-Gal)和干扰细胞株(ST3Gal-sh/HT-29-Gal)及其对照细胞株(Ctr/HT-29-Gal),获得的上述细胞株与肠道致病菌(EPEC或EHEC O157∶H7)共孵育2 h后,通过荧光显微镜和琼脂糖克隆法计数黏附于上述细胞株表面的肠道致病菌数;获得的上述细胞株与肠道致病菌(EIEC)共培养2 h后,通过庆大霉素杀灭粘附于细胞表面的肠道致病菌,再采用琼脂糖克隆计数法计数侵袭入上述细胞株内的肠道致病菌数.最后通过细胞通透性(FD4)实验和跨膜电阻(TEER)实验评价ST3Gal对肠上皮细胞屏障功能的影响.结果 荧光显微镜和琼脂糖克隆法计数均显示,黏附于ST3Gal/HT-29-Gal细胞表面的肠道致病菌(EPEC或EHEC O157∶H7)数低于其对照细胞(P＜0.05或P＜0.01);侵袭入ST3Gal/HT-29-Gal细胞内肠道致病菌(EIEC)数高于其对照细胞(P＜0.01);ST3Gal/HT-29-Gal细胞TEER值低于其对照细胞(P＜0.01);ST3Gal/HT-29-Gal细胞通透性高于其对照细胞(P＜0.01);ST3Gal/HT-29-Gal细胞中MUC2的RNA和蛋白表达量均低于其对照细胞(P＜0.01),相反结果在ST3Gal-sh/HT-29-Gal细胞中被证实.结论 ST3Gal抑制肠道致病菌黏附于结肠上皮细胞表面,促进肠道致病菌侵袭入结肠上皮细胞内.

目的 分析女性尿路感染患者致病性大肠杆菌(UPEC)对阴道上皮细胞侵袭及作用机制.方法 选取2020年4月-2022年3月于浙江中医药大学滨江学院附属富阳第一医院就诊的女性尿路感染患者130例,另选取100例无感染患者作为对照,观察患者阴道大肠杆菌细菌负担.取患者阴道上皮细胞,使用透射电子显微镜(TEM)观察大肠杆菌对阴道上皮细胞侵袭情况,使用免疫荧光显微镜观察患者阴道大肠杆菌形态等,分析致病性大肠杆菌对阴道上皮细胞侵袭及作用机制.结果 以患者尿道大肠杆菌负担为参考,患者阴道细菌负担为(64.13±5.49)％;以患者阴道大肠杆菌总量为参考,其细菌黏附率为(61.27±4.95)、侵袭率为(30.13±2.65)％;感染组磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)相对表达量(2.24±0.58)、(4.78±1.72)及(2.95±1.74)显著高于对照组(1.83±0.41)、(4.15±1.51)及(2.16±1.66)蛋白相对表达量,差异均有统计学意义(t=5.275,P＜0.05;t=2.952,P＜0.05;t=3.504,P＜0.05),免疫荧光和扫描电子显微镜(SEM)检测结果显示,大肠杆菌的黏附和细胞内,大肠杆菌周围的膜内陷.用与四甲基罗丹明缀合的鬼笔环肽染色,结果显示UPEC黏附导致显著的肌动蛋白捆绑,特别是在细菌附近的表面.此外,阴道上皮细胞(VEC)内的细菌被肌动蛋白包围.结论 尿路感染患者致病性大肠杆菌会黏附并侵袭患者阴道上皮细胞,在尿路感染后其可从尿路横穿到阴道,它可能通过参与细胞外和细胞内环境而持续存在,其作用机制可能与影响患者PI3K/Akt/mTOR蛋白通路表达及1型菌毛介导拉链机制有关.

[目的]肠出血性大肠杆菌O157∶H7是世界范围内重要的动物源性致病菌之—,可感染人.Ⅰ型菌毛是多种致病性大肠杆菌(如肾盂肾炎型大肠杆菌等)可表达的一种黏附结构,与细菌吸附黏膜表面密切相关.然而,O157∶H7 fim操纵子上几个核苷酸的缺失却导致其不能表达Ⅰ型菌毛.BLAST比对结果表明O157∶H7独有的开放阅读框z3276编码的氨基酸序列与其他大肠杆菌Ⅰ型菌毛高度同源,这可能是对O157∶H7不能表达Ⅰ型菌毛的补偿机制,但确切功能尚不清楚.本文探究z3276基因的生物学功能.[方法]利用O157∶H7 86-24参考菌株构建z3276基因缺失株(△z3276),并构建其互补株(C△z3276),进而比较亲本株、△z3276与C△z3276的生物学特性及对小鼠致病性差异.[结果]与亲本株相比,△z3276进入对数生长期的时间延后,在半固体琼脂平板上的迁移直径明显缩小,生物被膜形成能力显著减弱.△z3276对HEp-2细胞的黏附和侵袭能力并无明显变化,但对IPEC-J2细胞的侵袭能力明显减弱.在小鼠攻毒试验中,△z3276组排菌数量减少、排菌持续时间缩短.C△z3276各项特性均能回复到与亲本株一致的水平.[结论]z3276基因可能是O157∶H7重要的毒力相关因子.

胰岛素受体酪氨酸激酶底物(IRTKS)是逆向-二重-两性蛋白-RVS超家族成员之一,广泛表达于机体各组织、细胞中.该蛋白能够促进肌动蛋白装配参与板状伪足的形成,并与多种肿瘤相关基因产物相互作用,抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭;IRTKS作为胰岛素受体适配器,参与调控IR-IRS1-PI3 K-AKT信号通路,最终实现对血糖水平的调节;IRTKS还可抑制抗RNA病毒免疫反应,并且与IRSp53共同调节正常的胚胎和胎盘发育;IRTKS在肠出血性大肠杆菌的致病机制中参与形成细菌定植的肌动蛋白底座,促进黏附/脱落损伤.

血脑屏障作为中枢神经系统最重要的屏障之一,是阻止病原菌入侵的关键.而细菌的黏附、侵袭可使血脑屏障的完整性被破坏,通透性增加.细菌性脑膜炎作为儿童中常见的中枢神经系统急性感染性疾病,其发生发展与血脑屏障的破坏密切相关,在脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、B型链球菌以及大肠杆菌K1等脑膜炎性病原菌中,已确定有多种毒力因子可通过其特殊的作用途径参与血脑屏障的破坏,进而引起细菌性脑膜炎的发生.

[目的]双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等.本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响.[方法]采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异.[结果]rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强.凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降.细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响.动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力.荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高.[结论]RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力.

目的 探讨原花青素对尿路致病性大肠杆菌(UPEC)黏附、侵袭膀胱上皮细胞的影响,并探讨其作用机制.方法 体外培养人膀胱上皮细胞T24,随机分为空白对照组、阴性对照组和原花青素组,阴性对照组和原花青素组分别加入等量DMSO和亚抑菌浓度的原花青素溶液.采用平板菌落计数法检测各组UPEC J96对膀胱上皮细胞T24的相对黏附率和相对侵袭率;采用RT-PCR法检测各组细胞表面整合素受体α3和β1 mRNA表达;采用流式细胞术检测各组纤维状肌动蛋白(F-Actin)相对荧光强度.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,原花青素组UPEC J96的相对黏附率和相对侵袭率均明显降低(P均＜0.01),T24细胞表面整合素受体α3、β1 mRNA相对表达量均明显下降(P均＜0.01).与空白对照组和阴性对照组比较,原花青素组无论是UPEC J96未感染细胞还是UPEC J96感染细胞,F-Actin相对荧光强度均明显降低(P均＜0.01).空白对照组与阴性对照组上述指标比较P均>0.05.结论 原花青素可抑制UPEC黏附、侵袭膀胱上皮细胞,其机制可能通过抑制膀胱上皮细胞表面整合素受体及F-Actin表达实现.

目的 探讨从克罗恩病患者肠黏膜分离出的1株黏附侵袭性大肠杆菌(adherent-invasive Escherichia coli,AIEC)对白细胞介素10基因敲除(IL-10 knockout,IL-10 KO)小鼠肠道炎症的影响.方法 将IL-10 KO小鼠和野生(WT)小鼠各分为3组.野生型组:对照组(WT+PBS)、普通大肠杆菌组(WT+K-12)、AIEC组(WT+AIEC);IL-10基因敲除模型组:对照组(KO+PBS)、普通大肠杆菌菌组(KO+K-12)、AIEC组(KO+AIEC),对各组小鼠灌胃2周,同时喂养4周后取各组小鼠结肠,行炎症评分,RT-PCR法检测TNF-α、IFN-γ和IL-12 mRNA的表达.结果 KO+AIEC组小鼠发生的肠道炎症最重,其炎症水平较其他KO组明显升高(P<0.05),其细胞因子mRNA表达水平,如TNF-α、IFN-γ、IL-12也较其他组明显升高(P<0.01).结论 AIEC能加重IL-10 KO小鼠结肠炎,使其与巨噬细胞和Th1细胞介导的相关炎症因子TNF-α、IFN-γ和IL-12水平上调.提示AIEC细菌感染是IBD发生肠炎的重要机制之一.

致病性大肠杆菌是引起动物泌尿系统感染的重要病原菌,本研究对泌尿生殖道感染出现潜血的大熊猫尿液中分离的一株致病性大肠杆菌(Escherichia coli CCHTP)进行全基因组测序,检测其中耐药基因和毒力因子的情况,同时对基因岛上耐药和毒力基因及其基因环境进行研究.研究发现,大肠杆菌CCHTP中存在多种类型的耐药基因,其中外排泵系统基因数量最多,包括mdfA、emrE和mdtN等介导多重耐药外排泵的基因.此外,该菌还携带166种毒力因子及563个相关毒力基因,其中属于黏附与侵袭类的毒力因子及相关基因数量最多.对19个基因岛分析发现,基因岛GIs011和GIs017中各有一段包含耐药和毒力基因的序列,两侧与可移动遗传元件(转座酶和插入序列)相连,这些结构可能介导耐药及毒力基因水平转移.本研究通过全基因组测序分析了大熊猫源致病性大肠杆菌中存在的耐药及毒力基因情况,对大熊猫相关疾病的科学治疗、合理用药有重要意义.